Summary
Clostridium difficile sıkı anaerob ve antibiyotik ilişkili ishal (AAD) neden olan bir patojen bakteridir. Burada, izole edilmesi ve kültür C muhafaza edilmesi için yöntemler difficile bitkisel hücreleri ve sporlar açıklanmıştır. Bu teknikler optimum C için uygun koşulları sağlamak için düzenli bakım gerektirir, bir anaerobik odasını gerektiren difficile ekimi.
Abstract
Clostridium difficile antibiyotik ilişkili ishal (AAD) için öncelikle sorumlu ve önemli bir nozokomiyal patojen olan bir Gram-pozitif, anaerobik, sporogenic bakteridir. C. difficile izole etmek ve geliştirmek için çok zordur ve çevre oksijen düşük seviyelerde bile son derece duyarlıdır. Burada, C izole edilmesi için yöntemler dışkı örnekleri difficile ve daha sonra kültür C. , uzun süreli depolama için gliserol stoklarının hazırlanması için difficile sunulmaktadır. Mikroskopi ve hayvan çalışmaları dahil olmak üzere alt çeşitli uygulamalar için laboratuarda spor stoklarının hazırlanması ve numaralandırma için teknikler de tarif edilmiştir. Bu teknikler en iyi C için uygun koşulları temin etmek üzere tutarlı oksijensiz bir ortamın oksijensiz odası, gerektirecek difficile büyüme. Biz ca olmadan odasının içinde ve dışında malzeme aktarımı için protokolleri sağlamakverimli ve tutarlı C için uygun anaerobik ortam sürdürmek için gerekli düzenli bakım önerileriyle birlikte önemli oksijen kirlenmeyi kullanarak difficile ekimi.
Introduction
Clostridium difficile bir zorunlu anaerob ve insanlarda ve hayvanlarda bir potansiyel olarak ölümcül bir gastrointestinal patojen olan bir Gram-pozitif, spor oluşturucu bakteridir. Başlangıçta yenidoğanlarda 1, C. dışkısında bulunan bir ortakçı organizma olarak 1935 yılında açıklanan difficile daha sonra antibiyotik tedavisi ile ilişkili 2 psödomembranöz kolit neden olan ajan olduğu gösterilmiştir. C'yi difficile enfeksiyonları (CDI), genellikle C için bir niş oluşturmak, normal kolonik floranın bozulmasına sonuçları antibiyotik tedavisi ile takip edilir difficile 2 gelişmek için. C. difficile fekal-oral yolla bir atıl sporun olarak iletilir ve daha sonra çeşitli toksinleri üreten ve ciddi hastalık ve kolit 3 neden yeteneğine vejetatif hücreleri üreten, gastrointestinal sistem içinde filizlenir edilir. CDI, genellikle geleneksel tedavilere ve bu 'de refrakterFections sık sık 4. tekrarlamış edilir. Sonuç olarak, CDI Amerika Birleşik Devletleri 5-7 sağlık maliyetlerinde kadar 4800000000 $ sorumludur.
C. difficile ortamında oksijen düşük seviyelerde bile çok hassastır. C. için difficile ortamda hayatta kalmaya ve verimli bir konağa ana bulaşabilir, metabolik olarak aktif olmayan sporun oluşumu kritik 8'dir. Çünkü C laboratuvar bakım ve manipülasyon difficile Bu teknikler, bir anaerobik odanın kullanımını gerektiren, kontrollü, oksijensiz bir ortam gerektirir. Anaerobik bölmelerin kullanılması artan geri kazanım ve zorunlu anaeroblar 9-11 izolasyonu ile sonuçlandı ve anaerobik atmosferde gerçekleştirilebilir moleküler teknikler sağladı.
C ek olarak, difficile, burada açıklanan anaerobik odası kullanımı ve bakımı uygulanabilirBu diğer Clostridial türleri (örneğin, C. perfringens), diğer mide-bağırsak türler (örneğin, Bacteroides türleri, 12) ve periodontal patojenlere (örneğin, Peptostreptococcus türlerinin 13) gibi diğer zorunlu anaeroblar için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: C, difficile gastrointestinal hastalığa neden olabilir, insan ve hayvan patojendir. C ile ilgili deneyler difficile uygun biyogüvenlik önlemleri (BSL2) ile yapılmalıdır.
1.. Anaerobik Odası Kullanım ve Bakım
C. difficile sıkı bir anaerob ve atmosferdeki oksijenin düşük konsantrasyonlarda bile son derece duyarlıdır. Bu nedenle, kontrol, anaerobik ortam başarılı manipülasyon için gereklidir. Anaerobik odası (Şekil 1A) kullanılması C. etkili ekimi için en istikrarlı ortamı ve ideal koşulları sağlar difficile ve anaerobik bakteriler 14. Burada, bir gaz karışımı (% 5 CO2,% 10 H2,% 85 N-2) ihtiva eden bir atmosfer stabil bir şekilde muhafaza edilebilir.
