Summary
動脈瘤のエンドグラフト除外後の組織学的および生化学的な修正は、まだ不明である。我々は、マウス動脈瘤でエンドグラフト移植の新たなモデルを記述する。永続的な循環血液ストリームインタフェース、新しい血管内生体材料の評価の有無にかかわらず血栓分析を通して、このモデルでは、より良い血管内動脈瘤の除外病理生物学を理解するのに役立ちます。
Abstract
血管内動脈瘤の除外は、動脈瘤の破裂を防ぐための検証手法である。長期的な結果は、技術の制限と腹部大動脈瘤（AAA）病態の新たな側面を強調する。治療前と後のAAAの深い調査を可能にする、安価で再現性のない腹部大動脈瘤のエンドグラフト除外モデルはありません。我々はここに誘導するために、次にカバー冠動脈stentgraftとラットにおける腹部大動脈瘤を除外する方法について説明します。周知のエラスターゼ誘発されるAAAモデルは、まずマウス2に記載ラット、1990年1に報告された。エラスチン分解は、人間のAAAとのマッチング、腹壁内および内腔の血栓の炎症性浸潤を伴う大動脈の拡張につながる。小さなカバーstentgraftと血管内の除外は、その後、循環血液と動脈瘤の血栓との間に相互作用を除いて、実行されます。適切な排除とstentgraft開存です左頸動脈思っ血管造影によって安楽死の前に確認した。エラスターゼ拡散の部分的な制御は、それぞれの動物のために動脈瘤の形状が違う。それは容易stentgraft導入の動脈瘤の下方大動脈の適切な長さを可能にする動脈瘤を作成することは困難であり、十分な近位および遠位首内部漏れを防止する。故障の多くは、時にはそれがステッチに痛みや悩みで大動脈の涙につながるstentgraft導入、ポストオペアンプ大動脈血栓症内皮損傷につながることができます。 stentgraft移植前にラットにアスピリンを与えることは大出血することなく、故障率が減少します。時間をクランプすると、好中球、内皮と血小板を活性化し、生物学的解析を妨げる可能性があります。
Introduction
血管内のスキルは、1991年3パロディによる最初の血管内大動脈瘤修復（EVAR）以降に進んでいる、すべての腹部動脈瘤のほぼ半分になりましEVAR 4で扱われます。手術とは異なり、EVARは、全身血流から、それを除いて、血栓を残します。動脈瘤は、ヘモグロビンリッチ多層血栓、薄い媒体、およびfibrosedと外膜炎症によって特徴づけられる。動脈瘤の進行におけるタンパク質分解5の重要な役割は、30年前に実証されている6、7：動脈瘤嚢血栓が薄い大動脈壁、エラスチンの溶解、メディアにおける平滑筋細胞の低密度、および免疫の高いレベルに関連付けられています炎症外膜反応8,9。これらの変化は、タンパク質分解酵素活性は血栓ではなく、直接、大動脈壁における内で発生することを示唆している。
また、血栓の管層が凝集赤血球CEが豊富であるヘモグロビンを放出しLLS。それらは主に、フィブリン形成、血小板活性化およびトロンビン形成を誘発に関与している。最後に、血栓もフィブリン溶解と募集白血球、主に好中球に関与しているのt-PAとプラスミノゲン保持を、誘導する。これらは血流10に比べて血栓で12倍以上に重要です。彼らの存在は、マトリックスメタロタイプ8（MMP-8）、MMP-9およびエラスターゼ率が高いに関連付けられている：彼らは繊維状マトリックスの劣化につながる粒状セリンプロテアーゼとプロ酸化エージェントを解放し、最終的に大動脈壁破裂9,11 -13。
選択科目動脈瘤の介入は破裂を防ぐことを目指しています。 EVARは、動脈瘤壁と血栓の両方をそのまま残します。したがって、大動脈担保（腰動脈、下腸間膜動脈...）によって動脈瘤の血流は、エンドリーク名前が付けられ、血管内治療14,15の具体的な合併症である、時には破裂前夜につながっている低圧内部漏れのn。さらに、特定の患者では、動脈瘤の直径が16の増加がない。循環血液と動脈瘤壁の間の相互作用は、前述の内腔の血栓生物活性を維持しています。したがって、識別エンドリークせずに動脈瘤嚢の拡張として定義タイプVエンドリークは、動脈瘤の血栓内部酵素活性によって説明できる。
どちらも放射線イメージング（18FDG-PETスキャン、血小板活性化シンチグラフィー、鉄oxydeコントラストMRI17）も直接ヒトの大動脈瘤に対する血管内への影響を調査するために使用される末梢血サンプリング（MMP-9、血小板由来マイクロパーティクル、プラスミン/抗プラスミン複合体）生化学的経路を評価する。
我々の知識では、任意の再現性と安価な実験的動脈瘤除外動物モデルは存在しません。こちらは、前後の動脈瘤の除外生物学的および組織学的改変を探検することができます。
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Protocol
方法
プロトコルはビシャ-のDebre倫理委員会（N°2012-15/698-0074）によって承認されている。
エラスターゼ灌流モデルは、1990年1にAnidjarによって記載されている：腹部大動脈瘤、8〜9週、250〜300グラム熟成、雄Wistarラットにおいてエラスターゼ灌流により誘発される。二つ〜4週間後、再手術を施行し、直径3mmは、冠状動脈瘤がstentgraftを除外するために使用されて覆われている。遠位大動脈切開を通して挿入移植は、拡大されたビジョンの下に展開されます。二週間後、stentgraft開存性は犠牲前に左総頸動脈によって大動脈造影で確認されています。全体ステント大動脈と周囲の組織は、その後、収穫し、分析のために調整されています。
