Summary
Wir haben eine neue und reproduzierbare Technik zur primären Kulturen der Lungenarterie glatten Muskelzellen (PASMC) von Mäusen, so jung wie P7 isolieren entwickelt, wodurch eine bessere Erforschung der Signalwege in neonatalen glatten Muskelzellen Kontraktion und Relaxation beteiligt.
Abstract
Lungenhochdruck ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität bei Säuglingen. Historisch gesehen hat es bedeutende Studie über die Signalwege in vaskulären Kontraktion der glatten Muskulatur in PASMC von fetalen Schafen beteiligt. Während Schafe ein ausgezeichnetes Modell der Begriff pulmonaler Hypertonie, sind sie sehr teuer, und es fehlt die Vorteile der genetischen Manipulation in Mäusen. Umgekehrt war die Unfähigkeit, PASMC von Mäusen zu isolieren eine erhebliche Einschränkung dieses Systems. Hier beschreiben wir die Isolierung von primären Kulturen von Maus PASMC von P7, P14, P21 und Mäusen unter Verwendung einer Variation des vorstehend beschriebenen Technik der Marshall et al. 26, der zuvor verwendet wurde, um Ratte PASMC isolieren. Das murine PASMC stellen eine neue Methode zur Untersuchung von Signalwegen im Neugeborenen. Kurz gesagt, wurde eine Aufschlämmung von 0,5% (w / v) Agarose + 0,5% Eisenteilchen in M199 Medium in die pulmonalen Gefäßsystem über den rechten Ventrikel (RV) infundiert. DieEisenteilchen 0,2 um im Durchmesser und können nicht durch die pulmonalen Kapillaren Bett passieren. Somit sind die Eisen Lodges in den kleinen Lungenarterien (PA). Die Lungen werden mit Agarose, entfernt und distanzierte aufgeblasen. Die Eisen-enthaltende Gefäße sich mit einem Magneten angezogen. Nach Kollagenase (80 U / ml) Behandlung und weitere Dissoziation werden die Gefäße in eine Gewebekulturschale in M199 Medium mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika (M199 Vollmedium) setzen, um Zellmigration auf der Kulturschale erlauben . Diese erste Platte von Zellen ist ein 50:50 Gemisch aus Fibroblasten und PASMC. Somit wird der Pull-Down-Verfahren mehrfach wiederholt, um eine reinere PASMC Bevölkerung erreichen und entfernen Sie alle restliche Eisen. Glatte Muskelzellen Identität wird durch Immunfärbung für glatte Muskelzellen Myosin und Desmin bestätigt.
Introduction
Lungenhochdruck ist bei intrauterin normal, da die Plazenta dient als wichtige Organsysteme des Gasaustausches und nur 10% des Herzzeitvolumens wird durch die pulmonalen Gefäßsystem zirkuliert. Im Uterus pulmonalen Druck ähnlich systemischen Belastungen durch erhöhten pulmonalen Gefäßwiderstand sind . Wie Schwangerschaft fortschreitet, gibt es rasante Wachstum der kleinen PA in der Lunge, die Vorbereitung der Fötus für die dramatische Zunahme der pulmonalen Durchblutung, die bei der Geburt 1 auftritt. Wenn der normale perinatale Übergang in naher Zukunft und voller Neugeborenen ausfällt, ist das Ergebnis persistierenden pulmonalen Hypertonie des Neugeborenen (PPHN). PPHN ist ein klinisches Syndrom, das durch viele verschiedene Grunderkrankungen verursacht. Allerdings teilen alle dieser Kinder gemeinsamen pathophysiologischen Eigenschaften wie erhöhte pulmonale Gefäßwiderstand, Hypoxämie und Rechts-nach-Links-Shunt des Blutflusses über persistente fetalen Verbindungen wie der Ductus arteriosus oder füramen ovale. PPHN wirkt 2-6 pro 1.000 Lebendgeburten und vermittelt einen 8-10% Mortalitätsrisiko sowie signifikante kurzfristige und langfristige Morbidität 2. Darüber hinaus kann sehr geringem Geburtsgewicht Frühgeborenen pulmonaler Hypertonie infolge der ihnen zugrunde liegenden Lungenerkrankung entwickeln. Die häufigsten zugrunde liegenden Lungenerkrankung von Frühgeborenen ist bronchopulmonale Dysplasie (BPD). Während das Gesamtrisiko der BPD korreliert mit Gestationsalter und Geburtsgewicht, bleibt es unklar, warum eine Teilmenge dieser Kinder entwickelt signifikante pulmonale Hypertonie und wie man angemessen behandeln diese Kinder. Schlechte Ergebnisse, einschließlich verlängerten Krankenhausaufenthalten und einer erhöhten Sterblichkeit, sind häufig 3-6.