Önemli bir oksijen kirlenme olmadan odacık içine bir ürün sunmak için,Bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanılmalıdır. Bu cihaz bir gaz alışverişi gibi fonksiyonları ve yarı-manuel veya otomatik olarak, el işleri. Hava kilidinin dışında ve anaerobik odasının iç kısmına erişim sağlayan diğer erişim sağlayan bir: hava kilidi iki kapı vardır. Modele bağlı olarak, hava kilidi ve böylece ayrı bir hava kilidinin maliyet tasarrufu, bitişik anaerobik odasına erişim sunabilir ek bir kapı olabilir. Aktif odasının içinde veya dışında öğeleri hareket sürece, hem kapılar oksijen kirlenmesini önlemek için her zaman kapalı kalmalıdır. Airlock önündeki bir açma / kapama düğmesi ve dört düğme içeren bir panel sahiptir. Gaz hatları ve vakum pompası hortumu biriminin tamamen manuel çalışması için anahtarları bulunan panelin yakınında hava kilidi, arkasına bağlanmıştır. Iki temizlik döngüleri, azot gazı kullanılarak (N2) altında, kullanılan önerilir gaz karışımı (% 5 CO 2 ile değişimi doldurmadan önce,% 10 H2, haznenin içine oksijen miktarını azaltmak için% 85 N2). Ayrıca, ve değişimi dışında ve öğeleri hareket ettirmek için gerekli olan miktarda daha uzun süre boyunca açık ya da kapı bırakmak hiç önemlidir dikkatli odasının içinde ve dışında öğeleri hareket sıklığını azaltmak için deneyler planlıyoruz. Vinil anaerobik odaları için farklı çalışma esasları aşağıda özetlenmiştir. Bu protokolleri takip etmeden önce, bu odacık ile donatılmıştır, üreticinin talimatlarına uygun olduğundan emin olun.
- Otomatik Mod
Bu programlanabilir ve özelleştirilebilir modu ve hava kabinine tarafından tamamen gerçekleştirilir. Airlock programlamak için, üreticinin yönergelerine bakın. Odasına tipik giriş için tavsiye programı yakından Cham içinde tutulan atmosfer eşleşen bir gaz karışımı ile hava kilidi dolum izledi azot gazı kullanılarak iki temizlik döngüleri gerektirirber. Her vakum döngüsü sırasında standart fabrika prosedürleri 20 inHg için bir vakum çekme önermek ve 1 inHg için temizleme.- Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
- Kabinin dış kapıyı açın.
- Hava kilidi içine öğeleri yerleştirmek ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Mühürlü paketler ve kaplar önce döngüsü başlamadan açılmalıdır; bunu yaparken kaçınıyor çözgü ve hasar plasticware ve kaplar olabilir. Sterilite sağlamak için, sadece etkili gaz değişimini sağlayacak kadar paketleri açın.
- Başlat düğmesine basın.
- Hava kilidi programı aracılığıyla sağlanıncaya ve gösterge okur kadar bekleyin "anaerobik."
- Iç hava kilidi kapıyı açın.
- Odasına taşıyın.
- Iç kapıyı kapatın.
- Yarı manuel mod
Bu mod odasının içinde veya dışında öğeleri geçerken kullanılan ve gerektiğinde c olabiliroda içindeki gazı ycling gereklidir.- Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
- Kabinin dış kapıyı açın.
- Hava kilidi içine öğeleri yerleştirmek ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Bu tür inoküle döngüler ve 96 oyuklu plakalar olarak kapatılmış ambalajların, önce döngüsü başlamadan açılmalıdır.
- Menü tuşuna basın.
- Başlat tuşuna basın. Airlock Her düğmenin işlevini gösterecektir ve bu tamamlanana kadar cevap vermez:
- Yukarı ok: Vakum pompası devreye sokar.
- Aşağı ok: azot (tasfiye) gaz akışı başlatır.
- Başlangıç: gaz karışımı akışını başlatır.
- Menüsü: Varsayılan ekrana dönmek.
- Ekran 20 İnHg okur kadar düğmesine "Up", hava kilidi gaz çıkarmak.
- Basın "Down" ekran az 1 İnHg okuyana kadar, azot ile hava kilidi dolduruyor. Ov etmeyinershoot, bu gibi kendi bütünlüğünü etkileyebilecek, hava kilidi içinde pozitif basınç yaratacaktır.
- Ek bir temizleme döngüsü gerçekleştirmek için 6. ve 7. adımları tekrarlayın.
- Ekranda kadar basın "Up" 20 İnHg okur.
- Basın "Başlat", gaz karışımı ile alışverişini doldurma ekranı daha az 1 İnHg okuyana kadar.
- Iç hava kilidi kapıyı açın.
- Odasına taşıyın.
- Iç kapıyı kapatın.
- Manuel Mod
Otomatik veya yarı-manuel mod çalışmıyor veya basınç kabinine hiçbir güç olduğunda bu mod kullanılabilir. Hava kilidi ile ilgili olduğunda bu modu çalışmaz, bu nedenle hava kilidi içindeki basıncı belirlemek zordur. Vakum çekme ve gaz boşaltma kere vakum ve gaz akış hızlarına bağlıdır olduğu için, sırası ile, içindeki değişimi, bir manometre kullanımı basıncını izlemek ve yaralanma ve hava kilidi zarar riskini azaltmak için gereklidir.- Iç hava kilidi kapı tamamen kapalı olduğundan emin olun.
