Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

संवर्धन और अनुरक्षण Published: September 14, 2013 doi: 10.3791/50787
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Summary

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम एक सख्त अवायुजीव है और एंटीबायोटिक जुड़े दस्त (एएडी) का कारण बनता है कि एक रोगजनक जीवाणु है. इधर, अलग, संवर्धन और सी. बनाए रखने के लिए तरीके बेलगाम वनस्पति कोशिकाओं और बीजाणुओं वर्णित हैं. इन तकनीकों में इष्टतम सी. के लिए उचित शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए नियमित रखरखाव की आवश्यकता है, जो एक anaerobic चैम्बर की जरूरत बेलगाम खेती.

Abstract

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम एंटीबायोटिक जुड़े दस्त (एएडी) के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है और एक महत्वपूर्ण nosocomial रोगज़नक़ है कि एक ग्राम पॉजिटिव, अवायवीय, sporogenic जीवाणु है. सी. बेलगाम को अलग करने और खेती के लिए बेहद मुश्किल है और वातावरण में ऑक्सीजन का भी निम्न स्तर को अत्यंत संवेदनशील है. इधर, सी. के लिए अलग तरीकों मल के नमूने से बेलगाम और बाद में संवर्धन सी. लंबी अवधि के भंडारण के लिए ग्लिसरॉल शेयरों की तैयारी के लिए बेलगाम प्रस्तुत कर रहे हैं. माइक्रोस्कोपी और जानवरों के अध्ययन सहित बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए प्रयोगशाला में बीजाणु शेयरों की तैयारी और गणना के लिए तकनीक भी वर्णित हैं. इन तकनीकों में इष्टतम सी. के लिए उचित शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए एक सुसंगत anaerobic वातावरण बनाए रखता है जो एक anaerobic कक्ष, जरूरत बेलगाम वृद्धि. हम सीए के बिना चैंबर के अंदर और बाहर सामग्री के हस्तांतरण के लिए प्रोटोकॉल प्रदानकुशल और लगातार सी. के लिए उपयुक्त anaerobic वातावरण बनाए रखने के लिए आवश्यक नियमित रखरखाव के लिए सुझावों के साथ महत्वपूर्ण ऑक्सीजन संदूषण का उपयोग बेलगाम खेती.

Introduction

क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम एक लाचार अवायुजीव और मनुष्यों और पशुओं की एक घातक जठरांत्र रोगज़नक़ है कि एक ग्राम पॉजिटिव, बीजाणु के गठन जीवाणु है. शुरू में नवजात शिशुओं 1, सी से मल के नमूने में पाया एक खानेवाला जीव के रूप में 1935 में वर्णित बेलगाम बाद में एंटीबायोटिक उपचार 2 के साथ जुड़े कृत्रिम कोलाइटिस की प्रेरणा का एजेंट होने का प्रदर्शन किया गया. सी. बेलगाम संक्रमण (CDI) आम तौर पर सी के लिए एक जगह बनाने, सामान्य colonic वनस्पतियों के विघटन में परिणाम है जो एंटीबायोटिक उपचार से पहले कर रहे हैं बेलगाम 2 फूलने के लिए. सी. बेलगाम fecal-मौखिक मार्ग के माध्यम से एक निष्क्रिय बीजाणु रूप में प्रसारित किया और बाद में कई विषाक्त पदार्थों को पैदा करने और गंभीर बीमारी और कोलाइटिस 3 पैदा करने में सक्षम वनस्पति कोशिकाओं के उत्पादन, जठरांत्र पथ के भीतर अंकुरित है. CDI अक्सर परंपरागत उपचार और इन में करने के लिए आग रोक रहे हैंfections अक्सर 4 आवर्तक रहे हैं. नतीजतन, CDI संयुक्त राज्य अमेरिका 5-7 में स्वास्थ्य देखभाल की लागत में करने के लिए 4800000000 $ के लिए जिम्मेदार हैं.

सी. बेलगाम वातावरण में ऑक्सीजन का भी निम्न स्तर के लिए बहुत संवेदनशील है. सी के लिए बेलगाम वातावरण में जारी रहती है और कुशलता से की मेजबानी के लिए मेजबान से प्रेषित किया, एक पाचन निष्क्रिय बीजाणु के गठन के महत्वपूर्ण 8 है. क्योंकि सी. की प्रयोगशाला रखरखाव और जोड़ - तोड़ बेलगाम इन तकनीकों का एक anaerobic कक्ष के उपयोग की जरूरत, एक नियंत्रित, anaerobic वातावरण की आवश्यकता है. अवायवीय कक्षों का इस्तेमाल बढ़ा वसूली और लाचार anaerobes 9-11 से अलगाव में हुई है, और एक anaerobic वातावरण में प्रदर्शन किया जा आणविक तकनीक के एक नंबर की अनुमति दी है.

सी. के अलावा बेलगाम, यहाँ वर्णित अवायवीय कक्ष का उपयोग और रखरखाव लागू कर रहे हैंइस तरह के अन्य Clostridial प्रजातियों (जैसे सी. perfringens), अन्य जठरांत्र प्रजातियों (जैसे Bacteroides प्रजातियों 12) और periodontal रोगजनकों (जैसे Peptostreptococcus प्रजातियों 13) के रूप में अन्य लाचार anaerobes को.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: सी. बेलगाम जठरांत्र रोग हो सकता है कि एक मानव और पशु रोगज़नक़ है. सी. जुड़े प्रयोगों बेलगाम उपयुक्त जैव सुरक्षा सावधानियों (बीएसएल 2) के साथ किया जाना चाहिए.

1. अवायवीय चैंबर उपयोग और रखरखाव

सी. बेलगाम एक सख्त अवायुजीव है और वातावरण में ऑक्सीजन की भी कम मात्रा के प्रति बेहद संवेदनशील है. इसलिए, एक नियंत्रित, anaerobic वातावरण इसके सफल हेरफेर के लिए आवश्यक है. एक anaerobic कक्ष (चित्रा 1 ए) के उपयोग के सी. के प्रभावी खेती के लिए सबसे अधिक स्थिर वातावरण और आदर्श स्थिति प्रदान करता है बेलगाम और अन्य anaerobic बैक्टीरिया 14. इधर, एक गैस मिश्रण (5% सीओ 2, 10% एच 2, 85% एन 2) युक्त वातावरण stably बनाए रखा जा सकता है.