Historisch gesehen, haben Schafe oder Schweine PASMC fetalen fetalen PASMC von gesunden Tieren verwendet worden, um die Signalwege in der normalen pulmonalvaskulären Übergang nach der Geburt beteiligt studieren. Diese werden in der Regel von der fünften Generation Widerstand PA von einem isoliertn Schafen oder Schweinen Fötus, die geliefert wird und eingeschläfert vor jeder Spontanatmung 7-9. Darüber hinaus haben einige Forscher isoliert und genutzt PASMC und aus etwas älteren spontan atmenden Lämmer und Ferkel auf 3 Tage, 2 Wochen und 4 Wochen 10-12. In jüngerer Zeit haben einige Gruppen erfolgreich isoliert und genutzt PASMC von Lämmern mit PPHN, um die Störungen in Signalwegen in der Krankheitszustand 13-17 untersuchen isoliert. Diese Zellen haben sich als wertvolles Werkzeug zu untersuchen, welche Signalwege entscheidend sowohl in der normalen und erkrankten kurzfristige und langfristige Lungengefäßsystems sind sein. Allerdings wissen sie nicht geben Einblick in die Signalwege bei Frühgeborenen mit pulmonaler Hypertonie betroffen. Noch erlauben sie die Möglichkeiten der genetischen Manipulation in Maus-Modellen der Krankheit gesehen.
Ratten-und Mausmodellen haben lange zu modellieren BPD verwendet worden und in jüngerer Zeit werden zu modellieren pulmonalen hy verwendetpertension aus BPD 18-22. Neonatal Ratten sind verlockend mit aufgrund ihrer größeren Größe arbeiten, aber sie leiden auch unter Mangel an Potenzial für genetische Modifikation. Gentechnisch veränderte Tiere wurden ausgiebig genutzt, um die Auswirkungen von bestimmten Gen-Targets auf ganze Tierphysiologie in neugeborenen Mäusen zu untersuchen, aber bis heute hat niemand zuvor erfolgreich isoliert PASMC aus diesen kleinen Mäusen. Durch Isolieren PASMC können größere Informationen Pfade ändern in Reaktion auf Stimuli aus der Umgebung und / oder genetische Modifikation speziell in der Lungenarterie glatten Muskulatur erhalten werden. Zusätzlich können Live PASMC in Echtzeit auf schnelle Veränderungen der wichtigsten Signalmoleküle wie Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies 23-25 untersuchen abgebildet werden. Wir berichteten kürzlich über die erfolgreiche Isolierung von PASMC von erwachsenen Mäusen mit einer Variation der Technik von Marshall et al. 26 zur Isolierung Ratte PASMC 23,25,26. Wir haben jetzt eine angepasstend erweitert diese Technik, um kleine Mäuse 7-21 Tage alt (P7, P14, P21 und). Die wichtigste Einschränkung auf diese neue PASMC Isolierung Technik ist, dass es mehrere Mäusen benötigt, um genügend Zellen für Experimente zu erzeugen, und dass die Zellen wachsen sehr langsam, was charakteristisch primären glatten Muskelzellen. Trotz dieser Einschränkungen, glauben wir, diese Technik für die Neugeborenen-Maus PASMC isolieren wird für die erweiterte Untersuchung der wichtigsten Signalwege in der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie beteiligt und stellt einen bedeutenden Fortschritt in diesem Bereich zu ermöglichen.
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Protocol
Das Institutional Animal Care und Use Committee an der Northwestern University genehmigt dieses Protokoll.
1. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day One
- Bereiten Sie die komplette M199 Medien - Mix 400 ml M199 mit 100 ml (Endkonzentration = 20%) hitzeinaktiviertes FBS und 5 ml (Endkonzentration = 1%) Penicillin / Streptomycin.
- Bereiten Sie die Serum freie M199 Medien - Mix 500 ml M199 mit 5 ml (Endkonzentration = 1%) Penicillin / Streptomycin.
- Bereiten Sie die PA Agarose - Mix 0,05 g Agarose zzgl. 0,05 g Eisenpartikel in 10 ml sterile, Serum-freie Medien M199.
- Bereiten Sie die Lung Agarose - Mix 0,1 g Agarose in 10 ml sterile, Serum-freie Medien M199.
- Bereiten Sie die Collagenase - Mix Kollagenase in sterile, Serum-freie Medien M199 in einer Endkonzentration von 80 U / ml und dann Sterilfilter diese Mischung. Richten Sie alle Geräte vor der Zeit, bevor euthanizing die Maus.
- Set PA Agarose und Lunge Agarose zu kochen, bevor euthanizing mit der rechten Maustaste.
- Euthanize die Maus in der Narkose mit Isofluran jar Überdosierung und vorsichtig sein, nicht zuzulassen, dass die Maus Welpe in Kontakt mit der Isofluran kommen. Die beste Zelle Ausbeute erhalten wird, wenn die Zellen sofort nach dem Tod entnommen, um Mikro-Klumpen, die im Kreislauf bilden nach dem Tod zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Maus aus der Narkose jar, sichern Sie die Maus, um das Betriebssystem Bord und sterilisieren Sie die Maus, Instrumente und Handschuhe mit Alkohol.
- Legen Sie das Skalpell mit dem Messer einschneiden und die Maus vom Hals bis zu den unteren Bauch.