- Kabinin dış kapıyı açın.
- Hava kilidi içine basınç göstergesi dahil öğeleri, koyun ve Kabinin dış kapıyı kapatın. Sıvılar tanıtan ise, verimli gaz alışverişini sağlamak için yarım kapaklarını sökün. Bu tür inoküle döngüler ve 96 oyuklu plakalar olarak kapatılmış ambalajların, önce döngüsü başlamadan açılmalıdır.
- Etiketli Hava kilidinin arkasındaki üç anahtarları bulun "Manuel Kontrol Cihazları." Bunlar ayrı ayrı etiketli olarak:
- Vakum için
- Azot
- Gaz Mix
- Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
- Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Azot geçiş anahtarını çevirin.
- Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
- Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Azot geçiş anahtarını çevirin.
- Basınç göstergesi yaklaşık 20 İnHg okur kadar durumlu vakum anahtarı çevirmek.
- Basınç göstergesi yaklaşık 1 İnHg okur kadar Gaz Mix geçiş anahtarı çevirmek.
- Iç hava kilidi kapıyı açın.
- Odasına taşıyın.
- Iç kapıyı kapatın.
2. Kültüre, numaralandırma ve Depolama C. Tabure Örneklerden difficile
Bu prosedür C kurtarmak için tasarlanmıştır difficile dışkı örnekleri sporlarını ihtiva eden ve daha sonra gliserol stoklan halinde, uzun süreli depolama bitkisel hücre veya sporlar halinde izole koloniler korumak. Alternatif olarak, bu prosedür C'ye sayısını saymak için kullanılabilir (örneğin, hayvan çalışmalarında) dışkı örneklerinde difficile mevcut. Seçici ve diferansiyel C için zenginleştirmek difficile, taurokolat-sefoksitin-sikloserin fruktoz agar (TCCFA), normal dışkı 15-16 bitki büyümesini inhibe etmek için kullanılır. Sefoksitin daha geniş C hariç olmak üzere, Gram-negatif ve pozitif hem bakteri büyümesini inhibe ederken, sikloserin, Gram-negatif bakteriler için bakteriyostatik difficile ve en kok suşları girin. Fruktoz fermantasyon pH düşüşü ve sarı, kırmızı / turuncu bir sonraki renk değişimi ile sonuçlanır gibi bir pH göstergesi, nötr kırmızı, ortam içine dahil edilebilir. Verimli C. sporları kurtarmak için difficile bitkisel bakteri olarak, safra tuzu sodyum taurokolat çimlenme 17-18 indüklemek için kullanılır. Çünkü C. C. difficile verimliliğini artırmak olabilir ki, kontamine bitki büyümesini sınırlayan, bitkisel hücreleri azaltmak veya ortadan kaldırmak için kullanılabilir sporlar, alkol veya numune ısıl işlem oluşturmaktadır difficile kurtarma 19. Yukarıda belirtildiği gibi, bu kalıntı oksijen kaldırılmasını sağlamak için kullanımdan önce, anaerobik odası içinde en az 1-2 saat boyunca tüm plakaları ön azaltmak için çok önemlidir. Hava drying odacık içinde kullanılmadan önce, plakalar yoğunlaşmayı azaltabilir. Sıvı ortam hacmi ve ikinci kabın yüzey-hava oranına bağlı olarak azaltmak için en fazla 24 saat gerekebilir.
Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:
- Dışkı örneği
- Steril bezlerden
- Steril aşılanması döngüler
- 1x PBS (Malzeme)
- TCCFA plakaları (Malzeme)
- BHIS (Brain Heart Infusion maya ekstresi ortamı) plakaları ve suyu (Malzeme)
- % 50 gliserol (sterilize edilmiş)
- % 10 L-sistein (sterilize edilmiş)
- Kriyojenik depolama şişeler
* Alternatif olarak, izole edilmiş koloniler -80 ° C de, uzun süreli depolama için% 15 gliserol ile BHIS agar plakaları üzerine yayılır ve daha sonra kazınır ve BHIS sıvı bir ortam içinde yeniden süspanse edilebilir ** Gram-boyama C. belirlemek için etkili bir strateji değildir dikkat etmek önemlidir dışkı örneklerinden 23 doğrudan difficile C difficile, ilk olarak dışkıda mevcut diğer bitki izole edilmelidir.
- 1x PBS (bu, aerobik şartlar altında gerçekleştirilebilir) 'de dışkı örnek tekrar ve tam olarak dışkı örneği vorteks ile 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş olduğundan emin olun. Eğer C'yi numaralandırma gaita difficile önce, 1x PBS eklenmesi için dışkı örneği tartın.
- Dışkı gramı başına koloni oluşturan birim (CFU) uygun izolasyon veya numaralandırma için 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş dışkı numunesinin bir seri seyreltmeleri yapın.
- Aseptik teknik kullanılarak, TCCFA plakalarına her bir seri seyreltme 100 ul geçerlidir.
- Steril bir aşılama döngüler, bir dizi çizgi izole edilmiş koloniler veya eşit kolonilerin sayımı için TCCFA levhasının yüzeyi üzerinde uygulanan kültür yaymak için uygulanan kültür kullanılması.