プロトコル
1。手順1：腹部大動脈瘤インダクション（0日目）
- イソフルランで動物を麻酔し、性能mは、腹腔内penthobarbital注射。 penthobarbitol 0.1 60ml/100gでは、動物の体重saline/100グラム0.1mlの中で希釈される。麻酔は、手続きのために十分である。
- 腹部を剃る、とアルコールで皮膚を洗浄してください。
- ブレードXypho恥骨皮膚切開を行います。その後腹膜腹部の筋肉層は、内臓を避けて、ハサミで開いています。スプレッダーを置き、動物の左側に湿布で腸を包む。
- それを引き裂くことなく、直接、大動脈上記後部腹膜を開きます。目標は、経済の解剖によって将来腸癒着を防ぐためです。
- 大動脈の原点に、一字で左腎静脈から腸骨分岐へのすべての担保を連結。大動脈は、腸や大静脈に付着されている場合は、第二の介入時の出血の危険性が高いがあり、これは多くの場合、ラットのために致命的である。
- LEF以下15ミリメートル、大動脈の周囲に二回4-0絹を渡すT腎静脈。それは完全に大動脈、約を解剖することが重要です。左腎静脈とギルバート近似クランプの挿入を可能にする腸骨分岐のすぐ近位下15ミリメートル。
- ただ左腎静脈下、および遠位だけ腸骨分岐上記近位大動脈をクランプした後、外膜を除去し、遠位クランプにできるだけ近限り小さく大動脈切開を行います。大動脈は慎重に生理食塩水と角張っカニューレとクランプ解除時血栓塞栓を避けるために洗浄し、残りのすべての血でフラッシュする必要があります。
- スムーズ大動脈内部熱テーパーポリエチレンチューブ（PE 10）を紹介し、大動脈周囲4-0絹（ステップ1.6で）渡すとチューブを固定し、圧力追放を避けるためにタイアップ。
- 大動脈の10〜さ13 mm長さ（近クランプからシルクまで）にエラスターゼを注入する。
- エラスターゼ溶液を注入725μlを、30分でスピード速度定数でdです。それは慎重にsに重要ですurvey注入：注入中、大動脈は通常直径140から150パーセントで展開する必要があります。
- 点滴の終わりに、カテーテルを取り外し、生理食塩水でエラスターゼをフラッシュし、絹をカットし、10-0 PROLENE約3ステッチで大動脈切開を閉じます。クランプを取り外します。遠その後近。ケアトランス大動脈縫合糸を避けるように注意する必要があります。少数の実践と大動脈切開の小さな長さを考慮し、大動脈血栓症は非常にまれです。
- 連続的な吸収性縫合糸、および中断の非吸収性縫合糸で皮膚と腹壁を閉じます。痛みを防ぐために、皮下にカルプロフェンの5 mg / kgを投与量を注入します。彼らのケージにラットを返し、標準ラット実験餌と水を広告libidumを与える。
2。ステップ2：冠動脈PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）カバードStentgraft（日15-30）と腹部大動脈瘤の除外
- 以前は操作に、水1Lにアスピリン1,000 mgのを希釈。毎日のWATERの摂取量は10〜12日60ml/100gでの/体重推定した。
- 前述のように麻酔した後、慎重に腹壁に付着潜在内臓を避け、再開腹を行う。動脈瘤は、少なくとも直接的なビジョンの下で測定された近位大動脈径と比較して、大動脈の50％の増加によって定義された。我々の経験に基づいて、成功率は大動脈バーストに主に起因する早期死亡、（未発表データ）を含め、90％で
- 大動脈分岐部にも近首に大動脈を解剖。動脈瘤は左腎静脈下数ミリを生じた場合、これは遠首とカテーテルを挿入するために遠位クランプの間に十分な長さを可能にし、大動脈を縫合。
Stentgraft長は動脈瘤の大きさに依存します。両方の近位端および遠位ネックは、少なくとも2ミリメートルによってカバーされるべきである。 - 近首ダブルループシルクをラップします。動脈瘤と、b上記近位大動脈クランプ左腎動脈をelow、および遠位大動脈分岐上。
- stentgraftを導入する際に大動脈壁を引き裂く回避するために、直前の大動脈切開の上に大きな大動脈切開を行います。血栓の整合性を維持するために大動脈を洗浄しないでください。近クランプ向かっstentgraftを押してください。クランプでを削除し、移植の進行を可能にするために絹の張力を制御します。 stentgraftの近位端、近位首に達しただけでなく、これは、近位クランプを除去した後に大量出血を防ぐことができますまで、stentgraft進行を可能にするために提供するカテーテルの周りに緊張を適応させる。バルーン送達カテーテルの近位端部は、腎動脈、腎動脈ではなく下方に配備しなければならないstentgraftを覆うことができる。
- 8気圧でインフレータ注射器を用いて直接視覚的な制御下stentgraftを展開します。絹を締めながら、バルーンを収縮し、バルーンシャフトを取り外します。
- Sを洗う生理食塩水でtentgraft。ただ動脈瘤の遠位部以下クランプ、および中断10-0 PROLENE縫合と密接大動脈を置きます。