- Öffnen Sie den Bauch auf der Maus die linke Seite, setzen die Niere, und schneiden Sie die Nierenarterie, um die Maus zu schröpfen, wodurch Blutgerinnsel in den kleinen Gefäßen der Lunge.
- Mit einer Schere entlang der Maus die linke Seitedas Brustbein zu öffnen den Brustkorb.
- Vorsichtig verwenden Skalpell, um die Membran auf beiden Seiten abgeschnitten und öffnen Sie die Brusthöhle. Verwenden einer Pinzette oder Stifte zu halten, die Brusthöhle geöffnet.
- Kleben Sie den RV mit einer 27 G ½ Zoll Nadel gegen die PA gerichtet und versorgen die RV / PA / Lungen mit sterilem PBS bis die Lungen weiß erscheinen (alles Blut aus dem Lungenkreislauf gespült). Dies wird etwa 3-5 ml von PBS in Abhängigkeit von der Größe der Maus zu machen. Es ist wichtig, zuerst zu spülen, um die Bildung von Blutgerinnseln in den kleinen Lungengefäße verhindern.
- Vorsichtig verwenden stumpf auf die Luftröhre und Faden eine Naht unter freizulegen.
- Setzen Sie die kleinste Pinzette unterhalb der Luftröhre für die Unterstützung und legen Sie die 24 G Angiokatheter in die Luftröhre. Legen Sie die Angiokatheter als ob Platzieren eines IV.
- Sichern Sie die Angiokatheter in die Luftröhre mit der Naht im Schritt 1.16 eingefädelt.
- Nehmen kochendem PA Agarose von kochendem Wasser, und schwenken, um gut zu mischen. Kühlen Sie die agarose etwa Körpertemperatur durch Schütteln auf Eis. Die Agarose muss in Lösung bleiben, jedoch nicht so heiß, dass sie die Zellen des PA beschädigen.
- Kleben Sie den RV mit einer 27 G ½ Zoll Nadel und versorgen die RV / PA / PA Lungen mit Agarose bis die Lungen grau erscheinen. Die Eisenpartikel in der Agarosemischung wird die Lunge erscheinen in der Farbe grau. Das dauert etwa 3-5 ml von PA Agarose abhängig von der Größe der Maus. Es ist auch wichtig, langsam zu gehen als Injektion zu schnell könnte bewirken, dass das Eisen in die Atemwege auslaufen.
- Nehmen Sie die Lunge Agarose aus kochendem Wasser und Schwenken gut mischen. Dann kühlen die Agarose auf etwa Körpertemperatur durch Umschwenken auf Eis. Die Agarose muss in Lösung bleiben, jedoch nicht so heiß, dass sie die Zellen der Lunge führen.
- Zeichnen bis die Lunge Agarose und befestigen Sie die Spritze mit dem 24 G Angiokatheter in der Luftröhre. Infuse die Agarose durch die Luftröhre vollständig aufzublasen die Lunge. Die Lunge wird Easie seinr zu zerkleinern (siehe späteren Schritten), wenn die Lunge entsprechend aufgepumpt sind.
- Entfernen Sie die Herz-Lungen-Block, und tauchen Sie es in 25 ml eiskaltem PBS, um die Agarose (~ 5 min) zu verfestigen. Nutzen Sie diese Zeit, um aufzuräumen den OP-Bereich.
- Für neugeborenen Mäusen (P7-P21), kommt das Beste PASMC Ausbeute aus der Kombination 2-3 Welpen in einer Charge von Zellen. PASMC lieber in Kontakt mit anderen Zellen, die für optimale Zelle Gesundheit und Wachstum. Wenn eine Maus pro Isolierung verwendet wird, dann werden die Zellen sind sehr spärlich und nicht gut wachsen. Bei der Kombination von Tieren, Ernte und Kälte die Herz-Lungen-Blöcke zusammen und dann zu bewegen, wenn alle Hacken Herz-Lungen-Blöcke von den Tieren entfernt wurden.
- Gehen Sie zu der Zellkultur Kapuze für Sterilität von diesem Punkt an.
- Legen Sie die gekühlte Lunge in den Deckel des 10 cm Gewebekulturschale und entfernen Sie vorsichtig die Herz, Thymus, Luftröhre, und jede Bindegewebe aus der Lunge.
- Bewegen Sie die Lungen auf den Boden der 10 cm Gewebekulturschaleund fügen Sie ca. 1 ml eiskaltem, sterilen PBS.
- Mince die Lunge in sehr kleine Stücke (1-2 mm) mit 2 Skalpelle.
- Brechen Sie die Spitze aus einer sterilen 5 ml serologische Pipette. Pipette gehackt Lunge Schlamm in sterile 50 ml konischen Röhrchen. Verwenden zusätzliche sterile eiskaltem PBS, um die Platte zu waschen, um sicherzustellen, dass alle das Lungengewebe in die 50 ml konischen Röhrchen erhält.
