عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

ملخص

وقد وضعنا رواية وتقنية استنساخه لعزل الثقافات الأولية من الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء (PASMC) من الفئران في سن P7، مما يتيح دراسة أفضل للمسارات الإشارات المشاركة في حديثي الولادة العضلات الملساء انكماش الخلايا والاسترخاء.

الملخص

ارتفاع ضغط الدم الرئوي هو سبب كبير من المراضة والوفيات عند الأطفال الرضع. تاريخيا، كانت هناك دراسة كبيرة من مسارات الإشارات المشاركة في الأوعية الدموية تقلص العضلات الملساء في PASMC من الأغنام الجنين. بينما الأغنام جعل نموذجا ممتازا من ارتفاع ضغط الدم الرئوي المدى، أنها مكلفة للغاية وتفتقر إلى الاستفادة من التلاعب الوراثي الموجود في الفئران. على العكس، كان عدم القدرة على عزل PASMC من الفئران وجود قيود كبيرة من هذا النظام. نحن هنا وصف عزلة الثقافات الأولية من الماوس PASMC من P7، P14، P21 والفئران باستخدام الاختلاف من هذه التقنية هو موضح سابقا من مارشال وآخرون. ^{ال 26} التي كانت تستخدم سابقا لعزل PASMC الفئران. هذه PASMC الفئران تمثل أداة جديدة لدراسة مسارات إشارات في فترة الوليد. لفترة وجيزة، والطين من 0.5٪ (W / V) + الاغاروز هي التي غرست جزيئات الحديد 0.5٪ في M199 سائل الإعلام في السرير الوعائي الرئوي عبر البطين الأيمن (RV). الجزيئات الحديد هي 0.2 ميكرومتر في القطر وليس يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي. وهكذا، فإن النزل الحديد في الشرايين الرئوية الصغيرة (PA). وتضخم الرئتين مع الاغاروز، إزالتها وفصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد إلى أسفل مع المغناطيس. بعد كولاجيناز (80 U / مل) العلاج ومزيد من التفكك، يتم وضع السفن في طبق زراعة الأنسجة في M199 سائل الإعلام التي تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والمضادات الحيوية (M199 وسائل الإعلام كاملة) للسماح الهجرة الخلية على طبق ثقافة . هذه لوحة من الخلايا الأولية هي مزيج من الخلايا الليفية 50-50 وPASMC. وهكذا، فإن هدم الإجراء يتكرر عدة مرات لتحقيق السكان PASMC أكثر نقاء وإزالة أي الحديد المتبقية. يتم تأكيد هوية الخلايا العضلية الملساء التي كتبها المناعية لسلسة العضلات الميوسين وdesmin.

المقدمة

ارتفاع ضغط الدم الرئوي أمر طبيعي خلال الحياة داخل الرحم منذ المشيمة بمثابة الجهاز الرئيسي لتبادل الغازات ويتم توزيعها فقط 10٪ من النتاج القلبي من خلال السرير الوعائي الرئوي. في الرحم والضغوط الرئوي تشبه الضغوط النظامية نظرا لارتفاع المقاومة الوعائية الرئوية . كما تقدم الحمل، وهناك نمو سريع للسلطة الفلسطينية الصغيرة داخل الرئة، وإعداد الجنين لزيادة كبيرة في تدفق الدم الرئوي الذي يحدث عند الولادة ^1. عند فشل عملية الانتقال في الفترة المحيطة بالولادة الطبيعية لدى الرضع على المدى القريب والمدى الكامل، والنتيجة هي ارتفاع ضغط الدم الرئوي الثابتة من الأطفال حديثي الولادة (PPHN). PPHN هو متلازمة سريرية بسبب العديد من....

البروتوكول

لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة نورث وسترن الموافقة على هذا البروتوكول.

1. عزل الشريان الرئوي من الفئران حديثي الولادة - يوم واحد

1. إعداد M199 وسائل الإعلام كاملة - ميكس 400 مل M199 مع 100 مل (تركيز النهائي = 20٪) الحرارة المعطل FBS و 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / الستربتوميسين.
2. إعداد المصل الحرة M199 الإعلام - ميكس 500 مل M199 مع 5 مل (تركيز النهائي = 1٪) البنسلين / ال....