महत्वपूर्ण ऑक्सीजन संदूषण के बिना चेंबर में किसी भी आइटम परिचय,एक airlock (चित्रा 1 बी) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस उपकरण में एक गैस इंटरचेंज के रूप में कार्य करता है और अर्द्ध मैन्युअल रूप से या मैन्युअली स्वचालित रूप से काम करता है. airlock के बाहर और anaerobic कक्ष के इंटीरियर के लिए अन्य प्रदान करने का उपयोग करने के लिए पहुँच प्रदान करने से एक: airlock दो दरवाजे हैं. मॉडल के आधार पर, airlock इस प्रकार एक अलग airlock की लागत की बचत, एक आसपास अवायवीय चैम्बर के लिए उपयोग की पेशकश कर सकते हैं, जो एक अतिरिक्त दरवाजा पड़ सकता है. सक्रिय रूप से चैंबर के अंदर या बाहर आइटम हिल, जब तक कि दोनों दरवाजे ऑक्सीजन संक्रमण से बचने के लिए हर समय बंद रहना चाहिए. airlock मोर्चे पर एक पर / स्विच बंद और चार बटन से युक्त एक पैनल के पास. गैस लाइनों और वैक्यूम पंप नली इकाई का पूर्ण मैनुअल ऑपरेशन के लिए स्विच स्थित हैं जहां पैनल के पास airlock, के पीछे में जुड़े हुए हैं. यह दो शुद्ध चक्र, नाइट्रोजन गैस का उपयोग (एन 2), उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है गैस मिश्रण (5% सीओ 2 के साथ आदान भरने से पहले, 10% एच 2, चेंबर में पेश ऑक्सीजन की मात्रा को कम करने के लिए 85% एन 2). यह भी में और इंटरचेंज से बाहर करने के लिए और आइटम ले जाने के लिए आवश्यक राशि का समय से अधिक समय के लिए खुले या तो दरवाजा छोड़ कर कभी नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है ध्यान से चैंबर के अंदर और बाहर आइटम हिलाने की आवृत्ति को कम करने के लिए प्रयोग की योजना है. विनायल अवायवीय कक्षों के लिए विभिन्न परिचालन प्रक्रियाओं नीचे दिए गए हैं. इन प्रोटोकॉल का पालन करने से पहले, इन चैम्बर के साथ प्रदान की निर्माता के निर्देशों के साथ संगत कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं.

  1. स्वत: मोड
    यह एक प्रोग्राम और अनुकूलन विधा है और airlock द्वारा पूरी तरह से किया जाता है. Airlock कार्यक्रम करने के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें. चेंबर में ठेठ प्रवेश के लिए एक सिफारिश कार्यक्रम बारीकी चाम भीतर बनाए रखा वातावरण से मेल खाती है कि एक गैस मिश्रण के साथ airlock refilling द्वारा पीछा नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर दो शुद्ध चक्र शामिलहिट. प्रत्येक वैक्यूम चक्र के दौरान, मानक कारखाने प्रक्रियाओं 20 पारा एक निर्वात खींच सुझाव है और 1 पारा को मिटाने.
    1. भीतरी airlock दरवाजा पूरी तरह से बंद हो गया है कि यह सुनिश्चित करें.
    2. बाहरी airlock दरवाजा खोलो.
    3. Airlock में आइटम जगह और बाहरी airlock दरवाजा बंद कर दें. तरल पदार्थ को शुरू करते हैं, तो कुशल गैस विनिमय सुनिश्चित करने के लिए आधे रास्ते टोपी खोलना. मुहरबंद संकुल और कंटेनरों से पहले चक्र शुरुआत के लिए खोला जाना चाहिए, ऐसा करने से refraining ताना और नुकसान plasticware और कंटेनर सकता है. बाँझपन बनाए रखने के लिए, केवल कुशल गैस विनिमय अनुमति देने के लिए पर्याप्त संकुल खुला.
    4. प्रारंभ बटन दबाएँ.
    5. Airlock कार्यक्रम के माध्यम से साइकिल गया है और प्रदर्शन पढ़ता रुको जब तक "अवायवीय."
    6. भीतरी airlock दरवाजा खोलो.
    7. चेंबर में आइटम ले जाएँ.
    8. भीतरी दरवाजे को बंद करें.
  2. अर्द्ध मैनुअल मोड
    इस विधा कक्ष के अंदर या बाहर आइटम ले जाते समय इस्तेमाल किया और जब आवश्यक है ग जा सकता हैकक्ष के भीतर गैस ycling आवश्यक है.
    1. भीतरी airlock दरवाजा पूरी तरह से बंद हो गया है कि यह सुनिश्चित करें.
    2. बाहरी airlock दरवाजा खोलो.
    3. Airlock में आइटम जगह और बाहरी airlock दरवाजा बंद कर दें. तरल पदार्थ को शुरू करते हैं, तो कुशल गैस विनिमय सुनिश्चित करने के लिए आधे रास्ते टोपी खोलना. ऐसे inoculating छोरों और 96 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में मुहरबंद संकुल, पिछले चक्र शुरुआत के लिए खोला जाना चाहिए.
    4. मेनू दबाएं.
    5. प्रेस शुरू. airlock प्रत्येक बटन के समारोह में प्रदर्शित करेगा और यह पूरा हो जाता है जब तक जवाब नहीं होगा:
      • ऊपर तीर: वैक्यूम पंप सक्रिय.
      • तीर नीचे: नाइट्रोजन (शुद्ध) गैस का प्रवाह शुरू की.
      • प्रारंभ: गैस मिश्रण प्रवाह आरंभ करता है.
      • मेनू: मूलभूत प्रदर्शन करने के लिए वापसी.
    6. प्रदर्शन 20 पारा पढ़ता है जब तक प्रेस "अप", airlock से गैस हटाने.
    7. प्रेस "नीचे," प्रदर्शन के कम से कम 1 पारा पढ़ता है जब तक, नाइट्रोजन के साथ airlock भरने. Ov न करेंershoot, इस रूप में अपनी अखंडता को प्रभावित कर सकता है, जो airlock भीतर सकारात्मक दबाव बनाएगा.
    8. एक अतिरिक्त शुद्ध चक्र प्रदर्शन करने के लिए चरण 6 और 7 दोहराएँ.
    9. प्रदर्शन जब तक प्रेस "ऊपर" 20 पारा पढ़ता है.
    10. प्रेस "शुरू", गैस मिश्रण के साथ आदान - प्रदान को भरने के प्रदर्शन कम से कम 1 पारा पढ़ता है जब तक.
    11. भीतरी airlock दरवाजा खोलो.
    12. चेंबर में आइटम ले जाएँ.
    13. भीतरी दरवाजे को बंद करें.
  3. मैनुअल मोड
    स्वचालित या अर्द्ध मैनुअल मोड में काम नहीं कर रहे हैं या airlock को कोई शक्ति नहीं है, जब भी इस विधा का उपयोग किया जा सकता है. Airlock पर है जब यह मोड से काम नहीं करता, इसलिए यह airlock भीतर दबाव तय कर पाना मुश्किल है. वैक्यूम खींच और गैस शुद्ध बार वैक्यूम और गैस प्रवाह दरों पर निर्भर है, क्रमशः, इंटरचेंज के भीतर एक दबाव नापने का यंत्र के उपयोग के दबाव पर नजर रखने और व्यक्तिगत चोट और airlock को नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक है.
    1. भीतरी airlock दरवाजा पूरी तरह से बंद हो गया है कि यह सुनिश्चित करें.
    2. बाहरी airlock दरवाजा खोलो.
    3. Airlock में दबाव गेज सहित आइटम, जगह और बाहरी airlock दरवाजा बंद कर दें. तरल पदार्थ को शुरू करते हैं, तो कुशल गैस विनिमय सुनिश्चित करने के लिए आधे रास्ते टोपी खोलना. ऐसे inoculating छोरों और 96 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में मुहरबंद संकुल, पिछले चक्र शुरुआत के लिए खोला जाना चाहिए.
    4. लेबल airlock की पीठ पर तीन स्विच जानें, "मैनुअल नियंत्रण स्विच." ये अलग - अलग लेबल रहते हैं:
      • वैक्यूम करने के लिए
      • नाइट्रोजन
      • गैस मिक्स
    5. दबाव नापने का यंत्र लगभग 20 पारा पढ़ता है जब तक टॉगल वैक्यूम करने के लिए स्विच फ्लिप.
    6. दबाव नापने का यंत्र लगभग 1 पारा पढ़ता है जब तक नाइट्रोजन टॉगल स्विच फ्लिप.
    7. दबाव नापने का यंत्र लगभग 20 पारा पढ़ता है जब तक टॉगल वैक्यूम करने के लिए स्विच फ्लिप.
    8. दबाव नापने का यंत्र लगभग 1 पारा पढ़ता है जब तक नाइट्रोजन टॉगल स्विच फ्लिप.
    9. दबाव नापने का यंत्र लगभग 20 पारा पढ़ता है जब तक टॉगल वैक्यूम करने के लिए स्विच फ्लिप.
    10. दबाव नापने का यंत्र लगभग 1 पारा पढ़ता है जब तक गैस मिक्स टॉगल स्विच फ्लिप.
    11. भीतरी airlock दरवाजा खोलो.
    12. चेंबर में आइटम ले जाएँ.
    13. भीतरी दरवाजे को बंद करें.