- Legen Sie die 50 ml konischen Röhrchen auf den Magneten. Warten, bis der Eisen-haltigen Gewebes auf Seite der Röhre neben dem Magneten zu bewegen. Je nach dem Verhältnis von Eisen enthaltenden Behälter Lungengewebe, können einige der Gefäße an dieser Stelle noch zu schweben. Absaugen der PBS langsam und vorsichtig versuchte, nicht zu schwimmenden Lungengewebe absaugen, da es unklar ist, ob es Schiffe enthält.
- Waschen der Lunge Pellet 3x mit 5 ml sterilem PBS, wieder versuchen, die Menge des Lungengewebes angesaugt minimieren.
- Resuspendieren der Lunge Pellet in 3 ml Kollagenase und gießen Sie in 60 mm Gewebe-Kulturschale. Nichtversuchen, diese Pipette, die Lunge Brocken wird dem Innenraum Ihres Pipette haften.
- Verwenden Sie eine zusätzliche 3 ml, um das Rohr nach dem Gießen spülen, und gießen Sie diese in 60 mm Gewebe-Kulturschale als auch.
- Platz in 37 ° C Gewebekulturinkubator für 1 Stunde.
- Pipette Gewebe + Kollagenase Aufschlämmung nach oben und unten mit einer 15 G stumpfen Nadel auf einer 5 ml Spritze, bis sich die großen Stücke Lunge gestört werden. Das Gewebe + Kollagenase Schlamm wird an dieser Stelle bewölkt ohne sichtbare Gewebe Brocken.
- Gießen Sie in ein neues steriles 50 ml konischen Röhrchen und heften sich an den Magneten.
- Waschen des Gewebes Kulturschale mit ca. 5 ml vollständigem Medium M199, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe gesammelt worden ist, und diese Mengen in den konischen Rohr.
- Absaugen der Collagenase + Medien Überstand. Dieses Mal wird es nur sehr wenige Schwimmer sein und eine kompakte eisenhaltigen Pellet wird an der Seite des konischen Rohrs neben dem Magnet sein.
- Waschen mit 5 ml komplette medua 3x. Dies ist erforderlich, um die Collagenase zu inaktivieren.
- 3 ml komplette Medien-, und mischen Sie nach oben und unten ein paar Mal, um die eisenhaltigen Pellet resuspendieren.
- Gießen Sie die resuspendierten Pellets in ein 35 mm Gewebe-Kulturschale. Unter dem Mikroskop wird es kleine Scherben Umlauf mit Eisenpartikel in das Gefäßlumen enthalten sein.
- Legen Sie die Gewebekulturschale (beschriftet Platte Null) im Gewebekulturinkubator Nacht. Die ersten Zellen wandern aus auf die Platte Null sind ca. 50% und 50% Fibroblasten PASMC auf Färbung für glatte Muskelzellen Markern basieren. Diese Platte wird vergoldet Null genannt und schließlich nach der anschließenden Anreicherungsschritten verworfen.
2. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day Two
- Gießen Sie die Medien Überstand von Null Platte in ein sauberes 50 ml konischen Röhrchen.
- Absaugen der Medien Überstand. Dieses Mal wird es fast keine Floater sein, und ein kompaktes Eisen-Containing Pellet wird an der Seite des konischen Rohrs neben dem Magneten zu bilden.
- Waschen mit 5 ml komplette Medien-3x.
- 3 ml komplette Medien-, und mischen Sie nach oben und unten ein paar Mal, um die eisenhaltigen Pellet resuspendieren.
- Gießen Sie in eine 35 mm Gewebe-Kulturschale. Unter dem Mikroskop werden kleine Scherben Umlauf mit Eisenteilchen in den Gefäßlumen enthaltenen gesehen. Dies wird Platte sein (Abbildung 1A).
- Legen Sie die Gewebekulturschale im Gewebekulturinkubator.
3. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day Six
- Gießen Sie die Medien Überstand aus einer Platte in ein sauberes 50 ml konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrfach versichert, dass alle von der glatten Muskelzellen mit Wohnsitz in der Wand des Gefäßes eine Gelegenheit zu wandern off auf eine Zellkulturplatte haben. Es ist eine abnehmende Rendite mit jedem Schritt, dh jeder Platte wird immer weniger Zellen anheften.
- Absaugen der Medien Überstand. Dieses Mal wird es nahezu keine Schwimmer, und eine kompakte eisenhaltigen Pellet wird an der Seite des konischen Rohrs neben dem Magneten zu bilden.
- Waschen mit 5 ml komplette Medien-3x.
- 3 ml komplette Medien-, und mischen Sie nach oben und unten ein paar Mal, um die eisenhaltigen Pellet resuspendieren.
- Gießen Sie in eine 35 mm Gewebe-Kulturschale. Unter dem Mikroskop werden kleine Scherben Umlauf mit Eisenteilchen in den Gefäßlumen enthaltenen gesehen. Dies wird Platte zwei sein.
- Legen Sie die Gewebekulturschale im Gewebekulturinkubator.
4. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day Nine
- Gießen Sie die Medien aus dem Überstand Gewebekulturschale Platte zwei in ein sauberes 50 ml konischen Röhrchen.
- Wiederzuführungsführung Platte zwei komplette M199 Medien und Stelle wieder in den GewebekulturenInkubator.
- Absaugen der Medien Überstand. Dieses Mal wird es nahezu keine Schwimmer, und eine kompakte eisenhaltigen Pellet wird an der Seite des konischen Rohrs neben dem Magneten zu bilden.
- Waschen mit 5 ml komplette Medien-3x.
- 3 ml komplette Medien und mischen nach oben und unten ein paar Mal, um die eisenhaltigen Pellet resuspendieren.
- Gießen Sie in eine 35 mm Gewebe-Kulturschale. Unter dem Mikroskop werden kleine Scherben Umlauf mit Eisenteilchen in den Gefäßlumen enthaltenen gesehen. Dies Platte drei.
- Legen Sie die Gewebekulturschale im Gewebekulturinkubator.
5. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day Thirteen
- Saugen Sie die Medien aus der Platten 1-3.
- Vorsichtig waschen die Zellen mit warmem, sterilem PBS.
- In einen dünnen Film von Trypsin (~ 0,25-0,5 ml) Trypsin zu jeder Platte zu trypsinize aus Zellen. Zellen sind sehr haftend und müssen in Trypsin im Gewebe cultu seinre Inkubator für etwa 10 min zum Abheben der Platte.
- Ernten Sie die Zellen von den Platten in 5 ml komplettem Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen an den Magneten zu ziehen alle verbleibenden Eisenpartikel.
- Waschen jeder der Platten mit einem Zusatz von 0,5 ml Vollmedium und hinzufügen, dass Medien an die konische 50 ml-Röhrchen.
- Diesmal nehmen die Medien Überstand (nicht saugen), und entsorgen Sie die Eisen-Pellet.
- Platte die Zellen in 5 ml komplettes M199 Medium in einem 60-mm-Schale in konfluenten Zellen in ein paar Tagen. Alternativ Platte die Zellen in 10 ml komplettem M199 Medien in einer 10 cm Platte und PASMC dauert etwa weitere 1-2 Wochen auf den Zusammenfluss erreichen.
6. Lungenarterie Isolation von neugeborenen Mäusen - Day Fourteen
- Ändern Sie die Medien an die frische komplette M199 Medien, um das restliche Trypsin zu entfernen. Es wird eine dünne Bevölkerung PASMC auf Zellkulturschalen (1B) sein.
7. Regelmäßige Pflege
- Ändern Sie die Medien an die frische komplette M199 Medien etwa 2x pro Woche.
- Beim Aufteilen diese Zellen, ist ca. 10 min in den Inkubator in einem Film von Trypsin (0,25-0,5 ml) für die Zellen erforderlich ist, um die Platte abheben. Mit dem Trypsin Folie ermöglicht Replattierung der PASMC ohne Abzentrifugieren der Zellen. Wenn zu viel Trypsin verwendet wird, dann muss die PASMC zentrifugiert, um Spin-out der Trypsin werden, oder die Zellen nicht an der Platte readhere. Manchmal, nach Abzentrifugieren der Zellen, ist es schwer, die PASMC in komplette M199 resuspendiert bekommen.
- In Beobachtungen, die isolierte PASMC wie glatten Muskelzellen zuverlässig verhalten für 4-5 Passagen, aber die isolierten Zellen zu färben für glatte Muskelzelle Marker bis zu 7 Durchgang. Zählen Sie die erste gepoolten 60 mm oder 10 cm Teller auf Tag dreizehn als Durchgang 2 (Beschichtung nach der ersten Exposition gegenüber Trypsin).
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Representative Results
Während und nach der Isolierung sind PASMC sowohl durch Lichtmikroskopie und durch Immunfärbung für glatte Muskelzelle Marker untersucht. Durch Lichtmikroskopie in den frühen Protokoll werden PASMC gesehen Migration auf das Gewebe Kulturschale aus dem kleinen eisenhaltigen Schiffe (Abbildung 1A). Nach Zusammenlegung Platten eins bis drei auf dreizehn Tage, dann Eisenpartikel sind nicht mehr zu sehen als diejenigen, wurden im letzten Schritt Pooling gezogen. Stattdessen wird eine Population von PASMC auf Zellkulturschalen (1B) gesehen.
Basierend auf Immunfärbung sind die ersten Zellen, die aus der Migration der eisenhaltigen Gefäße etwa 50% und 50% Fibroblasten PASMC (Daten nicht gezeigt). Da Fibroblasten ein signifikantes Wachstum Vorteil haben, werden die Fibroblasten im Laufe der Zeit überwuchern die PASMC auf Platte Null. Aus diesem Grund ist die Platte Null verworfen, sobald es klar getrennt PASMC auf den nachfolgenden Platten sind. Nach Pooling, die Bevölkerungvon PASMC ist> 90% PASMC die sowohl α-smooth muscle Myosin und Desmin (Abbildung 2) positive Fleck. Wenn bei 20X abgebildet werden mehrere spindelförmige Zellen gesehen, die mit einer glatten Muskelzelle Phänotyp (Abbildung 2A). Wenn bei höherer Vergrößerung (40X) abgebildet wird, sind die lamellopodia der Vorderkante von einzelnen Zellen sichtbar, wie sie wachsen und wandern zur anderen glatten Muskelzellen in der Schale (2B).
Phosphodiesterase 5 (PDE5) ist in PASMC und hydrolysiert cGMP, ein wichtiger Mediator der Gefäßtonus in inaktive GMP ausgedrückt. Abnahme der PDE5 spielt eine kritische Rolle in der normalen pulmonalvaskulären Übergang nach der Geburt. In großen Tiermodellen wird PDE5 entwicklungspolitisch über Schwangerschaft reguliert, und ihre Expression und Aktivität deutlich fallen nach der Geburt 27. Um zu bestätigen, dass diese isolierten PASMC ein Phänotyp im Einklang mit ihrer Entwicklungsstufe zu behalten, untersuchten wir PDE5 enzYME Aktivität in der Maus PASMC von P7, P14, P21 und Mäuse sowie erwachsenen Mäusen isoliert. Wir sehen die höchsten Ebenen der PDE5-Aktivität in der PASMC von P7 Mäusen isoliert. Diese Ebenen fallen in der PASMC von P14 und P21 Mäusen isoliert. Die niedrigsten Werte von PDE5-Aktivität sind in der PASMC von erwachsenen Mäusen (Abbildung 3) getrennt notiert.
Abbildung 1. Neonatal PASMC lichtmikroskopisch. PASMC visualisiert mit einem Lichtmikroskop bei 20-fach. A) Am dritten Tag des Protokolls, spindelförmige PASMC gesehen kann die Migration von dem schwarzen Eisen gefüllten kleinen PA auf das Gewebe Kulturschale werden. B) Am Tag nach vierzehn Pooling kann eine Bevölkerung von PASMC am Gewebekulturschale gesehen werden.
Abbildung 2. Neonatal PASMC Positiv Stain für Smooth Muscle Markers. PASMC auf Kollagen-behandelten Deckgläschen ausplattiert, in 4% Formaldehyd und permeabilisiert mit 0,2% Triton-X wie bisher 7,23 beschrieben. A) PASMC von P7, P14, P21 und Mäuse wurden mit Anti-Desmin (1:200 Verdünnung) oder anti-Myosin der glatten Muskulatur (1:2000 Verdünnung) in 5% BSA, von Rhodamin-Anti-Kaninchen-sekundären bei einer 1:200-Verdünnung gefolgt gefärbt. Fluoreszenz visualisiert wurde mit einem Epifluoreszenzmikroskop bei 20X. B) PASMC von P14, P21 und Mäusen, die mit anti-smooth muscle Myosin oder Desmin wie oben gefärbt wurden, und die Fluoreszenz wurde wie oben bei 40X visualisiert.
Abbildung 3. Phosphodiesterase 5 (PDE5) Aktivität istEntwicklungspolitisch in PASMC geregelt. PASMC wurden insgesamt Protein geerntet und auf PDE5 enzymatische Aktivität wie zuvor beschrieben mit einem handelsüblichen kolorimetrischen zyklische Nukleotid-Phosphodiesterase-Assay-Kit 7. Jede Probe wurde ± Sildenafil (100 nM) zu lesen. Die Differenz zwischen dem pmol cGMP hydrolysiert pro mg Gesamtprotein pro Minute ± Sildenafil stellt die PDE5-spezifischen cGMP-hydrolytische Aktivität besitzt. N = 4 für P7 PASMC, n = 10 für P14 PASMC, n = 4 für P21 PASMC und n = 8 für Erwachsene PASMC. * P <0,05 im Vergleich zu P7 PASMC, # p <0,05 im Vergleich zu P14 PASMC.
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Discussion
In diesem Manuskript, beschreiben wir zum ersten Mal die Isolierung PASMC von Mäusen auf P7, P14, P21 und. Um dies zu erreichen, wird eine Aufschlämmung von Agarose und 0,2 uM Eisenteilchen durch die RV in die PA infundiert. Aufgrund der geringen Größe der Eisenpartikel, können sie nicht durch die pulmonalen Kapillaren Bett hindurch und werden somit in der kleinen PA abgelegt. Die Lungen werden aufgeblasen, entfernt und distanziert. Die Eisen-enthaltende Gefäße aus der Lösung unter Verwendung eines Magneten angezogen. Letztlich werden die Gefäße in eine Gewebekultur-Schale ausgestrichen, und Zellen wandern von den Schiffen und auf der Kulturplatte. Die anfängliche Platte von Zellen ist ein Gemisch von Fibroblasten und PASMC und der Pull-down-Verfahren wird mehrmals wiederholt, um daraus eine angereicherte Population PASMC. Mit längerer Exposition auf einem hohen Niveau, es ist ein theoretisches Risiko, dass Resteisen kann das Redox-Gleichgewicht in den isolierten Zellen auswirken. So wird darauf im letzten Schritt unternommen, um das gesamte restliche Eisen zu entfernenvor Bündelung und Vermehrung der Zellen. Immunfärbung für α-smooth muscle Myosin und Desmin wird getan, um sicherzustellen, dass das angereicherte Bevölkerung> 90% PASMC ist. Diese Zellen haben PDE5 enzymatische Aktivität, die mit einer glatten Gefäßmuskelzellen Phänotyp. Interessanterweise ist die PDE5 Enzymaktivität in unterschiedlichen PASMC von Mäusen unterschiedlichen Alters isoliert, was darauf hindeutet Fortsetzung Entwicklungsstörungen Vorschrift im PASMC nach der Isolierung.
Während diese Technik ist intellektuell sehr einfach, ist ein häufiges Problem der geringen Ausbeute PASMC. Es kann mehrere Gründe für dieses Problem, auch wenn 2-3 Mäusen zusammen gebündelt sind. Zuerst wird der beste Zellausbeute erreicht werden, wenn die Isolierung Verfahren wird unmittelbar nach der Maus erliegt der Isofluran Überdosierung eingeleitet. Sobald der Tod eingetreten, Mikro-Thromben Form in der gesamten Gefäßsystem. Diese Blutgerinnsel in der Lungengefäßsystems werden die Eisenpartikel ab, in wie viele kleine PA zu verhindern, wodurch deErhöhen der Ausbeute. Auch wird die Lebensfähigkeit der isolierten PASMC von größerer Bedeutung, je länger die Maus ist tot vor der Isolierung. Die absolute wichtiger Schritt, die PASMC Ausbeute auswirkt ist die Eisen-Infusion. Wenn die Lunge nicht merklich grau nach dem Eisen-Infusion sind die möglichen Gründe: 1) das Eisen wird in den rechten Vorhof und in der Leber, 2 retrograde) gibt es Loch oder Riss in der RV, oder 3) gibt es Mikro-Klumpen im Lungenkreislauf irgendwo verhindert gute Eisen-Infusion. Schließlich haben wir festgestellt, dass PASMC aus verschiedenen gentechnisch veränderten Stämme von Mäusen isoliert auffallend unterschiedliche Wachstumsraten weisen in Kultur nach der Isolierung. Deshalb, wenn erste Versuch dieser Technik, ist es am besten, einen Wildtyp-Stamm von Mäusen verwenden.
Offensichtlich ist die Kontamination ein Problem jederzeit ein Isolieren von Zellen aus einer ganzen Tier. Alle Instrumente sterilisiert und mit Alkohol abgewischt vor dem Eingriff, und dann, wenn die Herz-Lungen-bloc entfernt wird, all die nachfolgenden Schritte in einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Bedingungen durchgeführt. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen zusammen mit Antibiotika-enthaltende Medien hat praktisch jede Verunreinigung beseitigt.
Bei der Isolierung eines primären Zelllinie, gibt es Bedenken, wie lange eine Zelle ihre Phänotyp in Kultur zu halten. Schafe FPASMC von Kontrolle und PPHN Lämmer isoliert behalten ihre glatten Muskulatur Phänotyp für 8 und 5 Passagen bzw. 7,14. Für die Maus PASMC, beginnen die Zellen zu Signalantwort durch den Durchgang 5 und glatten Muskelzellen Marker von Kanal 7 (Daten nicht gezeigt) zu verlieren. Dies zeigt eine der Grenzen dieses Verfahrens. Mehrere Mäuse werden benötigt, um kleine Mengen von Zellen zu erreichen, und die Zeit von der Trennung, um genügend Zellen für Experimente ist lang, 2-4 Wochen, abhängig von der Anzahl der Zellen benötigt. Schließlich, sobald Zellen isoliert werden, man muss nur drei Passagen mit ihnen zu arbeiten, bevor sie ihre glatten Muskelzellen signalisiert verlierenAntworten. Ein möglicher Bereich für Verbesserungen wäre ein Verfahren, bei dem diese Zellen eingefroren und konnte erfolgreich von flüssigem Stickstoff gewonnen entwickeln. Dies würde es ermöglichen ein Labor regelmäßig machen und einfrieren Zellen als Mäuse zur Verfügung stehen, und dann konnten die Ermittler auftauen und nutzen die Zellen für die Experimente benötigt.
Trotz der technischen Herausforderung der Durchführung der Isolation und den langen Zeitrahmen für Isolation, stellen diese PASMC ein neues und wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Signalwegen in der sich entwickelnden Maus Lungengefäßsystems. Wir glauben, dass diese Technik für die Neugeborenen-Maus PASMC isolieren wird für die erweiterte Untersuchung der wichtigsten Signalwege in der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie, die zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankung führen wird und damit für die Entwicklung neuer Behandlungen beteiligt zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH HL109478 (KNF) unterstützt. Die Autoren danken und danke Gina Kim und Joann Taylor für ihre Unterstützung bei der Isolierung und die Aufrechterhaltung der PASMC in Kultur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
References
- Levin, D. L., Rudolph, A. M., Heymann, M. A., Phibbs, R. H. Morphological development of the pulmonary vascular bed in fetal lambs. Circulation. 53, 144-151 (1976).
- Walsh-Sukys, M. C., et al. Persistent pulmonary hypertension of the newborn in the era before nitric oxide: practice variation and outcomes. Pediatrics. 105, 14-20 (2000).
- Khemani, E., et al. Pulmonary artery hypertension in formerly premature infants with bronchopulmonary dysplasia: clinical features and outcomes in the surfactant era. Pediatrics. 120, 1260-1269 (2007).
- Jobe, A. H., Bancalari, E.
- Mourani, P. M., Sontag, M. K., Younoszai, A., Ivy, D. D., Abman, S. H. Clinical utility of echocardiography for the diagnosis and management of pulmonary vascular disease in young children with chronic lung disease. Pediatrics. 121, 317-325 (2008).
- Check, J., et al. Fetal growth restriction and pulmonary hypertension in premature infants with bronchopulmonary dysplasia. J. Perinatol. , (2013).
- Farrow, K. N., et al. Hyperoxia increases phosphodiesterase 5 expression and activity in ovine fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Circ. Res. 102, 226-233 (2008).
- Aschner, J. L., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances dilation of newborn piglet pulmonary arteries. Am. J. Physiol. 277, 371-379 (1999).
- Cornfield, D. N., Stevens, T., McMurtry, I. F., Abman, S. H., Rodman, D. M. Acute hypoxia increases cytosolic calcium in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. 265, 53-56 (1993).
- Bailly, K., Ridley, A. J., Hall, S. M., Haworth, S. G. RhoA activation by hypoxia in pulmonary arterial smooth muscle cells is age and site specific. Circ. Res. 94, 1383-1391 (2004).
- Black, S. M., DeVol, J. M., Wedgwood, S. Regulation of fibroblast growth factor-2 expression in pulmonary arterial smooth muscle cells involves increased reactive oxygen species generation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294, 345-354 (2008).
- Cogolludo, A., Moreno, L., Lodi, F., Tamargo, J., Perez-Vizcaino, F. Postnatal maturational shift from PKCzeta and voltage-gated K+ channels to RhoA/Rho kinase in pulmonary vasoconstriction. Cardiovasc. Res. 66, 84-93 (2005).
- Wedgwood, S., et al. Hydrogen peroxide regulates extracellular superoxide dismutase activity and expression in neonatal pulmonary hypertension. Antiox. Signal. 15, 1497-1506 (1089).
- Farrow, K. N., et al. Mitochondrial oxidant stress increases PDE5 activity in persistent pulmonary hypertension of the newborn. Respir. Physiol. Neurobiol. 174, 272-281 (2010).
- Chester, M., et al. Cinaciguat, a soluble guanylate cyclase activator, augments cGMP after oxidative stress and causes pulmonary vasodilation in neonatal pulmonary hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 301, 755-764 (2011).
- Konduri, G. G., Bakhutashvili, I., Eis, A., Gauthier, K. M. Impaired voltage gated potassium channel responses in a fetal lamb model of persistent pulmonary hypertension of the newborn. Pediatr. Res. 66, 289-294 (2009).
- Olschewski, A., et al. Contribution of the K(Ca) channel to membrane potential and O2 sensitivity is decreased in an ovine PPHN model. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1103-L1109 (2002).
- Aslam, M., et al. Bone marrow stromal cells attenuate lung injury in a murine model of neonatal chronic lung disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 1122-1130 (2009).
- Balasubramaniam, V., et al. Bone marrow-derived angiogenic cells restore lung alveolar and vascular structure after neonatal hyperoxia in infant mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 298, L315-L323 (2010).
- de Visser, Y. P., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition attenuates pulmonary inflammation in neonatal lung injury. Eur. Respir. J. 31, 633-644 (2008).
- de Visser, Y. P., et al. Sildenafil attenuates pulmonary inflammation and fibrin deposition, mortality and right ventricular hypertrophy in neonatal hyperoxic lung injury. Respir. 10, 30 (2009).
- Ladha, F., et al. Sildenafil improves alveolar growth and pulmonary hypertension in hyperoxia-induced lung injury. Am. Respir. Crit. Care Med. 172, 750-756 (2005).
- Farrow, K. N., et al. Brief hyperoxia increases mitochondrial oxidation and increases phosphodiesterase 5 activity in fetal pulmonary artery smooth muscle cells. Antioxid. Redox Signal. 17, 460-470 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, 526-535 (2010).
- Waypa, G. B., et al. Superoxide Generated at Mitochondrial Complex III Triggers Acute Responses to Hypoxia in the Pulmonary Circulation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 424-432 (2013).
- Marshall, C., Mamary, A. J., Verhoeven, A. J., Marshall, B. E. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15, 633-644 (1996).
- Farrow, K. N., et al. Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).