- 傷口を閉じ、皮下カルプロフェンを注入し、動物が自分のケージに戻るまで放置します。標準的な実験餌と水を広告libidumを与える。
3。ステップ3：Stentgraft開存のコントロール（30日目）
stentgraft挿入後15日間は、移植片開存性を制御するために、動脈造影を行う
- 麻酔後、肘の切開を横断肘を実行します。左総頸動脈は、顎と舌下腺の下と胸骨乳筋肉の下に位置しています。長さ2cmの露出することをお勧めします。
- 4-0シルクと遠位動脈を連結。クランプ近後、逆行18Gカテーテルを挿入し、頸動脈の周囲二回渡され、縛ら4-0絹糸で固定します。十分な長さは、挿入を可能にし、カテーテルが確保される前面近クランプは削除されます。それは動脈2cmの公開するのは難しい場合は、チューブは、生理食塩水で満たされた後にクランプは、近位クランプを取り外しながら、近位にプッシュすることができます。
- 直接X線透視下でカテーテルを介してコントラストを注入。両方stentgraftの不適切な展開の可能性がありますエンドリークがないことを確認し、stentgraft開通性を確認するために、血管造影stentgraft制御を行う。担保血管の高い数字でも血栓stentgraftで十分な脚灌流を可能にするため、この手順は重要です。私たちは二重超音波検査を実行しようとしませんでした：私たちはstentgraft鉄骨構造はstentgraft開通やエンドリークの正しい評価を妨げることを仮定。
- 勧告18に従って瀉血によってラットを犠牲にし、動脈瘤は、stentgraft、血栓と大動脈壁は組織学的または生化学的研究のために収穫されます。
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Representative Results
動脈瘤は、その後、樹脂ブロックで固定するまで、生理食塩水、リン酸緩衝に、24時間の間に4％パラホルムアルデヒド溶液中で固定されています。私たちは、PTFE（ 図2）の周りに癒し増殖細胞を示す、HPS（ヘマトキシリンフロキシンサフラン）（ 図1）染色を使用しています。間葉系細胞は、その後、α-アクチン染色（ 図3）によって特徴付けられる。
図1。直径3mm覆わstentgraftによって除外後の動脈瘤のHPS着色。
図2。治癒過程を示す図1に拡大します。
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図3。治癒過程の組織学的特徴付け。間葉細胞はα-アクチン染色によって着色された茶色です。 PTFEは赤線でdelimitatedさ：X40、B：X20。
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Discussion
AAAの二つのモデルは、すでに私たちの研究室に記載されている：異種移植片19およびエラスターゼ誘発モデル1エラスターゼモデルが人間の大動脈瘤に最も類似しています。大円周管腔内血栓は、その後、血管内動脈瘤の修復によって除外されています。
エンドリークはEVAR 14,15の通常の合併症である。 AAA破裂ローエンドリークと、時には動脈瘤嚢の拡大16なしで記載されている：質問の多くは未解決のままです。エンドリークは、血液循環細胞と動脈瘤の血栓との間のインターフェースを維持し、EVAR後に非常に普通の合併症である。 V型エンドリークは、またendotensionという、わずか20自身によって動脈瘤の成長を説明することはできません。酵素活性は、この合併症の一部とすることができる。覆われており、明らかにstentgraftと動物実験法、：血栓と循環血液との間のインターフェースを維持するには、pathobiolを解明することが必要であるこれらの合併症のOGY。
実際には、唯一のカバーstentgraftsは我々のモデルで展開されている。研究の多くの方法が検討される予定されています、非カバーendograftsを注入流れdivertion材料をテストし、ポルフィロモナス·ジンジバリス注射21によって血栓活動を豊かに。大動脈瘤の血管内排除のこのモデルは、小動物に文献に最初に記述されている。我々は、それが22を改造除外瘤をより良く理解するための大きな助けになると信じています。動脈瘤stentgraftの除外は、既に大きな動物が、低再現性、実現するのは難しいし、時間がかかる4,5で公開されています。ラットエラスターゼ瘤モデルは、いくつかの練習で安価で実現可能であり、低死亡率23。
このモデルの主な制限は、血管閉塞の高周波であった。 possibによるstentgraft、または容易に血栓症になる大動脈、ル内膜stentgraft挿入と展開後stentgraft内部血栓中に負傷。注意深くstentgraft洗濯する大動脈をステッチ前本当に重要です。予防経口アスピリン投与は、かなり大幅に当たりと術後出血せず、血栓症率を減少させたプロトコルの最後に5日間、第2の動作の前に開始しました。