2. संवर्धन, गणना और भंडारण सी. मल के नमूने से बेलगाम

यह प्रक्रिया सी. ठीक करने के लिए डिज़ाइन किया गया है बेलगाम मल के नमूने से बीजाणुओं युक्त और बाद में ग्लिसरॉल शेयरों के रूप में लंबी अवधि के भंडारण में वनस्पति कोशिकाओं या बीजाणुओं के रूप में अलग - अलग कालोनियों को बनाए रखने. वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया सी. की संख्या गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे जानवरों के अध्ययन से) मल के नमूने में बेलगाम मौजूद. चुनिंदा और विभिन्न सी. के लिए समृद्ध बेलगाम, taurocholate-cefoxitin-साइक्लोसेरीन-फ्रुक्टोज अगर (TCCFA) सामान्य मल वनस्पति 15-16 के विकास को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Cefoxitin अधिक मोटे तौर पर सी. के अपवाद के साथ, ग्राम नकारात्मक और सकारात्मक दोनों जीवाणुओं के विकास को रोकता है, जबकि साइक्लोसेरीन, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए बैक्टीरियोस्टेटिक है बेलगाम और सबसे COCCI उपभेदों दर्ज करें. फ्रुक्टोज की किण्वन पीएच में कमी और पीले रंग के लिए लाल / नारंगी से एक बाद रंग परिवर्तन का परिणाम देगा के रूप में पीएच सूचक, तटस्थ लाल, मध्यम में शामिल किया जा सकता है. कुशलतापूर्वक सी. के बीजाणुओं को ठीक करने के लिए बेलगाम वनस्पति बैक्टीरिया के रूप में, पित्त नमक सोडियम taurocholate अंकुरण 17-18 प्रेरित किया जाता है. क्योंकि सी. बेलगाम सी. की दक्षता में वृद्धि हो सकती है, जो दूषित वनस्पतियों के विकास को सीमित करने, वनस्पति कोशिकाओं को कम या खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बीजाणुओं, शराब या नमूनों की गर्मी उपचार रूपों बेलगाम वसूली 19. जैसा कि ऊपर कहा, यह अवशिष्ट ऑक्सीजन को हटाने सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने के लिए पूर्व अवायवीय चैम्बर में कम से कम 1-2 घंटे के लिए सभी प्लेटें पूर्व कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. एयर dryiएनजी कक्ष में उपयोग करने के लिए पूर्व प्लेटें संक्षेपण कम कर सकते हैं. तरल माध्यम मात्रा और इस्तेमाल किया कंटेनर की सतह से हवा में अनुपात के आधार पर कम करने के लिए 24 घंटे की जरूरत हो सकती है.

शुरुआत से पहले, निम्न आइटम अवायवीय कक्ष में रखा जाना चाहिए:

  • स्टूल नमूना
  • बाँझ swabs
  • बाँझ inoculating छोरों
  • 1x पीबीएस (सामग्री देखें)
  • TCCFA प्लेट (सामग्री देखें)
  • BHIS (ब्रेन हार्ट आसव खमीर निकालने के साथ मध्यम) प्लेटें और शोरबा (सामग्री देखें)
  • 50% ग्लिसरॉल (निष्फल)
  • 10% एल सिस्टीन (निष्फल)
  • क्रायोजेनिक भंडारण शीशियों

* वैकल्पिक रूप से, अलग कालोनियों -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए 15% ग्लिसरॉल के साथ BHIS अगर प्लेटों पर फैल गया, और बाद में बंद scraped और BHIS तरल माध्यम में resuspended किया जा सकता है ** यह ग्राम धुंधला सी. की पहचान करने के लिए एक प्रभावी रणनीति नहीं है कि नोट करना महत्वपूर्ण है मल के नमूने 23 से सीधे बेलगाम सी. बेलगाम पहले मल में मौजूद अन्य वनस्पतियों से अलग किया जाना चाहिए.

