Summary
このプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して インビトロで バイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。プランクトニックまたはバイオフィルム細菌は、選択した抗菌剤の連続希釈液に曝露される。生存率は寒天プレート上の成長によってアッセイされる。
Abstract
このプロトコルは、 インビトロでバイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。細菌は96ウェルマイクロティタープレートの井戸に接種される。プランクトニックアッセイの場合、選択した抗菌剤の連続希釈が細菌懸濁液に添加される。バイオフィルムアッセイでは、一度接種すると、細菌は一定期間にわたってバイオフィルムを形成するために残される。未接続の細胞は、ウェルから除去され、培地が補充され、選択した抗菌剤の連続希釈が加え加える。抗菌剤に曝された後、プランクトニック細胞は成長のためにアッセイされる。バイオフィルムアッセイの場合、培地は、抗菌剤を欠いた新鮮な培地でリフレッシュされ、バイオフィルム細胞は回復するために残されます。バイオフィルム細胞の生存率は、回復期間後にアッセイされる。抗菌剤のMBC-Pは、プランクトン培養中の細胞を殺す薬物の最も低い濃度として定義される。 対照的に、株に対するMBC-Bは、24時間の抗菌剤の濃度を増加させるために、プレフォー形成バイオフィルムを曝露することによって決定される。MBC-Bは、バイオフィルム内の細胞を殺す抗菌剤の最も低い濃度として定義されます。
Introduction
抗生物質耐性アッセイは、当初、細菌のプランクトニック(遊泳)培養物の耐性をアッセイするために開発されました。多くの細菌感染はバイオフィルム(表面付着細胞)を含むため、バイオフィルム特異的な抗生物質耐性をアッセイする方法の開発に興味を持っていました。しかし、ほとんどの抗生物質耐性アッセイは、バイオフィルムの耐性を測定するためには不十分です。例えば、最小阻害濃度(MIC)を決定することは、プランクトニック細菌培養 物1の抗生物質耐性を決定するためのゴールドスタンダードである。このアッセイは、希釈されたプランクトニック培養物と希釈系の抗生物質を混合することを伴う。 プランクトニック細胞の目に見える成長を阻害する抗生物質の濃度は、MICです。このアッセイは成長の阻害に依存しているため、定義上、それは、プレウジョンバイオフィルムにおける細胞の抗生物質感受性を調べる必要があるバイオフィルム培養物では動作できません。ここで説明するMBC-Bアッセイは、増殖阻害を測定する代わりに、バイオフィルムに存在する細胞を殺す抗生物質の濃度を決定する。従って、このアッセイは、確立されたバイオフィルム感染症の抗生物質治療を模倣し、 生体内での細菌抗生物質耐性のより関連性の高い見解を提供することを目的とする。
バイオフィルムは一般にプランクトニック培養 2-4 よりも抗生物質耐性が高いため、バイオフィルムの抗生物質耐性をプランクトニック培養物に直接関連付ける方法を考案する必要があった。したがって、この方法のもう一つの目標は、プランクトニック細胞とバイオフィルム細胞間の抗生物質耐性のレベルを直接比較できることである。ここで説明する MBC-P および MBC-B アッセイは、細胞が同様の条件で培養されるため、これを可能にします。我々は、バイオフィルム特異的抗生物質耐性 5-8 に重要ないくつかの遺伝子を研究するために、この方法を利用している。
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Protocol
1. MBC-B
-
バイオフィルムの成長 (オトゥール 9 から適応).
- 37°Cで富の培地で16時間の目的および変異株の野生型株の培養を成長させる。
- 飽和した一晩培養物1:100を抗生物質耐性アッセイ用の新鮮な培地に希釈する。 P. 緑素吸塩 の標準培地は、M63最小限の培地で、硫酸マグネシウムとアルギニンを添加した( 表1参照)。この培地は、より堅牢なバイオフィルムの形成を刺激する。
- 96ウェルマイクロティター皿にウェルあたり100μlの希釈液を加える( 表1参照)。これらのアッセイは、通常、各株の三重で行われるので、各株の24のウェルがあるはずです。
- マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
-
前形バイオフィルムを抗生物質の濃度勾配にさらす
- 7つの井戸のための抗生物質の10x希釈シリーズを準備する。例: 抗生物質トブラマイシンの場合、ウェル内の最終濃度は 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.006 mg/ml 5-8. 25 mg/mlのストックから、4、2、1、0.5、0.25、0.125、および0.06 mg/mlの10x希釈液を調製する。氷の上に置いておきなさい。
- マルチチャンネルピペットを使用して、使用済み上清(プランクトニックセルを含む)を取り除く( 表1参照)。
- すべてのウェルに90 μl M63(Mg/Arg)を加えます。
- 所望の最終濃度を達成するために、各10倍の抗生物質濃度の10 μlを加えます。反復および株ごとに最終ウェルに10μl水(抗生物質制御なし)を加えます。
- マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
-
メディアをリフレッシュし、生きた細胞の剥離を可能にする。
- マルチチャンネルピペットを使用して、使用済み上清(プランクトン細胞を含む)を取り除きます。
- すべてのウェルに115 μl M63(Mg/Arg)を加えます。
- マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