誘発血液元の姿を維持した化石植物をクランプする血小板、内皮細胞活性化因子および好中球24をアクティブにします。 30分後25、好中球および単球は既にクロールと順番に内皮の傷害を引き起こす通常の内皮に結合し、活性化される。経験豊富なオペレーターのため、合計15〜20分に期間範囲をクランプする。私たちは、血栓に虚血の影響を探求しませんでした。しかし、大動脈のクランプせずstentgraftをデプロイすることは不可能である。好中球と血小板の活性化は、全身の修正ですが、短い時間ハマグリを誘導限られたpingを実行し、防ぐために残念ながら不可能。それにもかかわらず、私たちは、これらの修正は、生物学的解析への影響は限定的を持つと信じています。すべてのモデルとその限界26、27を考えると、この一stentgraftsによってAAA除外した後の動物実験法を開くことが最初のものです。
最近の研究では、ヒトの28で血管内修復後に大幅な動脈瘤の成長率を示しています。血栓後退、仮説検証およびエンドグラフト材料評価のさまざまな段階の正確な分析は、このモデルに基づいて行うことができる。
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Disclosures
私は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者はStentgraftsの贈り物のためにクリスティンGuesdon（アボット）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Wistar rats | aged from 8 to 9 weeks. Weight range from 350 to 400 g | ||
| Instruments | |||
| Isoflurane anesthesic system | 4,5% at the beginning, then 2% | ||
| Penthobarbital | Ceva sante animale, Libourne, France | ||
| Dissection stereomicroscope | |||
| Steriles gloves | |||
| Microsurgical Steriles instruments | Moria, Antony, France | Needle holder, Forceps, Scissors,Gilbert approximator o 3 Micro clamps | |
| N °40 Silk string | |||
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon, Johnson Johnson, Auneau, France | ||
| Heat-tapered polyethylene tubing | PE 10 | ||
| Syringe infusion pump | |||
| Porcine pancreatic elastase | Sigma, St. Louis, Mo., USA | 550 μl of salin is mixed with 175 μl of elastase | |
| Indeflator | |||
| 9 to 16 mm length, 3 mm diameter coronary PTFE covered stentgraft | Abbott, Abbott Park, Illinois, USA | ||
| C-Arm –C 9800 | GE Medical Systems, Milwaukee, WI | ||
| Aspegic 1000 mg | Aspirin, Sanofi-Aventis, Paris, France | ||
| Reagent | |||
| Aerane isoflurane 100ML | Baxter | Aerane | |
| Penthobarbital | Centravet | 053pen203 | |
| Silk Suture 4-0 | Fine Science | 18020-40 | |
| Microsurgical steriles instruments | Moria | 9980-9983-9987-204/A-204/D-8148-4877A-4878A | |
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon | W2829 – NS2850 | |
| Heat tapered Polyethylene tubing : PE 10 | Bioseb | MRE-010 | |
| Infusion pump | World precision instrument | AL-1000 | |
| Porcine pancreatic elastase | Sigma | E1250-100MG | |
| Indeflator | Longreal | KY025 25 100 | |
| Aspegic 1000mg (Aspirin) | Sanofi-Aventis | 3400931898191 | |
| C-Arm –C 9800 | General electric. | OEC 9800 | |
| Stentgraft : Jostent | Abbott | 210CG1230 210CG1630 |
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References
- Anidjar, S., et al.
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J. Vis. Exp. (29), e1280 (2009).
- Parodi, J. C., Palmaz, J. C., Barone, H. D. Transfemoral intraluminal graft implantation for abdominal aortic aneurysms. Ann. Vasc. Surg. 5, 491-499 (1991).
- The Vascular Society of Great Britain and Ireland. The nationalvascular database report, 2009. Lees, T., Stansby, G. , (2012).
- Sakalihasan, N., Limet, R., Defawe, O. D.
- Busuttil, R. W., Abou-Zamzam, A. M., Machleder, H. I. Collagenase activity of the human aorta. A comparison of patients with and without abdominal aortic aneurysms. Arch. Surg. 115, 1373-1378 (1980).
- Michel, J. B. Contrasting outcomes of atheroma evolution: intimal accumulation versus medial destruction. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 1389-1392 (2001).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J. Vasc. Surg. 34, 291-299 (2001).
- Kazi, M., et al. Influence of intraluminal thrombus on structural and cellular composition of abdominal aortic aneurysm wall. J. Vasc. Surg. 38, 1283-1292 (2003).
- Kuijper, P. H., et al. Neutrophil adhesion to fibrinogen and fibrin under flow conditions is diminished by activation and L-selectin shedding. Blood. 89, 2131-2138 (1997).
- Touat, Z., et al. Renewal of mural thrombus releases plasma markers and is involved in aortic abdominal aneurysm evolution. Am. J. Pathol. 168, 1022-1030 (2006).
- Fontaine, V., et al. Role of leukocyte elastase in preventing cellular re-colonization of the mural thrombus. Am. J. Pathol. 164, 2077-2087 (2004).
- Sakalihasan, N., Delvenne, P., Nusgens, B. V., Limet, R., Lapiere, C. M. Activated forms of MMP2 and MMP9 in abdominal aortic aneurysms. J. Vasc. Surg. 24, 127-133 (1996).
- Alsac, J. M., et al. The significance of endoleaks in thoracic endovascular aneurysm repair. Ann. Vasc. Surg. 25, 345-351 (2011).
- Buth, J., Harris, P. L., van Marrewijk, C., Fransen, G. The significance and management of different types of endoleaks. Semin. Vasc. Surg. 16, 95-102 (2003).
- Fransen, G. A., et al. Rupture of infra-renal aortic aneurysm after endovascular repair: a series from EUROSTAR registry. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 487-493 (2003).
- van der Vaart, M. G., et al. Application of PET/SPECT imaging in vascular disease. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 35, 507-513 (2008).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Lab. Anim. 31, 1-32 (1997).
- Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. J. Vasc. Surg. 19, 446-456 (1994).
- Gawenda, M., Jaschke, G., Winter, S., Wassmer, G., Brunkwall, J. Endotension as a result of pressure transmission through the graft following endovascular aneurysm repair--an in vitro study. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 501-505 (2003).
- Delbosc, S., et al. Porphyromonas gingivalis Participates in Pathogenesis of Human Abdominal Aortic Aneurysm by Neutrophil Activation. Proof of Concept in Rats. PLoS One. 6, e18679 (2011).
- Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovasc Pathol. 20, 114-123 (2011).
- Yamaguchi, T., et al. Factors influencing mortality in the rat elastase-induced-aneurysm model. J. Surg. Res. 94, 81-83 (2000).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J. Exp. Med. 209, 819-835 (2012).
- Smith, P. D. Neutrophil activation and mediators of inflammation in chronic venous insufficiency. J. Vasc. Res. 36, Suppl 1. 24-36 (1999).
- Zaragoza, C., et al.
- Kuivaniemi, H., Elmore, J. R. Opportunities in abdominal aortic aneurysm research: epidemiology, genetics, and pathophysiology. Ann. Vasc. Surg. 26 (12), 862-870 (2012).
- Schanzer, A., et al. Predictors of abdominal aortic aneurysm sac enlargement after endovascular repair. Circulation. 123, 2848-2855 (2011).