  1. 1x पीबीएस (इस एरोबिक परिस्थितियों में किया जा सकता है) में मल का नमूना Resuspend, और मल का नमूना पूरी तरह से vortexing द्वारा 1x पीबीएस में resuspended है कि यह सुनिश्चित करें. सी. अगर गणना मल से बेलगाम, पूर्व 1x पीबीएस के अलावा मल का नमूना तौलना.
  2. मल के प्रति ग्राम कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के उचित अलगाव या गणना के लिए 1x पीबीएस में resuspended मल के नमूने के धारावाहिक dilutions बनाओ.
  3. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करना, TCCFA प्लेटों के लिए प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के 100 μl लागू होते हैं.
  4. बाँझ inoculating छोरों की एक श्रृंखला, लकीर अलग कालोनियों या समान रूप से कालोनियों की गणना के लिए TCCFA थाली की सतह पर लागू संस्कृति प्रसार के लिए लागू संस्कृति का उपयोग करना.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए anaerobically थाली सेते यह सी. का पता लगाने और पहचान संभव है 24 घंटा के भीतर बेलगाम कालोनियों पर आधारितकालोनियों 15 के फ्लैट, अनियमित, जमीन कांच उपस्थिति, और अधिक सटीक पहचान और गणना 48 घंटा के बाद हासिल की है हालांकि.
  6. बाँझ inoculating छोरों का प्रयोग, सी. होना दिखाई देते हैं कि किसी भी कालोनियों उपसंस्कृति 0.03% एल सिस्टीन 20 के साथ पूरक पूर्व कम BHIS अगर प्लेटों, पर बेलगाम. अलग कालोनियों प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए एक नया बाँझ inoculating पाश का उपयोग कर, quadrants में थाली पर एक व्यक्ति कॉलोनी, और लकीर उठाओ. वैकल्पिक रूप से, सी. गिनती प्रत्येक कमजोर पड़ने की बेलगाम कालोनियों (इस एरोबिक परिस्थितियों में किया जा सकता है), और मल का नमूना प्रति ग्राम इकाइयों के गठन कॉलोनी की संख्या की गणना.
  7. सी. की पुष्टि ग्राम धुंधला के माध्यम से बेलगाम पहचान. बाद ग्राम धुंधला हो जाना, सी. बेलगाम बैंगनी छड़ के रूप में दिखाई देगा और कुछ कोशिकाओं टर्मिनल endospores हो सकती है. विष बी सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन की पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) की पहचान की आगे की पुष्टि प्रदान कर सकता हैसी. के toxigenic उपभेदों बेलगाम 21 multilocus अनुक्रम टाइपिंग (MLST) पहचान और सी. के अज्ञात और nontoxigenic उपभेदों की सटीक टाइपिंग के लिए सफल है, जबकि 22 बेलगाम.
  8. सी. के एक शेयर को बनाए रखने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर बेलगाम, एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग BHIS अगर प्लेट से एक व्यक्ति, पृथक कॉलोनी लेने और तरल मध्यम 0.03% एल सिस्टीन के साथ पूरक पूर्व कम BHIS के 10 एमएल में कॉलोनी resuspend. *
  9. रात भर anaerobically संस्कृति परेशान हो जाता है 37 डिग्री सेल्सियस पर, या जब तक सेते हैं.
  10. 50% ग्लिसरॉल के 333 μl और सी. के 666 μl जोड़ें पृथक तनाव का एक 15% ग्लिसरॉल स्टॉक बनाने के लिए एक 1.8 एमएल क्रायोजेनिक ट्यूब को बेलगाम संस्कृति.
  11. कसकर क्रायोजेनिक ट्यूब टोपी, मिश्रण अच्छी तरह से और तुरंत लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में अवायवीय कक्ष और जगह से स्टॉक को हटा दें.

3. सी. संवर्धन बेलगाम

यह प्रक्रिया सी. की वसूली के लिए प्रदान करता है बेलगाम -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ग्लिसरॉल शेयरों से दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र वनस्पति कोशिकाओं को मार सकता है, क्योंकि यह हर समय जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक रखने के लिए महत्वपूर्ण है. हम सूखी बर्फ का वाष्पीकरण कक्ष के भीतर वातावरण को बदल सकते हैं के रूप में चैम्बर के अंदर और बाहर उपभेदों स्थानांतरित करने के लिए सूखी बर्फ के उपयोग की सिफारिश नहीं है. इसके बजाय, हम परिवहन के दौरान जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक रखने के लिए जमे हुए ठंडा रैक का उपयोग करना चाहिये. विभिन्न चयनात्मक और अंतर प्रयोजनों के लिए, तीन मीडिया सामान्यतः सी. संवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है बेलगाम. TCCFA, ऊपर चर्चा की, सी के लिए चयनात्मक है बेलगाम और सोडियम taurocholate होता है, एक उगने वाला. खमीर निकालने (BHIS) के साथ पूरक ब्रेन दिल आसव जीवों की एक विस्तृत विविधता (2A चित्रा) 24 के विकास के लिए अनुमति देता है, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया, समृद्ध, गैर चयनात्मक माध्यम है. अक्सर, एल cysteinई एक एजेंट को कम करने के रूप में 20 BHIS में जोड़ा जाता है. अंत में, मध्यम (चित्रा 2 बी) के लिए रक्त के अलावा TCCFA पर अधिक से अधिक कुशल sporulation के लिए अनुमति देता है और सी. द्वारा प्रदर्शित अनूठी हरे या षाट्रेज़ प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए प्रदान करता है बेलगाम लंबी लहर पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश 15 (चित्रा -2) के तहत. सी. संवर्धन जब बीजाणु शेयरों से बेलगाम, यह है कि सोडियम taurocholate अंकुरण सुनिश्चित करने के माध्यम से जोड़ा जाना चाहिए याद करने के लिए महत्वपूर्ण है.