- 37 ° C'de 48 saat boyunca anaerobik olarak inkübe Bu, C tespit etmek ve belirlemek mümkündür 24 saat içinde difficile kolonileri dayalıkolonilerin 15 düz, düzensiz, buzlu cam görünümü, daha doğru tanımlama ve numaralandırma 48 saat sonra elde edilir rağmen.
- Steril bir aşılama döngü kullanarak, C gibi görünen herhangi bir koloni altkültürü % 0.03 L-sistein 20 ile takviye edilmiş, önceden indirgenmiş, BHIS agar plakaları üzerine difficile. Izole koloniler elde etmek için, her bir kadranda için yeni bir steril aşılama döngü kullanarak, kadranda plaka üzerine bireysel kolonisi ve çizgi seçin. Alternatif olarak, C sayısı Her bir seyreltme difficile kolonileri (bu aerobik koşullarda gerçekleştirilebilir) ve dışkı örneğinin gramı başına koloni oluşturma birimlerinin sayısını hesaplar.
- C'yi onaylamak Gram-boyama ile difficile tanımlanması. Mesai Gram boyama, C. difficile mor çubuklar olarak görünür ve bazı hücreler terminali endosporlar içerebilir. Toksin B kodlayan genlerin Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kimlik doğrulamaya sağlayabilirC. Toksijenik suşları difficile 21 multilokus dizisi yazarak (MLST) tanımlama ve C bilinmiyor ve nontoxigenic suşları doğru yazım için başarılı ise 22 difficile.
- C 'lik bir stok tutmak için -80 ° C'de difficile, steril bir aşılama döngü kullanılarak BHIS agar levhasından tek bir izole edilmiş koloni almak ve sıvı ortam,% 0.03 L-sistein ile takviye önceden indirgenmiş BHIS 10 ml koloni tekrar süspansiyon. *
- Gece boyunca anaerobik olarak kültürü bulanık hale, 37 ° C 'de, ya da kadar inkübe edin.
- % 50 gliserol, 333 ul ve 666 ul C ekleme İzole soyun,% 15 gliserol stoku oluşturmak için bir 1.8 ml kriyojenik tüpe difficile kültürü.
- Sıkıca kriyojenik tüp kap, iyice karıştırın ve hemen uzun süreli saklama için -80 ° C derin dondurucuda anaerobik odası ve yerden stok kaldırmak.
3. C Kültürleme difficile
Bu prosedür C'ye geri kazanımı sağlar difficile -80 ° C'de saklanan gliserol stoklarından Tekrarlanan donma-çözülme döngüleri vejetatif hücrelerini öldürebilir, çünkü o her zaman dondurulmuş gliserol stokları tutmak önemlidir. Bu kuru buz buharlaştırma odası içinde çevre değiştirmek gibi odacık içinde ve dışında suşları aktarımı için kuru buz kullanılmasını önerilmez. Bunun yerine, taşıma sırasında donmuş gliserol stokları tutmak için dondurulmuş soğutma rafları kullanmanızı öneririz. Çeşitli seçici ve farklı amaçlar için, üç media, genellikle C kültürlenmesi için kullanılan difficile. TCCFA, yukarıda ele alındığı gibi, C için seçicidir difficile ve sodyum tarokolat içeren bir filizlenen. Maya özü (BHIS) ile desteklenmiş beyin kalp infüzyon organizmaların geniş bir yelpazede (Şekil 2A) 24 büyümesine izin veren bir yaygın olarak kullanılan, zenginleştirilmiş ve seçici olmayan bir ortamdır. Sık sık, L-sisteine, bir indirgeme maddesi olarak 20 BHIS eklenir. Son olarak, ortam (Şekil 2B) kan eklenmesinin TCCFA üzerinde daha etkili sporlanma sağlar ve C tarafından sergilenen benzersiz yeşilimsi veya açık yeşil floresans algılama sağlar difficile uzun dalga ultraviyole (UV) ışık 15 (Şekil 2C) altında. C kültürlemek zaman spore stoktan difficile, bu sodyum taurokolat çimlenme sağlamak için ortama ilave edilmesi gereken hatırlamak önemlidir.
Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:
- Dondurulmuş gliserol stok (raf soğutma)
- Steril aşılanması döngüler
- TCCFA veya BHIS plakaları (Malzeme)
- BHIS suyu (Malzeme)
- % 50 gliserol (sterilize edilmiş)
- Kriyojenik depolama şişeler
- C donmuş gliserol stokları yerleştirin -80 ° C pr saklanmış bir soğutma rafa difficileçözülme önlemek için kullanmak mekanına.
- Anaerobik odasına kuru buz üzerinde donmuş gliserol stokları getirin.
- Aseptik teknik ve steril bir aşılama döngü kullanılarak, plakanın bir kadran arasında plaka ve şerit üzerine stokunun küçük bir miktar.
- Plakası 90 ° döndürmek ve yeni bir steril aşılama döngü kullanarak, ikinci çeyrek boyunca çizgi devam ediyor.
- Tek tek kolonilerin izole sağlamak için, üçüncü ve dördüncü çeyrek için tekrarlayın.