-
生細胞のアッセイ。
- 96ウェルマイクロティタープレートごとに2枚のLB寒天プレートにラベルを付けます。
- 100%エタノールにプロングを浸し、ブンゼンバーナーの開いた炎を横切って突起を通過させることによって、マルチプロング装置( 表1を参照)を殺菌します。繰り返す。プロングを少し冷まします。マルチプロング装置を用いて、マイクロタイタープレートの各ウェルからLB寒天板の表面にプランクトン培養液の〜3μl(通常は突起の先端に保持される量)を移す。
- LB寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
- 細菌増殖のためのカットオフを目で同定することにより、抗生物質の最小殺菌濃度を決定する(図1)。
2. MBC-P
-
細菌株の準備
- 37°Cで富の培地で16時間の目的および変異株の野生型株の培養を成長させる。
- 飽和した一晩培養物1:100を抗生物質耐性アッセイ用の新鮮な培地に希釈する。 P. 緑素吸塩 の標準培地は、M63最小限の培地で、硫酸マグネシウムとアルギニンを添加した( 表1参照)。
- 96ウェルマイクロティター皿にウェルあたり90μlの希釈液を加える( 表1参照)。これらのアッセイは、通常、各株の三重で行われるので、各株の24のウェルがあるはずです。
-
抗生物質の濃度勾配にプランクトニック細胞を曝露する
- 7つの井戸のための抗生物質の10x希釈シリーズを準備する。例: 抗生物質トブラマイシンの場合、ウェルの最終濃度は 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、および 0.0005 mg/ml です。25 mg/ml の在庫から、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、および 0.005 mg/ml の希釈液を準備します。氷の上に置いておきなさい。
- 所望の最終濃度を達成するために、各10倍の抗生物質濃度の10 μlを加えます。反復および株ごとに最終ウェルに10μl水(抗生物質制御なし)を加えます。
- マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
-
生細胞のアッセイ。
- 96ウェルマイクロティタープレートごとに2枚のLB寒天プレートにラベルを付けます。
- 100%エタノールにプロングを浸し、ブンゼンバーナーの開いた炎を横切って突起を通過させることによって、マルチプロング装置( 表1を参照)を殺菌します。繰り返す。プロングを少し冷まします。マルチプロング装置を用いて、マイクロタイタープレートの各ウェルからLB寒天板の表面にプランクトン培養液の〜3μl(通常は突起の先端に保持される量)を移す。
- LB寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
- 細菌増殖のために遮断を同定することにより、抗生物質の殺菌濃度を最小限に抑える(図2)。
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Representative Results
MBC-PおよびMBC-Bアッセイを実施し、PA14野生型の感度をPA14∆ndvBと比較した。トブラマイシンは抗生物質として使用された。ステップ 1.4.4 (図 1) とステップ 2.3.4 (図 2) に対応する結果が表示されます。PA14および∆ndvBは、三重化でMBC-PおよびMBC-Bアッセイに接種された。MBC-B プロトコルのステップ 1.0-1.4 および MBC-P プロトコルのステップ 2.0-2.3 を完了した後、生存セルを LB 寒天プレートにメッキしました。トブラマイシン(μ g/ml)の濃度は、細胞の左側に示されています。PA14 の MBC-B は 100 μg/ml、ndvB ∆の MBC-B は 12.5 μg/ml です。PA14および∆ndvB変異体のMBC-Pは8 μ g/mlである。
図 1.代表結果は、PA14野生型対PA14∆ndvBおよびトブラマイシンを有するMBC-Bアッセイから得られた。値はトブラマイシン(μg/ml)の最終濃度を指します。
図 2.代表結果は、PA14野生型対PA14∆ndvBおよびトブラマイシンを有するMBC-Pアッセイから得られた。値はトブラマイシンの最終濃度(μ g/ml)を指します。
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Discussion
プランクトニック細胞における抗生物質耐性は、細胞の永久的な変化(例えば 突然変異)による抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の増加と定義される。これまでに同定されたバイオフィルム特異的耐性または耐性のメカニズムは、バイオフィルム内の野生型遺伝子の発現の結果である。したがって、従来の抵抗の定義はバイオフィルムには適用されません。しかし、別の定義のセットが提示されている:抵抗メカニズムは、抗生物質がその目標にアクセスするのを防ぎ、耐性メカニズムは抗生物質10の標的をシャットダウンする。バイオフィルム特異的抗生物質耐性機構は、これらの定義の両方を包含する。「抵抗性」という用語は、このプロトコル全体で使用されてきましたが、遺伝子が耐性または耐性に寄与しているかどうかを判断するために、さらなる実験を行う必要があります。
MBC-PおよびMBC-Bアッセイは、あらゆるバイオフィルム形成細菌株および任意の殺菌性抗菌剤に適合することができる。このアッセイを他の細菌および他の抗菌剤に適応させる2つの重要な基準は、バイオフィルム形成につながる条件を決定し、目的とする野生型株を用いて抗菌剤の適切な濃度範囲を決定することである。適切なバイオフィルム形成条件は、ジョージ・オトゥール9によって公開されたJoVEバイオフィルム形成プロトコルを使用して決定することができる。MBC-Bアッセイに適した濃度範囲を決定するために、良好な経験則は、25 x MIC(最小阻害濃度11)を中間濃度として使用し、それに応じて調整することである。MBC-Pアッセイの場合、MBC-Bアッセイで特定された値の1/10を使用します。目標は、野生型株のMBC-Bと敏感な突然変異株の間の明確な違いを可能にする濃度の範囲を定義することです。したがって、範囲の上端は野生型株のMBC-Bに近いはずです。この実験を少なくとも3回繰り返し、1株当たり最低9つのデータポイントを与える。
これらのアッセイの最も重要なステップは、汚染を避けることです。株間の汚染を防ぐために、株間に空の列を残す必要があります。もう一つの重要なステップは、マルチプロングデバイス上の金属プロングが十分に冷却するのに十分な時間を与えるためです。これは、プロングを炎上し、冷却期間をタイミングし、手で突っ立ちに素早く触れることによってテストすることができます。
抗生物質への曝露後にバイオフィルムから細胞を剥離することが問題である場合、MBC-B法は超音波処理ステップを含むように変更することができる。ステップ1.3.3(新鮮なメディアを追加した後、24時間インキュベーション)をスキップしてください。代わりに、115 μlの新鮮なメディア(ステップ1.3.2)を無菌粘着板シールと超音波プレートで添加した後、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを覆い、バイオフィルム細胞を井戸の壁から取り除きます。水浴超音波処理器を使用してください。プラスチックからバイオフィルム細胞を効率的に除去するための特定の条件(時間、強度)は、事前に決定する必要があります。
MBC-Bのバリエーションは、バイオフィルム特異的抗生物質耐性変異体に対するP.緑素吸蔵の4,000個のトランスポゾン挿入変異体のライブラリーをスクリーニングするために使用された。トブラマイシン(50μg/ml)の濃度は、野生型バイオフィルム細胞を殺さないが、野生型バイオフィルムよりも3倍敏感な突然変異体の同定を可能にする選択された。細菌の1つの特定の株で井戸の列を接種する代わりに、各井戸は異なる突然変異体で接種された。変異体は、50 μ g/mlトブラマイシンにさらされたバイオフィルムを形成するために残され、トブラマイシン暴露から回復するために残され、その後、生存可能性についてアッセイされた。50 μ g/mlトブラマイシン曝露を生き残らなかった変異体を同じスクリーニング条件下で再検査した。MBC-PおよびMBC-Bプロトコルは、変異体のトブラマイシン感受性型を確認するために利用された。
バイオフィルム、 すなわち コロニーバイオフィルムおよびバイオリアクター12,13で成長したバイオフィルムにおける抗生物質耐性をアッセイする他の方法がある。これらの方法はかなり面倒で、簡単にアッセイできる株の数が限られています。したがって、MBC-Bがこれらの他の方法よりも優れた利点は、高スループットであり、研究者がスクリーンを実施したり、いくつかの株をアッセイしたり、同時にいくつかの異なる抗生物質濃度をアッセイできるようにすることです。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント (オプション) |
| 1x M63 | 15 g KH2PO4、35 g K2HPO4、10g (NH4)2SO4を 1 L の水に溶解して、5x M63 ストックとして準備します。この在庫はオートクレーブする必要はありませんし、室温で保存することができます。 5xストック1:5を希釈し、オートクレーブ、クール、その後、目的のコンポーネントを追加します。 | ||
| KH2PO4 | 漁夫 | P285-500 | |
| K2HPO4 | 漁夫 | P288-500 | |
| (NH4)2だから4 | シグマ | A5132 | |
| 硫酸マグネシウム | 漁夫 | M63-500 | 1 mM の最終濃度に加えます。 水とオートクレーブで1 Mストックとして準備します。 |
| トブラマイシン | シグマ | 50 mg/mlストックを準備します。アリコートと-20°Cで保管してください。 | |
| アルギニン | シグマ | A5131 | 0.4%の最終濃度に加えます。 水とフィルター滅菌で20%のストックとして準備します。 この代替炭素/エネルギー源は、グルコースおよびカザミノ酸を置き換えることができます |
| 96ウェルマイクロティタープレート | コーニング | 3595 | 滅菌、フラットボトム、低蒸発 |
| トランフェルペッテ(マルチチャンネルピペット) | ブランドテック | 2703610 | 8チャンネル、20~200μl |
| 多乗装置 | ダン・カー | MC48 | 48のプロングは96ウェルマイクロタイタープレートの1/2に収まる |
表 1.
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Disclosures
著者は、彼女が競合する財政的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
著者は、この原稿の編集上の助けのために李張、西安志李、アーロン・ヒンツ、クレイトン・ホールに感謝したいと思います。このアッセイは当初、ダートマスのガイゼル医学部ジョージ・オトゥールの研究室で開発されました。博士マーの研究室での研究は、カナダの自然科学工学研究評議会と嚢胞性線維症カナダからの助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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