शुरुआत से पहले, निम्न आइटम अवायवीय कक्ष में रखा जाना चाहिए:

  • जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक (रैक ठंडा करने में)
  • बाँझ inoculating छोरों
  • TCCFA या BHIS प्लेट (सामग्री देखें)
  • BHIS शोरबा (सामग्री देखें)
  • 50% ग्लिसरॉल (निष्फल)
  • क्रायोजेनिक भंडारण शीशियों
  1. सी. के जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक रखें -80 डिग्री सेल्सियस जनसंपर्क पर संग्रहित किया गया है कि एक ठंडा रैक में बेलगामविगलन को रोकने के लिए उपयोग करने के लिए आईओआर.
  2. अवायवीय चेंबर में सूखी बर्फ पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक लाओ.
  3. सड़न रोकनेवाला तकनीक और एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग, थाली में से एक वृत्त का चतुर्थ भाग में थाली और लकीर पर स्टॉक की एक छोटी राशि जगह है.
  4. थाली 90 ° घुमाएँ और एक नया बाँझ inoculating पाश का उपयोग, दूसरा वृत्त का चतुर्थ भाग के पार लकीर जारी है.
  5. व्यक्तिगत कालोनियों के अलगाव सुनिश्चित करने के लिए तीसरे और चौथे quadrants के लिए दोहराएँ.
  6. तुरंत अवायवीय कक्ष से जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक को निकालने और -80 डिग्री सेल्सियस पर लौटने
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर anaerobically रातोंरात थाली सेते व्यक्तिगत अलग कालोनियों रातोंरात वृद्धि के बाद मनाया जाना चाहिए.

4. सी. से सफ़ाई बीजाणु बेलगाम

Sporulation ऑक्सीजन युक्त वातावरण में जीवित रहने के लिए और रोग 8 के कुशल प्रसारण के लिए आवश्यक है, बीजाणु शेयरों की तैयारी ofte हैमाइक्रोस्कोपी और जानवरों के अध्ययन तक ही सीमित नहीं बहाव के अनुप्रयोगों, के लिए एन आवश्यक. यह बीजाणुओं की गणना की गिनती के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए पुनरावृत्ति की आवश्यकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बीजाणुओं अच्छी तरह से प्लास्टिक का पालन करने के बाद dilutions के बीच ऊपर और नीचे pipetting कई बार भी नुकसान कम कर देता है.

सी. के Sporulation बेलगाम अन्य sporogenic प्रजाति के रूप में के रूप में तेजी से या सजातीय नहीं है. , बीजाणु उत्पादन और वसूली का अनुकूलन करने sporulation मध्यम (एसएमसी) 17,25 या 70:30 मध्यम 26 या तो सिफारिश की है. विकास के 72 घंटे के बाद - (प्रति मिली लीटर 10 8 बीजाणुओं 10 7) आमतौर पर इस्तेमाल अन्य मीडिया कुशल sporulation 27 देखा जाता है से पहले विकास के 4-5 दिनों की आवश्यकता है जो BHIS,, और Clospore, बीजाणुओं की उच्च titers का उत्पादन एक तरल माध्यम है. अन्य प्रोटोकॉल बल्कि पीबीएस 20 1x से बर्फ के ठंडे पानी का उपयोग करें, लेकिन, एक isotonic समाधान का उपयोग एक दूसरे को और प्लास्टिक की सतहों से चिपके से बीजाणुओं को कम कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से,कुछ जांचकर्ताओं आगे पूरी तरह से वनस्पति कोशिकाओं और मलबे 29 को निकालने के लिए एक sucrose ढाल का उपयोग कर उनके बीजाणुओं शुद्ध.

शुरुआत से पहले, निम्न आइटम अवायवीय कक्ष में रखा जाना चाहिए:

  • बाँझ inoculating छोरों
  • BHIS, एसएमसी और / या 70:30 प्लेट (सामग्री देखें)
  • BHIS शोरबा (सामग्री देखें)
  • 1x पीबीएस, फिल्टर निष्फल (सामग्री देखें)
  1. संस्कृति पूर्व कम BHIS प्लेटों पर जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से उपभेदों और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात anaerobically सेते
  2. कई पूर्व कम एसएमसी या 70:30 प्लेटों पर Restreak और 24-48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर anaerobically सेते हैं. बीजाणु गठन चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पीछा किया जा सकता. बीजाणु चरण उज्ज्वल जबकि वनस्पति और मां कोशिकाओं चरण अंधेरा दिखाई देगा दिखाई देगा. * एक विकल्प के रूप में, बीजाणुओं strai के आधार पर मिली लीटर प्रति 10 5 -10 6 बीजाणुओं, जो पैदावार, 24-48 घंटे के बाद 70:30 तरल माध्यम से शुद्ध किया जा सकता हैn इस्तेमाल किया.
  3. एक बाँझ inoculating पाश का प्रयोग, प्लेटें परिमार्जन और 10 मिलीलीटर बाँझ 1x पीबीएस में कोशिकाओं resuspend.
  4. प्लेटों त्यागें और अवायवीय कक्ष से बीजाणु निलंबन हटा दें. 15 मिनट के लिए 3000 XG पर गोली कोशिकाओं. पूरी तरह से सेल गोली हर बार resuspending, 1x पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धोएं.
  5. वनस्पति और मां कोशिकाओं के सेल में सहायता करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
  6. किसी भी अवशिष्ट वनस्पति कोशिकाओं को मारने के लिए 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  7. मिली लीटर प्रति यूनिट (CFU) के गठन कॉलोनी निर्धारित करते हैं, क्रमानुसार + 0.1% सोडियम taurocholate BHIS पर प्रत्येक बीजाणु 1x पीबीएस में तैयारी और प्लेट पतला. कालोनियों की गणना से पहले 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए प्लेटें सेते हैं.
  8. बीजाणु लंबी अवधि के भंडारण के लिए कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर या तो 1x पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत हैं, यह कुशल अंकुरण को बहाल करने के लिए 15 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर बीजाणु तैयारी गरम करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सी. का एक उदाहरण BHIS और कोलंबिया अवायवीय भेड़ रक्त अगर मीडिया पर हो बेलगाम चित्रा 2 में देखा जा सकता है. सी. बेलगाम फ्लैट हैं और दोनों मीडिया पर स्पष्ट है जो एक जमीन कांच उपस्थिति के अधिकारी है कि अनियमित कालोनियों रूपों. इधर, सी. के एक इरिथ्रोमाइसिन के प्रति संवेदनशील नैदानिक ​​अलग बेलगाम, 630E 30, 37 डिग्री सेल्सियस (2A चित्रा) के 24 घंटे के लिए, BHIS अग्रवाल, एक समृद्ध, गैर चयनात्मक माध्यम पर उगाया जाता है. कोलंबिया अवायवीय भेड़ रक्त अगर पर कालोनियों सफेद प्रकाश (चित्रा 2 बी) के तहत BHIS पर हो उन लोगों के समान दिखाई देते हैं, लेकिन, इस माध्यम का उपयोग भी सी. द्वारा प्रदर्शित हरे या षाट्रेज़ प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए प्रदान करता है बेलगाम लंबी लहर पराबैंगनी तहत (यूवी) प्रकाश 15 (चित्रा -2). सी. TCCFA अगर पर बेलगाम कालोनियों BHIS अगर पर विकास के समान लग रही. क्योंकि TCCFA मध्यम, एक टिम में दो एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति की48 घंटा विकास की ई अवधि कालोनियों की गणना से पहले आवश्यक है.