- Hemen anaerobik odasından donmuş gliserol stokları kaldırmak ve -80 ° C'ye geri
- 37 ° C de bir gece boyunca anaerobik olarak inkübe Bağımsız koloniler izole edilmiş, gece boyunca büyütüldükten sonra dikkate alınmalıdır.
4. C. saflaştırmak sporlar difficile
Sporülasyon oksijen açısından zengin ortamlarda hayatta kalma ve hastalık 8 etkin iletimi için gerekli olduğu gibi, spor stoklarının hazırlanması ofte olduğumikroskopi ve hayvan çalışmaları ile sınırlı değildir alt uygulamalar için gerekli olan n. Bu sporlar sıralandıran sayıları Tekrarlanabilirligin sağlamak tekrarı gerektirdiğini unutmayın önemlidir. Sporlar iyi plastik uymak beri seyreltilerde arasında yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez de kaybını azaltır.
C. Sporlanma difficile sporogenic diğer türler gibi hızlı veya homojen değildir. , Spor üretimi ve kurtarma optimize sporulasyon orta (SMC) 17,25 veya 70:30 orta 26 ya önerilir. Büyüme 72 saat sonra - (mililitre başına 10 8 sporlar 10 7) yaygın olarak kullanılan diğer ortam etkin bir sporülasyon 27 görülmektedir önce büyüme 4-5 gün gerektirir BHIS, ve Clospore, sporların yüksek titrelerini üreten bir sıvı ortam bulunmaktadır. Diğer protokoller yerine PBS 20 1x daha buz gibi soğuk su kullanmak, ancak, izotonik bir çözeltinin kullanımı birbirleriyle ve plastik yüzeylere yapışmasını sporlar azaltabilir. Seçenek olarak,Bazı araştırmacılar, ayrıca tamamen bitkisel hücreleri ve enkaz 29 kaldırmak için sukroz gradyan kullanılarak bunların sporlarının arındırmak.
Başlamadan önce, aşağıdaki öğeler anaerobik odasına konulmalıdır:
- Steril aşılanması döngüler
- BHIS, SMC ve / veya 70:30 plakaları (Malzeme)
- BHIS suyu (Malzeme)
- 1x PBS, filtre sterilize (Malzeme)
- Kültür önceden indirgenmiş BHIS plakalar üzerine dondurulmuş gliserol stokundan suşları ve 37 ° C de bir gece boyunca anaerobik olarak inkübe
- Birçok ön-indirgenmiş SMC ve 70:30 plakalar üzerine Restreak ve 24-48 saat boyunca 37 ° C'de anaerobik olarak inkübe edilir. Spor Oluşumu faz kontrast mikroskobu ile takip edilebilir. Sporlar faz parlak iken vejetatif ve anne hücreleri faz karanlık görünür görünecektir. * Bir alternatif olarak, sporlar Strai bağlı olarak, mililitre başına 10 5 -10 6 sporlar getirir ve burada, 24-48 saat sonra 70:30 sıvı ortam saflaştırılabilirn kullanılır.
- Steril bir aşılama döngü kullanarak, plakaları kazımak ve 10 ml steril 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon.
- Plakaları atın ve anaerobik odasından spor süspansiyonu çıkarın. 15 dakika boyunca 3000 x g'de Pelet hücreleri. Tam olarak hücre topağı, her zaman yeniden süspansiyona, 1 x PBS içinde hücreleri iki kez yıkayın.
- Bitkisel ve ana hücrelerin parçalanması yardımcı olmak için 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Herhangi bir artık bitkisel hücrelerini öldürmek için 20 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edilir.
- Mililitre başına birimler (CFU) oluşturan koloni belirlemek için, seri +% 0.1 sodyum taurokolat BHIS her bir spor 1x PBS içinde hazırlanmasını ve plaka seyreltin. Koloniler numaralandırma 24 saat önce en az inkübe edin.
- Sporlar, uzun süreli depolama boyunca oda sıcaklığında ya da 4 ° C ya da 1 x PBS içinde saklanabilir. 4 ° C'de saklanır, bu etkin çimlenme yeniden 15 dakika boyunca 55 ° C de spor hazırlık yeniden ısıtmak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. bir örneği BHIS ve Columbia anaerobik koyun kan agar ortamı üzerinde büyütülmüş difficile, Şekil 2'de görülebilir. C. difficile düz ve hem de medya üzerinde belirgin bir buzlu cam görünümü sahip düzensiz koloniler oluşturur. Burada, C'lik bir eritromisin duyarlı klinik izolat difficile, 630E 30, 37 ° C '(Şekil 2A), 24 saat boyunca, BHIS ağar, bir zenginleştirilmiş ve seçici olmayan ortam üzerinde yetiştirilir. Columbia anaerobik koyun kanı agar üzerinde koloniler beyaz ışık (Şekil 2B) BHIS altında yetiştirilen benzer görünür, ancak bu ortamın kullanımı da C. tarafından sergilenen yeşilimsi veya açık yeşil floresans algılama sağlar difficile uzun dalga ultraviyole altında (UV) ışık 15 (Şekil 2C). C. TCCFA agarda difficile kolonileri BHIS agar üzerinde büyüme benzer. Çünkü TCCFA ortamı, tim iki antibiyotik varlığı48 saat büyüme E dönem kolonileri numaralandırma önce gereklidir.
Şekil 1. Coy Laboratuvarları C Tipi vinil odası ve bileşenleri. (Inç x 32 inç 42) bir anda tek bir kişi için çalışma alanı sağlar (A) Coy Laboratories Tip C vinil odası. Bu dolaşır ve havayı ısıtır ve Stak-Pak herhangi bir oksijen kirlenmeyi azaltmak için gerekli paladyum katalizörü içeren tutan bir katalizör fan kutusu (arka sol köşe) içerir. (B) hava kilidi, bir değişim olarak hizmet verir ve anaerobik ortam içinde önemli bir oksijen kirlenmesini engellerken ve bölmenin dışında malzemelerin transferi için bir mekanizma sağlar. Bir hava kilidinin dış ve th iç diğer erişim sağlayan erişim sağlayan: airlock iki kapısı var e anaerobik odası. Hava kilidi programlanabilir ve bölmenin giriş için özel çevrimleri sağlar. Bu, otomatik yarı manuel ve manuel modda çalışabilir. (C) Ekli, esnek lateks eldiven hareket dizi izin ve odasının içinde ulaşmak hangi sağlanmaktadır. Eldiven bölmenin anaerobik ortam bozmadan eldiven yerine izin, vinil yapıştırıcı ile vinil kolları bağlanmış özel bir manşete tespit edilir. Neopren eldivenler de mevcuttur. (D) Model 10 Gaz Analiz Cihazı sürekli olarak oksijen ve oda içindeki atmosferin anlık bir okuma sağlayan hidrojen seviyelerini kontrol eder. Bu birim sağlayan bir sızıntı oluşursa derhal uyarıları için, yanlış bir gaz karışımı kullanılır ya da ek sorunlar sesli alarm ve yanıp sönen LED ışığı ile ortaya çıkar.
ig2.jpg "/>
Şekil 2. C. görünümü Çeşitli medya difficile kolonileri. karakteristik düz, düzensiz, buzlu cam görünümü C. eritromisin duyarlı klinik izolatı ile belirgindir difficile, 630E 30, 24 saat (A) ve 48 beyaz ışık (B) altında saat ve uzun dalga ultraviyole ışık (C) Columbia anaerobik koyun kanlı agar BHIS agar üzerinde büyüdü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemler, C, basit ve hızlı bir iyileşme sağlar insan, fare ve hamster, hem de C, uzun süreli depolama içeren dışkı örnekleri, çeşitli difficile gliserol veya spor hisse senetleri gibi difficile. C. difficile yetiştirmek için zor bir organizma olabilir, ancak dikkatli bir anaerobik ortam bakım ve aseptik tekniklerin uygulanması güçlü büyüme ve kirlenme bir azalma sağlayabilir.
Anaerobik odaları: Hususlar ve Bakım
Katı odaları veya vinil odaları: anaerobik bölmelerin iki türü vardır. Sert odalar genellikle kostik kimyasalların kullanımına izin veren, alüminyum ya da bükülmez bir polimer (örneğin, pleksiglas veya akrilik malzemeler) imal edilmiştir. Sert odaları bir gloveless stiline dönüştürülür ve delikler daha az eğilimli olabilir, ancak sızıntı tespit ve bulmak zor ve sert odaları için bazı yöntem gerektirirkullanım sırasında gaz deplasman telafi. Polimer birimleri genellikle çalıştırmak için daha pahalı olabilir, bir tasfiye sadece hava kilidi ile donatılmıştır. Sıkı atmosferik koşullar, maliyet, esneklik, laboratuvar alanı gereksinimleri ve kolay bakım bakımı için, vinil anaerobik odaları (Coy Laboratuvar Ürünleri, Şekil 1A) önerilir. Bu anaerob odacık boru şeklinde bir alüminyum yapı tarafından desteklenen ve lateks ya da neopren eldivenleri kullanılarak, (Şekil 1B) ve bölmenin dışında malzemelerin transferi için bir değişim olarak çalışır bir hava kilidi bağlı olan bir vinil eldiven kutusu oluşmaktadır vinil kollu (Şekil 1C) eklenmiş. Bu tam anaerobik odasının uygun set up için üreticinin talimatlarını takip etmek önemlidir. Bu (odasının boyutuna bağlı olarak, ya da daha fazla) bir paladyum katalizörü üzerinden hava dolaşımı sağlamak ısıtıcı kutu birimleri, sıcaklık kontrollü bir ile olabilir. Paladyum catalyst su içine hidrojen ve oksijen dönüştürerek değişimi yoluyla katılan, oksijen kirlenmeyi azaltmak için hizmet eder. İdeal olarak, her ikisi de oksijen ve hidrojen seviyelerinin yüzde olarak (ppm) ve hidrojen konsantrasyonu, milyon başına kısımlar olarak oksijen konsantrasyonunu gösteren, bir gaz analiz cihazı (Şekil 1D) kullanılarak izlenir.
Sıvı ve katı ortam kullanımından önce, anaerobik odası önceden azaltılmalıdır. Petri kapları (çapı 100 mm) 31, kullanımdan önce iki saat için azaltılabilir, ancak sıvı ortam gece boyunca azaltılmalıdır. Önemli bir şekilde, ortam hava kilidi tahliye esnasında sıvı yanıp önlemek için bölme içine transfer etmek için önce soğutulmalıdır. Bu, 96 oyuklu plakalar olarak plastik sarf, plastik gözenekli olduğu gibi, kullanım öncesi bir gece boyunca önceden azaltılmalıdır ve oksijen moleküllerine 32 depolayabilir. Uygulamaya bağlı olarak, bir plastik kullanılması önce 33 kadar, 48 saat boyunca ön-azaltılmalıdır. Biyolojik tehlikeli atık b gerekire uygun bertaraf. Küçük bir biyolojik tehlike torba odasının içinde tutulabilir, ancak sık sık değiştirilmesi gerekir.
Bu C arasında her ikisi de iyi bir büyüme sağlayacak şekilde en az% 3 bir hidrojen konsantrasyonu, haznenin iç muhafaza edilmelidir difficile ve verimli oksijen çıkarma. Hidrojen konsantrasyonu% 3 altına düşerse veya odası birkaç gün kullanılmadığında ise, bir odacık döngü istenen seviyelere hidrojen konsantrasyonunu geri idam edilmelidir. Burada, oda içindeki gazı yaklaşık üçte dışında vakumlu (vinil kutu önemli ölçüde düşürmek doyurmaya) ve taze gaz karışımı ile değiştirilir. Airlock başlamadan önce anaerobik olduğundan emin olun. Haznenin içine çok fazla gaz pompalama bu vinil torba üzerinde gereksiz stres yerlerde değil sadece, kaçınılmalıdır, ancak, aynı zamanda, odacığın arka kısmına ulaşmasını kullanıcıya engel olacaktır. Her zaman iyi havalandırılan bir alanda bu prosedürü gerçekleştirin. Ek önlemler alırsak chamber küçük, kötü havalandırılan bir odada tutulur. Odanın içinde gaz içeriği kullanıcıyı boğmak gibi oda için herhangi kapılarını açın.
Ek bakım bölmenin içinde etkin oksijen çıkarılmasının sağlanması için, bir paladyum katalizörü yeniden yaratılmasını kapsamaktadır. Oksijen ve hidrojen katalizörü ile indirgenir olarak su, zaman içinde verimliliği azaltan, paladyum kaplı alüminyum peletlerin yüzeyinde birikebilir. Bunun üstesinden gelmek için, paladyum katalizörleri arasında bir saat süre ile en az 230 ° C fırınlama ile en az haftada bir kez yeniden olmalıdır. Buna ek olarak, plaka ve medya oksijen azalması ve suyun buharlaşması her ikisinin bir sonucu olarak, su birikimi anaerobik odaları içinde ortak bir sorundur. Rahat manipülasyon sağlamak ve bölmenin içinde teçhizatın yarı-ömrünü arttırmak için, kurutucu paketleri kullanılabilir, fakat sıklıkla paladyum katalizörleri için kullanılan aynı prosedür izlenerek üzerinden kurutulmalıdır. Alternatif olarak, bir denemlendirici yoğunlaşan su ve bir konteynır içinde toplanır, bir metal blok içinden hava dolaşır ki kullanılabilir. Cihaz su kapları taşma önler, ancak nem gidericiler izlenmesi gerekir ve tam yakın zaman kaplar boşaltılması gerekir. Vinil odasını temizlemek için, polivinil klorür (PVC) için önerilen yumuşak bir bezle ve piyasada bulunan herhangi bir temizleyici kullanımı (örneğin Plastik Sihirli Temizleyici, parça no. 1600480, Coy Laboratories) tavsiye edilir. Vinil odasını çizilmemesi veya hasar görmesini önlemek için, kağıt havlu, Kim-mendil veya ketonların veya PVC zarar verecek diğer bileşikleri içeren ürünler kullanmayın.
Son olarak, C. difficile son derece reaktif ve korozif hidrojen sülfür gazı (H 2 S), üretir. Hidrojen sülfür enstrümantasyon, paladyum katalizör ve bir maruz metaller için zararlı olabilir. Mümkünse, odacıklı, bu tür homojenizatör ve spektrofotometreleri gibi, herhangi bir enstrümantasyon bırakmayıner kez uzun süre boyunca hidrojen sülfid neden korozyonu önlemek için. Çünkü hidrojen sülfit üretiminin, örneğin paladyum katalizörü ve gaz analiz cihazı gibi öğeleri düzenli aralıklarla oda bakım parçası olarak değiştirilmesi gerekir. Örneğin, hidrojen sülfit absorbe ya da kimyasal olarak ayrılması için, aktive edilmiş odun kömürü, kurşun asetat, gümüş klorid veya gümüş sülfat kullanılarak oda içinde hidrojen sülfit seviyelerini azaltmak için alternatifler, 34 tarif edilmiştir ve ekipmanın aşınmasına yavaşlatmak için kullanılabilir.
Ek Önlemler
Diğer kapı kapalı ve oksijen bulaşmayı önlemek için kilitli emin olmadan basınç kabinine bir kapıyı açmayın. Buna ek olarak, vinil delme riskini azaltmak için bölme içinde keskin öğeleri kullanmayın.
Bu hidrojen, oksijen varlığında bir yanıcı gaz olduğuna dikkat etmek önemlidir. Öğeleri tanıştırırken özen iodasının Nto oksijen kirlenme yüksek seviyeleri (fazla 999 ppm) meydana gelmez. Bu, yeni bir gaz tankı kullanırken özellikle, sadece premix yanmaz anaerobik gaz karışımı kullanmak ve yakından odasının içinde gaz analizörü izlemek için önemlidir. % 4 üzerinde hem de hidrojen ve oksijen konsantrasyonları meydana gelirse, laboratuvarın standart işletim prosedürleri (SOP) özetlenen olmalıdır, uygun acil durum prosedürleri, takip edildiğinden emin olun.
Sorun C. difficile büyüme
Eğer C zayıf büyüme difficile kültürleri açısından zengin bir ortam içinde görülmektedir, bu oda içinde en sık oksijen kirlenme kaynaklanmaktadır. Orta bir indirgeyici madde (örneğin, L-sistein veya tioglikolat) ilavesi gelişimini artırmak olabilir, ancak, bu uygulama oda içinde oksijen kontaminasyon sorunu ele alınması gerekir. Hızlı bir şekilde bir gaz analiz cihazı kullanılarak oda içinde, oksijen ve hidrojen seviyeleri, izlemelert ilerleme ve verimlilik azalması bir gecikme önce sorunları kullanıcı oluşur. Oksijen bulaşması halinde, hızlı (Coy Laboratories) bir gaz kaçak detektörü ile kaynağını tespit tavsiye edilir. Gaz kaçak dedektörü hidrokarbonların artmış düzeyleri yanı sıra hidrojenin yüksek seviyelerini belirlemek beri bir kaçağın yerini bulmak şansını arttırmak için, alkole batırılmış bir bez odasının içinde yerleştirilebilir. Sızıntının kaynağı bulundu sonra, üreticinin talimatlarına yapıştırıcı veya silikon kullanarak tamir edilebilir.
Organizma bir dizi kolayca diğer yaygın Clostridial türler (örneğin, Clostridium perfringens) ve fakültatif anaerob, Escherichia coli de dahil olmak üzere anaerobik ortamlarda yetişir. Aseptik teknik ve diğer stratejiler kontaminasyon riskini azaltabilir. Bu tür potansiyel f azaltmak için ulaşılabilecek ürün yerleştirme gibi odasının içinde uygun organizasyon,veya dökülen ve birikmiş biyolojik tehlikeli atık derhal kaldırılması, kirlenme riskleri azaltabilirsiniz. Buna ek olarak, seyreltik ağartma çözeltisi ile ıslatılmış kağıt havlular periyodik yüzeyleri ve lateks ya da neopren eldiven silin almak üzere odanın içine getirilebilir. Bu C öldürme, bu atmosfer ve katı ve sıvı ortam nüfuz gibi uzun süreler için odasının içine ağartıcı ya da alkol çözüm bırakmaz için kritik difficile, hem de vinil 34 zarar. Ayrıca, lateks ya da neopren eldiven düzenli olarak değiştirilmesi de, bulaşma riskini azaltabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, eğer emin bir organizma C. ise difficile veya kirletici madde, PCR kullanılarak tdcB geninin varlığı için bir test hızlı bir organizma C. olup olmadığını belirleyebilir 21 difficile. Aynı oda içinde çok sayıda anaerobik organizmalar yetiştirilmesi Son olarak, bu dikkat etmek önemlidir C. difficile (metabolik yan ürünleri üretebilir ETersi diğer anaerobik organizmaların büyümesini ve inhibe etmektedir. G. Hidrojen sülfit).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz nazik anaerobik odasının fotoğraflarını sağlamak için Coy Laboratuvarları teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe DK087763 (SMM) ve STEP / HHMI Müfredat Geliştirme Bursu (ANE) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Proteose Peptone no. 2 | BD | 212120 | |
| Na2HPO4 | Fisher | S373 | |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| MgSO4 (anhydrous) | Fisher | M65 | |
| á´…-Fructose | Fisher | L96 | |
| Sodium taurocholate | Sigma | T4009 | |
| á´…-cycloserine | Sigma | C6880 | |
| Cefoxitin | Fluka | C4786 | |
| Brain heart infusion medium | BD | 237300 | |
| Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | |
| Tris base | Fisher | BP152 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| L-cysteine | Sigma | C7755 | |
| BactoPeptone | BD | 211684 | |
| Columbian sheep blood agar | Fisher | L21928 | |
| NaCl | Fisher | S27 | |
| KCl | Fisher | P217 | |
| Glycerol | Fisher | BP2291 | |
| Sterile inoculating loops | Fisher | 22363596 | |
| Sterile swabs | Fisher | 1495990 | |
| Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories | Coy Laboratory Products, Inc | Customer Specified | These items are custom ordered per laboratory needs |
| Materials | |||
| TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use. |
|||
References
- Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
- Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
- Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
- Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C.
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
- Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
- Drasar, B. S.
- Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
- Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
- Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
- Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
- Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
- Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
- Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
- Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S.
- Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A.
- Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
- Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
- Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
- Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
- Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. , (2013).
- Burns, D. A., Minton, N. P.
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
- O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
- Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
- Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
- Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. , (2012).
- Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G.
- Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).