النتائج

أثناء وبعد العزلة، ويتم فحص كل PASMC بواسطة المجهر الضوئي والمناعية لسلسة علامات الخلية العضلية. بواسطة المجهر الضوئي في البروتوكول في وقت مبكر، وينظر PASMC المهاجرة على طبق زراعة الأنسجة من الحديد الصغيرة التي تحتوي على الأوعية (الشكل 1A). بعد تجميع لوحات واحد من خلال ثلاثة في ثلاثة عشر يوما، ثم جزيئات الحديد لم تعد ينظر إليها على أنها تلك التي تم انتشالها في خطوة تجميع النهائي. بدلا من ذلك، يعتبر عدد سكانها PASMC على طبق زراعة الأنسجة (الشكل 1B).

المناقشة

في هذا المخطوط، وصفنا للمرة الأولى عزلة PASMC من الفئران في P7، P14، P21 و. من أجل تحقيق هذا الهدف، وغرست في الطين من الاغاروز و 0.2 ميكرومتر جزيئات الحديد من خلال RV في السلطة الفلسطينية. ونظرا لصغر حجم جزيئات الحديد، فإنها لا يمكن أن تمر عبر السرير الشعري الرئوي، وبالتالي فهي تودع في السلطة الفلسطينية الصغيرة. وتضخم الرئتين، وإزالة فصلها. يتم سحبها في الأوعية المحتوية على الحديد التدريجي من الحل باستخدام المغناطيس. في نهاية المطاف، ومطلي السفن في طبق زراعة الأنسجة، والخلايا تهاج.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مقبض الشفرة الجراحية Bard Parker	BD	371030
شفرات جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ # 10 (معقمة)	محاقن Miltex	4-310
(3 مل و 5 مل ، معقمة) BD		309657 و 306646
الإبر (27 جم ، معقمة)	BD	305109
قسطرة الأوعية الدموية (24 جم ، معقمة)	BD	381412
Monoject قنية حادة (15 جم)	كيندال	SWD202314Z
خيوط	فيشر العلمية	NC9782896
مجمع الجسيمات المغناطيس	دينال Invitrogen	120-01D	هذه أداة مهمة للبروتوكول.
ألواح زراعة الأنسجة (35 مم و 60 مم و 10 سم ، معقمة)	BD	353001 و 353004 و 353003	نوع من ألواح زراعة الأنسجة سيكون جيدا.
مقص القزحية (4 ½ ؛ بوصة من الفولاذ المقاوم للصدأ)	شركة التشخيص الأمريكية	3424
ملقط (4 بوصة من الفولاذ المقاوم للصدأ)	كويك ميديكال	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 وسائل الإعلام	Mediatech	10-060-CV
البنسلين / الستربتومايسين	VWR	TX16777-164NWU
مصل الأبقار الجنيني	Hyclone / Thermo Scientific	SH3091003	تعطيل الحرارة عند 55 درجة ؛ ج لمدة 45 دقيقة. لتحقيق الاتساق في النتائج ، قم بمطابقة جميع المصل واحصل عليه من نفس البائع.
جزيئات الحديد (مسحوق أكسيد الحديد (II ، III)) شركة	Aldrich Chemical	Company # 31،006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (مصنوع إلى 80 U / مل)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U مع كاميرا Cascade Photometrics 12 بت	Nikon	TE2000-U	أي مجهر ضوئي جيد سيكون جيدا لمراقبة PASMC في الثقافة.
الأجسام المضادة للديسمين	Sigma	D-8281	استخدم عند تخفيف 1: 200 للتلوين المناعي.
مضاد للعضلات الملساء الميوسين	التقنيات الطبية الحيوية	BT-562	استخدم عند تخفيف 1: 2,000 للتلوين المناعي.
الثانوية المضادة للأرانب الرودامين	الحمراء / Invitrogen	R-6394	استخدم عند تخفيف 1: 200 للتلوين المناعي.
نيكون Eclipse TE-300 المجهر الفلوري وكاميرا Cool Snap الرقمية	نيكون	TE300	أي مجهر جيد للتألق سيكون جيدا للتلوين المناعي.
مجموعة فحص فوسفوديستراز النيوكليوتيدات الدورية	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	هذا هو مقايسة نشاط إنزيم PDE اللونية الوحيدة المتاحة.
السيلدينافيل	سيجما	PZ-0003	مطلوب مثبط انتقائي PDE5 لنشاط إنزيم PDE لتحديد خصوصية التحلل المائي cGMP.

أي المجسات الجزيئية