चित्रा 1
चित्रा 1. विनीत प्रयोगशालाओं प्रकार सी विनायल कक्ष और उसके घटकों. (इंच x 32 के अंदर 42) एक समय में एक ही व्यक्ति के लिए कार्यस्थान प्रदान करता है जो (ए) एक विनीत प्रयोगशालाओं प्रकार सी विनायल चैंबर. यह circulates और हवा तपता है, और Stak और पाकिस्तान के बीच किसी भी ऑक्सीजन प्रदूषण को कम करने के लिए आवश्यक पैलेडियम उत्प्रेरक युक्त धारण एक उत्प्रेरक प्रशंसक बॉक्स (वापस बाएँ कोने) शामिल हैं. (बी) airlock एक इंटरचेंज के रूप में कार्य करता है और anaerobic वातावरण में महत्वपूर्ण ऑक्सीजन संदूषण रोकने देर में और चैंबर के बाहर सामग्री के हस्तांतरण के लिए एक तंत्र प्रदान करता है. एक airlock के बाहर और वें के इंटीरियर के लिए अन्य प्रदान करने का उपयोग करने के लिए पहुँच प्रदान: airlock दो दरवाजे है ई अवायवीय चैंबर. airlock प्रोग्राम है और चैम्बर में प्रवेश के लिए अनुकूलित चक्र के लिए अनुमति देता है. यह स्वत: अर्द्ध मैनुअल और मैनुअल मोड में प्रचलित है. (सी) संलग्न, लचीला लेटेक्स दस्ताने गति की पूरी रेंज की अनुमति और कक्ष के भीतर तक पहुँचने जो प्रदान की जाती हैं. दस्ताने चैंबर के anaerobic वातावरण में खलल न डालें बिना दस्ताने के प्रतिस्थापन की अनुमति, vinyl चिपकने के साथ vinyl आस्तीन से जुड़ी एक विशेष कफ के लिए सुरक्षित कर रहे हैं. Neoprene दस्ताने भी उपलब्ध हैं. (डी) मॉडल 10 गैस विश्लेषक लगातार ऑक्सीजन और कक्ष के भीतर वातावरण का एक तात्कालिक readout प्रदान करने हाइड्रोजन के स्तर दोनों पर नज़र रखता है. इस इकाई की अनुमति देता है एक दरार उत्पन्न होती है तो तत्काल सचेतक के लिए, एक गलत गैस मिश्रण का इस्तेमाल किया जाता है या अतिरिक्त समस्याओं श्रव्य अलार्म और एक चमकता एलईडी प्रकाश के माध्यम से उत्पन्न होती हैं.

ig2.jpg "/>
चित्रा 2. सी. की उपस्थिति विभिन्न मीडिया पर बेलगाम कालोनियों. विशेषता फ्लैट, अनियमित, जमीन कांच उपस्थिति सी. के एक इरिथ्रोमाइसिन के प्रति संवेदनशील नैदानिक ​​अलग से स्पष्ट है बेलगाम, 630E 30, 24 घंटा (ए) और 48 सफेद प्रकाश (बी) के तहत मानव संसाधन और लंबी लहर पराबैंगनी प्रकाश (सी) के लिए कोलंबिया अवायवीय भेड़ रक्त अगर के लिए BHIS अगर पर हो.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित विधियों सी. के सरल और जल्दी ठीक होने के लिए अनुमति मनुष्य, चूहों और hamsters, साथ ही सी. की लंबी अवधि के भंडारण सहित मल के नमूने की एक किस्म से बेलगाम ग्लिसरॉल या बीजाणु शेयरों के रूप में बेलगाम. सी. बेलगाम खेती करने के लिए एक मुश्किल जीव हो सकता है, लेकिन सावधान एक anaerobic वातावरण के रखरखाव और सड़न रोकनेवाला तकनीक के इस्तेमाल मजबूत विकास और प्रदूषण में कमी के लिए प्रदान कर सकते हैं.

अवायवीय कक्षों: विचार और रखरखाव

कठोर कक्षों या vinyl कक्षों: अवायवीय कक्षों के दो प्रकार के होते हैं. कठोर कक्षों आमतौर पर कास्टिक रसायनों के उपयोग की अनुमति, एल्यूमीनियम या एक कठोर बहुलक (जैसे Plexiglas या ऐक्रेलिक सामग्री) के बने होते हैं. कठोर कक्षों एक बेदस्ताना शैली को बदला है और छिद्र होने का खतरा कम किया जा सकता है, लेकिन, लीक का पता लगाने और मुश्किल से मिल रहे हैं और कठोर कक्ष में कुछ विधि की आवश्यकताप्रयोग के दौरान गैस विस्थापन के लिए क्षतिपूर्ति. बहुलक इकाइयों अक्सर संचालित करने के लिए अधिक खर्च कर सकते हैं, जो एक शुद्ध केवल airlock, से सुसज्जित हैं. कड़े वातावरण की स्थिति, लागत, लचीलापन, प्रयोगशाला अंतरिक्ष आवश्यकताओं और आसान रखरखाव के रखरखाव के लिए, vinyl अवायवीय कक्षों (विनीत प्रयोगशाला उत्पाद, चित्रा 1 ए) की सिफारिश की है. इस अवायवीय चैम्बर एक ट्यूबलर एल्युमीनियम संरचना द्वारा समर्थित है और लेटेक्स या neoprene दस्ताने का उपयोग कर, (चित्रा 1 बी) में और चैंबर के बाहर सामग्री के हस्तांतरण के लिए एक इंटरचेंज के रूप में कार्य करता है जो एक airlock से जुड़ा है कि एक vinyl दस्ताने बॉक्स के शामिल है vinyl आस्तीन (चित्रा 1C) से जुड़ी. यह ठीक अवायवीय चैंबर के उचित सेट अप के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह (चैंबर के आकार पर निर्भर करता है, या अधिक) एक पैलेडियम उत्प्रेरक के माध्यम से हवा परिसंचरण प्रदान जो हीटर बॉक्स इकाइयों तापमान नियंत्रित एक साथ हो सकता है. पैलेडियम सीएtalyst पानी में हाइड्रोजन और ऑक्सीजन में परिवर्तित करने से आदान - प्रदान के माध्यम से शुरू की ऑक्सीजन प्रदूषण को कम करने के लिए कार्य करता है. आदर्श रूप में, दोनों ऑक्सीजन और हाइड्रोजन का स्तर एक प्रतिशत के रूप में (पीपीएम) और हाइड्रोजन एकाग्रता मिलियन प्रति भागों में ऑक्सीजन एकाग्रता प्रदर्शित, एक गैस विश्लेषक (चित्रा -1) का उपयोग निगरानी कर रहे हैं.

तरल और ठोस मीडिया के उपयोग से पहले अवायवीय कक्ष में पूर्व कम किया जाना चाहिए. पेट्री डिश (व्यास में 100 मिमी) 31 उपयोग करने के लिए पहले ही दो घंटे तक कम किया जा सकता है, तथापि, तरल मीडिया रातोंरात कम किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण बात है, मीडिया airlock निकासी के दौरान तरल चमकती रोकने के लिए कक्ष में स्थानांतरित करने से पहले ठंडा किया जाना चाहिए. इस तरह के 96 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में प्लास्टिक उपभोग्य, प्लास्टिक झरझरा है, के रूप में उपयोग करने से पहले रात भर पूर्व कम किया जाना चाहिए और ऑक्सीजन के अणुओं में 32 स्टोर कर सकते हैं. आवेदन के आधार पर, कुछ प्लास्टिक का उपयोग 33 से पहले अप करने के लिए 48 घंटे के लिए पूर्व कम किया जाना चाहिए. Biohazard अपशिष्ट ख चाहिएई उचित निपटाया. एक छोटा सा biohazard बैग कक्ष के अंदर रखा जा सकता है, लेकिन अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.

इस सी का अच्छा विकास दोनों को सुनिश्चित करेगा के रूप में कम से कम 3% की एक हाइड्रोजन एकाग्रता, कक्ष के अंदर बनाए रखा जाना चाहिए बेलगाम और कुशल ऑक्सीजन हटाने. हाइड्रोजन एकाग्रता 3% से नीचे आ जाता है या चैम्बर कई दिनों के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया, तो एक कक्ष चक्र वांछनीय स्तर तक हाइड्रोजन एकाग्रता बहाल करने के लिए निष्पादित किया जाना चाहिए. इधर, चेंबर में गैस का लगभग एक तिहाई बाहर vacuumed (विनाइल बॉक्स काफी खंडन करना होगा) और ताजा गैस मिश्रण के साथ बदल रहा है. Airlock की शुरुआत से पहले अवायवीय है कि सुनिश्चित करें. चेंबर में बहुत अधिक गैस पंप इस vinyl बैग पर अनावश्यक तनाव स्थानों न केवल के रूप में बचा जाना चाहिए, लेकिन यह भी कक्ष के पीछे में पहुंचने से उपयोगकर्ता रोकना होगा. हमेशा एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में इस प्रक्रिया का प्रदर्शन. अतिरिक्त सावधानी बरतने अगर चाmber एक छोटे, खराब हवादार कमरे में रखा जाता है. कक्ष के अंदर गैस सामग्री उपयोगकर्ता गला घोंटना सकता है के रूप में कमरे में किसी भी दरवाजे खुले.

अतिरिक्त रखरखाव कक्ष के भीतर कुशल ऑक्सीजन हटाने को सुनिश्चित करने पैलेडियम उत्प्रेरक का उत्थान भी शामिल है. ऑक्सीजन और हाइड्रोजन उत्प्रेरक द्वारा कम कर रहे हैं, पानी समय पर अपनी क्षमता को कम करने, दुर्ग से ढके एल्यूमीनियम छर्रों की सतह पर जमा कर सकते हैं. इस पर काबू पाने के लिए, पैलेडियम उत्प्रेरक एक घंटे के लिए कम से कम 230 डिग्री सेल्सियस पाक द्वारा कम से कम सप्ताह में एक बार पुनर्जीवित किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, प्लेटें और मीडिया से ऑक्सीजन की कमी और पानी के वाष्पीकरण दोनों का एक परिणाम के रूप में, पानी संचय अवायवीय कक्षों के भीतर एक आम मुद्दा है. आरामदायक हेरफेर सुनिश्चित करने और कक्ष के भीतर उपकरण के आधे जीवन को बढ़ाने के लिए, Desiccant पैक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अक्सर पैलेडियम उत्प्रेरक के लिए इस्तेमाल एक ही प्रक्रिया के बाद बाहर सूख जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक डेhumidifier पानी condensates और एक कंटेनर में इकट्ठा किया जाता है कि एक धातु ब्लॉक के माध्यम से हवा circulates जो इस्तेमाल किया जा सकता है. डिवाइस पानी कंटेनर की बाढ़ से बचाता है, लेकिन, dehumidifiers निगरानी की जानी चाहिए और पूरा करने के लिए करीब जब कंटेनर खाली कर दिया जाना चाहिए. विनायल कक्ष को साफ करने के लिए, polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) के लिए सिफारिश की एक मुलायम कपड़े और किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्लीनर का उपयोग (जैसे प्लास्टिक जादू क्लीनर, हिस्सा नहीं. 1600480, विनीत प्रयोगशालाओं) की सलाह दी है. विनायल कक्ष scratching या हानिकारक से बचने के लिए, कागज तौलिये, किम पोंछे या कीटोन या पीवीसी नुकसान होगा कि अन्य यौगिकों से युक्त उत्पादों का उपयोग नहीं करते.

अंत में, सी. बेलगाम अत्यंत प्रतिक्रियाशील और संक्षारक है जो हाइड्रोजन सल्फाइड गैस (एच 2 एस), उत्पादन करता है. हाइड्रोजन सल्फाइड इंस्ट्रूमेंटेशन, पैलेडियम उत्प्रेरक और किसी भी उजागर धातुओं के लिए हानिकारक हो सकता है. यदि संभव हो तो, chamb में, इस तरह के homogenizers और स्पेक्ट्रो के रूप में, किसी भी इंस्ट्रूमेंटेशन मत छोड़ोएर बार की लंबी अवधि के लिए हाइड्रोजन सल्फाइड के कारण जंग से बचने के लिए. क्योंकि हाइड्रोजन सल्फाइड के उत्पादन की है, ऐसे पैलेडियम उत्प्रेरक और गैस विश्लेषक के रूप में आइटम समय समय पर नियमित रूप से चैम्बर रखरखाव के भाग के रूप में प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी. जैसे हाइड्रोजन सल्फाइड अवशोषित या रासायनिक निकालने के लिए सक्रिय लकड़ी का कोयला, नेतृत्व एसीटेट, चांदी क्लोराइड या चांदी सल्फेट का उपयोग कर के रूप में चैम्बर के भीतर हाइड्रोजन सल्फाइड के स्तर को कम करने के लिए विकल्प, 34 में वर्णित किया गया है और उपकरणों की जंग धीमा करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

अतिरिक्त सावधानियां

अन्य दरवाजा बंद कर दिया और ऑक्सीजन प्रदूषण को रोकने के लिए बंद कर दिया है कि यह सुनिश्चित करने के बिना airlock के लिए एक दरवाजा खुला कभी. इसके अतिरिक्त, विनायल puncturing के जोखिम को कम करने के लिए कक्ष के भीतर तेज वस्तुओं के उपयोग से बचें.

यह हाइड्रोजन ऑक्सीजन की उपस्थिति में एक ज्वलनशील गैस है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. आइटम को शुरू ध्यान रखना जब मैंचैम्बर Nto ऑक्सीजन संदूषण की है कि उच्च स्तर (अधिक से अधिक 999 पीपीएम) से नहीं होती है. यह एक नए गैस टैंक का उपयोग, खासकर जब केवल premixed न जालनेवाला अवायवीय गैस मिश्रण का उपयोग करें और बारीकी कक्ष के भीतर गैस विश्लेषक नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. 4% ऊपर दोनों हाइड्रोजन और ऑक्सीजन सांद्रता होते हैं, प्रयोगशाला के मानक संचालन प्रक्रिया (एसओपी) में उल्लिखित किया जाना चाहिए जो उचित आपात प्रक्रियाओं, पीछा कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं.

समस्या निवारण सी. बेलगाम वृद्धि

यदि सी. के गरीबों के विकास बेलगाम संस्कृतियों अमीर मध्यम में मनाया जाता है, इस कक्ष के भीतर सबसे अधिक बार ऑक्सीजन संदूषण की वजह से है. मध्यम करने के लिए एक एजेंट को कम करने (जैसे एल सिस्टीन या thioglycolate) के अलावा के विकास में सुधार हो सकता है, लेकिन, कक्ष के भीतर ऑक्सीजन संदूषण के मुद्दे को संबोधित करने की आवश्यकता होगी. जल्दी से एक एक गैस विश्लेषक का उपयोग कक्ष के भीतर ऑक्सीजन और हाइड्रोजन के स्तर सकते निगरानीLert प्रगति और उत्पादकता में कमी करने में विलंब से पहले उन समस्याओं के लिए उपयोगकर्ता होती है. ऑक्सीजन संदूषण होती है, तो जल्दी से (विनीत प्रयोगशालाओं से उपलब्ध है) एक गैस रिसाव डिटेक्टर के साथ स्रोत की पहचान करने की सलाह दी है. गैस रिसाव डिटेक्टर हाइड्रोकार्बन के स्तर में वृद्धि के साथ ही हाइड्रोजन के स्तर में वृद्धि की पहचान कर सकते हैं के बाद से एक दरार के स्थान खोजने में अवसर बढ़ाने के लिए, शराब में भिगो चीर कक्ष के भीतर रखा जा सकता है. रिसाव के स्रोत पाया जाता है एक बार, यह निर्माता के निर्देशों का पालन गोंद या सिलिकॉन का उपयोग कर ठीक किया जा सकता.

जीवों की संख्या में आसानी से अन्य आम Clostridial प्रजातियों (जैसे क्लोस्ट्रीडियम perfringens) और विकल्पी वातनिरपेक्षी, Escherichia कोलाई सहित anaerobic वातावरण में बढ़ता है. सड़न रोकनेवाला तकनीक और अन्य रणनीतियों के संक्रमण के जोखिम को कम कर सकते हैं. इस तरह के संभावित च को कम करने के लिए पहुंच के भीतर वस्तुओं को रखने के रूप में चैम्बर के भीतर उपयुक्त संगठन,या फैल और संचित biohazard कचरे की तत्काल हटाने, संदूषण जोखिम को कम कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, एक कमजोर ब्लीच समाधान के साथ घटा कागज तौलिये समय - समय सतहों और लेटेक्स या neoprene दस्ताने नीचे पोंछ चेंबर में लाया जा सकता है. यह सी. हत्या, इन वातावरण और ठोस और तरल मीडिया तर कर सकते हैं के रूप में लंबे समय के लिए कक्ष के अंदर ब्लीच या शराब समाधान नहीं छोड़ करने के लिए महत्वपूर्ण है बेलगाम, साथ ही विनायल 34 को नुकसान पहुँचाए. इसके अतिरिक्त, लेटेक्स या neoprene दस्ताने की नियमित प्रतिस्थापन भी संदूषण जोखिम को कम कर सकते हैं. जैसा कि ऊपर कहा, अगर अनिश्चित एक जीव सी. है अगर बेलगाम या एक contaminant, पीसीआर का उपयोग tdcB जीन की उपस्थिति के लिए एक परीक्षण जल्दी जीव सी है कि क्या निर्धारित कर सकते हैं 21 बेलगाम. एक ही अवायवीय कक्ष के भीतर कई जीवों की खेती अंत में, यदि यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि सी. बेलगाम (चयापचय byproducts उत्पादन कर सकते हैं ईठीक इसके विपरीत अन्य anaerobic जीवों के विकास और रोकना है. जी. हाइड्रोजन सल्फाइड).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हमारा अनुरोध है अवायवीय चैंबर के चित्र उपलब्ध कराने के लिए विनीत प्रयोगशालाओं को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान DK087763 (SMM) और एक कदम / HHMI पाठ्यक्रम विकास फैलोशिप (ANE) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 79 जेनेटिक्स बैक्टीरिया anaerobic ग्राम पॉजिटिव अन्तःबीज के गठन छड़ बीजाणु बैक्टीरियल ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का संक्रमण क्लोस्ट्रीडियम संक्रमण जीवाणु, ग्राम पॉजिटिव अवायवीय कक्ष बीजाणु संवर्धन रखरखाव सेल संस्कृति
संवर्धन और अनुरक्षण<em&gt; क्लोस्ट्रीडियम बेलगाम</em&gt; एक anaerobic वातावरण में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edwards, A. N., Suárez, J. M.,… More

Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter