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Biology

नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव

Published: October 19, 2013 doi: 10.3791/50889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

हम जिससे नवजात की चिकनी पेशी सेल संकुचन और विश्राम में शामिल संकेत दे रास्ते का बेहतर अध्ययन की अनुमति, एक उपन्यास और P7 के रूप में युवा के रूप में चूहों से फेफड़े के धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों (PASMC) को अलग करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक विकसित की है.

Abstract

पल्मोनरी हाइपरटेंशन रुग्णता और शिशुओं में मृत्यु दर का एक महत्वपूर्ण कारण है. ऐतिहासिक, भ्रूण भेड़ से PASMC में संवहनी चिकनी मांसपेशी संकुचन में शामिल संकेत दे रास्ते के महत्वपूर्ण अध्ययन किया गया है. भेड़ अवधि फेफड़े के उच्च रक्तचाप का एक शानदार मॉडल बना है, वे बहुत महंगे हैं और चूहों में पाया आनुवंशिक हेरफेर के लाभ की कमी है. इसके विपरीत, चूहों से PASMC अलग करने की अक्षमता है कि प्रणाली के एक महत्वपूर्ण सीमा थी. यहाँ हम मार्शल एट अल के पहले वर्णित तकनीक का एक परिवर्तन का उपयोग P7, P14, और p21 चूहों से माउस PASMC के प्राथमिक संस्कृतियों के अलगाव का वर्णन किया. 26 पहले से चूहा PASMC अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ये murine PASMC नवजात की अवधि में संकेत दे रास्ते के अध्ययन के लिए एक उपन्यास उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. संक्षेप में, 0.5% की एक घोल (w / v) agarose + M199 मीडिया में 0.5% लोहे के कणों सही वेंट्रिकल (आर.वी.) के माध्यम से फेफड़े संवहनी बिस्तर में संचार होता है.लोहे के कण व्यास में 0.2 माइक्रोन हैं और फेफड़े केशिका बिस्तर के माध्यम से पारित नहीं कर सकते हैं. इस प्रकार, छोटे फेफड़े धमनियों (पीए) में लोहे लॉज. फेफड़ों को हटा दिया है और अलग agarose, साथ फुलाया जाता है. लौह युक्त जहाजों एक चुंबक के साथ नीचे खींच रहे हैं. Collagenase (80 यू / एमएल) के उपचार और आगे हदबंदी के बाद, जहाजों संस्कृति पकवान पर सेल प्रवास की अनुमति के लिए 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और एंटीबायोटिक दवाओं (M199 पूरा मीडिया) युक्त M199 मीडिया में एक ऊतक संस्कृति डिश में डाल रहे हैं . कोशिकाओं के इस प्रारंभिक प्लेट fibroblasts और PASMC की एक 50-50 मिश्रण है. इस प्रकार, प्रक्रिया नीचे खींच एक अधिक शुद्ध PASMC जनसंख्या को प्राप्त करने और किसी भी अवशिष्ट लोहा निकालने के लिए कई बार दोहराया है. चिकनी पेशी सेल पहचान चिकनी पेशी मायोसिन और desmin लिए immunostaining द्वारा पुष्टि की है.

Introduction

नाल गैस विनिमय के प्रमुख अंग के रूप में कार्य करता है और हृदय उत्पादन का केवल 10% फेफड़े संवहनी बिस्तर के माध्यम से वितरित किया जाता है के बाद से पल्मोनरी हाइपरटेंशन अंतर्गर्भाशयी जीवन के दौरान सामान्य है. गर्भ में, फेफड़े के दबाव ऊंचा फेफड़े संवहनी प्रतिरोध के कारण प्रणालीगत दबावों के समान हैं . गर्भ की प्रगति, फेफड़ों के भीतर छोटे पीए का तेजी से विकास जन्म 1 पर होता है कि फेफड़े के रक्त प्रवाह में नाटकीय वृद्धि के लिए भ्रूण की तैयारी है. सामान्य प्रसवकालीन संक्रमण निकट अवधि और पूरी अवधि के शिशुओं में विफल रहता है, परिणाम (PPHN) नवजात की लगातार फेफड़े के उच्च रक्तचाप है. PPHN कई अलग अलग अंतर्निहित विकृतियों के कारण एक नैदानिक ​​सिंड्रोम है. हालांकि, इन शिशुओं के सभी तरह के धमनी वाहीनी के रूप में या के लिए लगातार भ्रूण कनेक्शन भर में इस तरह ऊंचा फेफड़े संवहनी प्रतिरोध, hypoxemia, और रक्त प्रवाह के दाएँ से बाएँ shunting के रूप में आम pathophysiologic सुविधाओं को साझाओवेल आमीन. PPHN 1000 जीवित जन्मों प्रति 2-6 प्रभावित करता है और मृत्यु दर के रूप में भी महत्वपूर्ण अल्पकालिक और दीर्घकालिक रुग्णता 2 के एक 8-10% खतरा बता देते हैं. इसके अतिरिक्त, बहुत जन्म के समय कम वजन के समय से पहले बच्चों को उनके अंतर्निहित फेफड़ों के रोग का एक परिणाम के रूप में फेफड़े के उच्च रक्तचाप का विकास हो सकता है. समय से पहले बच्चों की सबसे आम अंतर्निहित फेफड़ों के रोग ब्रोन्कोपल्मोनरी डिस्प्लासिया (बीपीडी) है. बीपीडी की कुल जोखिम गर्भावधि उम्र और वजन जन्म के साथ संबद्ध जबकि इन शिशुओं की एक सबसेट महत्वपूर्ण पल्मोनरी हाइपरटेंशन और कैसे उचित रूप से इन शिशुओं के इलाज के लिए विकसित क्यों, यह स्पष्ट नहीं हुआ है. लंबे समय तक अस्पताल रहता है और वृद्धि की मृत्यु सहित गरीब परिणामों, 3-6 आम हैं.

ऐतिहासिक, स्वस्थ पशुओं से ovine भ्रूण PASMC या सुअर का भ्रूण PASMC जन्म के बाद सामान्य फेफड़े संवहनी संक्रमण में शामिल संकेत दे रास्ते अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये आम तौर पर एक से पांचवीं पीढ़ी के प्रतिरोध पीए से अलग कर रहे हैंएन ovine या किसी भी सहज श्वसन 7-9 से पहले वितरित और euthanized है कि सुअर का भ्रूण. इसके अतिरिक्त, कुछ जांचकर्ताओं अलग और थोड़ा पुराने से PASMC उपयोग किया और अनायास 3 दिन, 2 दिन, और 4 सप्ताह 10-12 में भेड़ के बच्चे और piglets सांस लेने की है. अभी हाल ही में कुछ समूहों को सफलतापूर्वक अलग किया और रोग राज्य 13-17 में संकेत दे रास्ते में derangements जांच करने के लिए PPHN के साथ भेड़ के बच्चे से अलग PASMC का उपयोग किया है. इन कोशिकाओं को संकेत दे रास्ते सामान्य और रोगग्रस्त निकट अवधि और अवधि फेफड़े vasculature को दोनों में महत्वपूर्ण हैं जो जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हुई है. हालांकि, वे फेफड़े के उच्च रक्तचाप के साथ समय से पहले बच्चों में प्रभावित संकेत दे रास्ते में अंतर्दृष्टि देना नहीं है. न ही वे रोग के माउस मॉडल में देखा आनुवंशिक हेरफेर की संभावनाओं की अनुमति है.

चूहा और माउस मॉडल लंबी मॉडल बीपीडी के लिए इस्तेमाल किया गया है और हाल ही में मॉडल फेफड़े लुका करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा हैबीपीडी 18-22 से उत्पन्न pertension. नवजात चूहों उनके बड़े आकार के कारण के साथ काम करने के लिए मोहक हैं, लेकिन वे भी आनुवंशिक संशोधन के लिए क्षमता की कमी से पीड़ित हैं. आनुवांशिक रूप से संशोधित जानवरों को बड़े पैमाने पर नवजात चूहों में पूरे पशु शरीर क्रिया विज्ञान पर विशेष जीन लक्ष्य के प्रभाव की जांच करने के लिए, लेकिन कोई भी पहले से सफलतापूर्वक इन छोटे चूहों से PASMC अलग है तिथि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. PASMC को अलग करके, अधिक से अधिक जानकारी के रास्ते में पर्यावरण उत्तेजनाओं और / या पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों में विशेष रूप से आनुवंशिक संशोधन के जवाब में बदलने के बारे में कैसे प्राप्त किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, जीना PASMC जैसे कैल्शियम और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 23-25 ​​के रूप में महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं में तेजी से बदलाव की जांच करने के लिए वास्तविक समय में imaged किया जा सकता है. हमने हाल ही में मार्शल एट अल की तकनीक का एक परिवर्तन का उपयोग वयस्क चूहों से PASMC के सफल अलगाव का वर्णन किया. 26 चूहा PASMC 23,25,26 को अलग किया. हम अब एक ढाल लियाएन डी 7-21 दिनों उम्र के छोटे चूहों (पी 7, P14, और p21) करने के लिए इस तकनीक का विस्तार किया. इस नए PASMC अलगाव तकनीक को प्राथमिक सीमा यह प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए कई चूहों की आवश्यकता है और कोशिकाओं प्राथमिक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की विशेषता है, जो बहुत धीरे धीरे बढ़ता है कि है. इन सीमाओं के बावजूद, हम नवजात माउस PASMC अलग करने के लिए इस तकनीक का फेफड़े के उच्च रक्तचाप के विकास में शामिल है और इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है कुंजी संकेत दे रास्ते की बढ़ी जांच के लिए अनुमति देगा.

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Protocol

नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति इस प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी.

1. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - दिन एक

  1. 100 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता = 20%) गर्मी निष्क्रिय FBS और 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता = 1%) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मिक्स 400 मिलीलीटर M199 - पूरा M199 मीडिया की तैयारी.
  2. 5 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता = 1%) पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मिक्स 500 मिलीलीटर M199 - सीरम मुफ्त M199 मीडिया की तैयारी.
  3. मिक्स 0.05 छ agarose प्लस 10 मिलीलीटर बाँझ, सीरम मुक्त M199 मीडिया में 0.05 छ लोहे के कणों - पीए agarose तैयार.
  4. 10 मिलीलीटर बाँझ, सीरम मुक्त M199 मीडिया में मिक्स 0.1 ग्राम agarose - फेफड़े agarose तैयार.
  5. बाँझ फिल्टर इस मिश्रण तो 80 यू / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में बाँझ, सीरम मुक्त M199 मीडिया में मिक्स collagenase और - Collagenase तैयार. माउस euthanizing से पहले समय से आगे उपकरणों के सभी सेट करें.
  6. माउस euthanizing से पहले सही फोड़ा करने के पीए agarose और फेफड़ों agarose सेट करें.
  7. Isoflurane के साथ अति संवेदनाहारी जार में माउस euthanize और isoflurane के साथ संपर्क में आने के लिए माउस पिल्ला अनुमति देने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. सबसे अच्छा सेल उपज कोशिकाओं मौत के बाद प्रचलन में है कि फार्म सूक्ष्म थक्के से बचने के क्रम में मौत के तुरंत बाद काटा जाता है जब प्राप्त की है.
  8. संवेदनाहारी जार से माउस निकालें, संचालन बोर्ड के लिए माउस को सुरक्षित, और माउस, उपकरण, और शराब के साथ दस्ताने बाँझ.
  9. ब्लेड के साथ छुरी लोड और गर्दन से अवर पेट के लिए माउस को काटकर अलग कर देना.
  10. माउस के बाईं ओर पेट खोलें, गुर्दे का पर्दाफाश, और माउस जिससे फेफड़ों की छोटी वाहिकाओं में थक्के से परहेज, रक्तहीन करने के लिए अनुमति देने के लिए गुर्दे की धमनी में कटौती.
  11. के माउस के बाईं ओर के साथ कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करेंउरोस्थि छाती खोलने के लिए.
  12. ध्यान से दोनों पक्षों पर डायाफ्राम कटौती और पूरी तरह से छाती गुहा को खोलने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें. छाती गुहा खुला रखने के लिए संदंश या पिन का उपयोग करें.
  13. अथॉरिटी की ओर निर्देशित एक 27 जी आधा इंच सुई के साथ आर.वी. चिपके रहते हैं और फेफड़ों (सभी रक्त फेफड़े के प्रचलन से बाहर प्लावित) सफेद दिखाई देते हैं जब तक बाँझ पीबीएस के साथ आर.वी. / पीए / फेफड़ों छिड़कना. यह माउस के आकार के आधार पर पीबीएस के लगभग 3-5 मिलीलीटर ले जाएगा. यह छोटे फेफड़ों वाहिकाओं में थक्का बनने से रोकने के लिए पहली बार फ्लश करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  14. ध्यान ट्रेकिआ और धागा एक सीवन नीचे का पर्दाफाश करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें.
  15. समर्थन के लिए ट्रेकिआ के नीचे छोटी संदंश रखो और श्वासनली में 24 जी angiocatheter जगह है. एक चतुर्थ रखने के रूप में यदि angiocatheter रखें.
  16. कदम 1.16 में पिरोया सीवन के साथ श्वासनली में angiocatheter सुरक्षित.
  17. उबलते पानी से बाहर उबलते पीए agarose लो, और अच्छी तरह से मिश्रण को पलटना. Agaro कूलसे बर्फ पर घूमता द्वारा लगभग शरीर के तापमान को. agarose समाधान में रहते हैं, लेकिन यह पीए की कोशिकाओं को नुकसान होगा कि इतना गर्म नहीं होना चाहिए.
  18. एक 27 जी आधा इंच सुई के साथ आर.वी. चिपके रहते हैं और फेफड़ों ग्रे दिखाई देते हैं जब तक पीए agarose के साथ आर.वी. / पीए / फेफड़ों छिड़कना. agarose मिश्रण में लोहे के कण फेफड़ों रंग में ग्रे प्रकट कर देगा. यह माउस के आकार पर निर्भर करता है पीए agarose के लगभग 3-5 मिलीलीटर ले जाएगा. यह लोहे के वायुमार्ग में रिसाव के कारण हो सकता है बहुत तेजी से इंजेक्शन लगाने के रूप में धीरे धीरे जाने के लिए भी महत्वपूर्ण है.
  19. उबलते पानी के फेफड़ों agarose के बाहर ले जाओ और अच्छी तरह से मिश्रण को पलटना. फिर बर्फ पर घूमता द्वारा लगभग शरीर के तापमान को agarose शांत. agarose समाधान में रहते हैं, लेकिन यह फेफड़ों की कोशिकाओं को नुकसान होगा कि इतना गर्म नहीं होना चाहिए.
  20. फेफड़ों agarose ड्रा और श्वासनली में 24 जी angiocatheter के लिए सिरिंज देते हैं. पूरी तरह से फेफड़ों में हवा को ट्रेकिआ के माध्यम से agarose दिखे. फेफड़ों easie होगाआर फेफड़ों उचित रूप से फुलाया जाता है (जो बाद में कदम देखें) कीमा.
  21. दिल फेफड़ों गुट निकालें, और डूब यह agarose (~ 5 मिनट) जमना करने के लिए बर्फ का ठंडा पीबीएस के 25 मिलीलीटर में. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को साफ करने के लिए इस समय का उपयोग करें.
  22. नवजात चूहों के लिए (पी 7-P21), सर्वश्रेष्ठ PASMC उपज कोशिकाओं के एक बैच में 2-3 पिल्ले के संयोजन से आता है. PASMC इष्टतम सेल स्वास्थ्य और विकास के लिए अन्य कोशिकाओं के साथ संपर्क में होना पसंद करते हैं. एक माउस अलगाव प्रति प्रयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को बहुत विरल हैं और अच्छी तरह से जाना नहीं है. एक साथ जानवरों, फसल और सर्द दिल फेफड़ों ब्लॉक के संयोजन और सभी दिल फेफड़ों ब्लॉक जानवरों से हटा दिया गया है एक बार फिर क़ीमा के लिए ले जाते हैं.
  23. इस बिंदु से आगे बाँझपन के लिए सेल कल्चर हुड में ले जाएँ.
  24. 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के ढक्कन में ठंडा फेफड़ों प्लेस और ध्यान से दिल, थाइमस, ट्रेकिआ और फेफड़ों से किसी भी संयोजी ऊतक को हटा दें.
  25. 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान की तह तक फेफड़ों ले जाएँऔर लगभग 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड बाँझ पीबीएस जोड़ें.
  26. 2 नलियां साथ बहुत छोटे टुकड़ों (1-2 मिमी) में फेफड़ों क़ीमा.
  27. एक बाँझ 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के बंद टिप तोड़ो. पिपेट बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में फेफड़ों के घोल कीमा बनाया. फेफड़े के ऊतकों के सभी 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में हो जाता है कि बीमा करने के लिए थाली धोने के लिए अतिरिक्त बाँझ ठंडा पीबीएस का प्रयोग करें.
  28. चुंबक पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब रखें. लौह युक्त ऊतक चुंबक के बगल में ट्यूब के पक्ष को स्थानांतरित करने के लिए प्रतीक्षा करें. फेफड़े के ऊतकों को लौह युक्त पोत के अनुपात के आधार पर जहाजों में से कुछ अभी भी इस बिंदु पर चल जा सकता है. यह वाहिकाओं होता अगर यह स्पष्ट नहीं है के बाद से पीबीएस धीरे और सावधानी से चल फेफड़े के ऊतकों महाप्राण के लिए नहीं की कोशिश कर बंद महाप्राण.
  29. फिर से aspirated है कि फेफड़े के ऊतकों की मात्रा को कम करने की कोशिश कर, 5 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ फेफड़ों गोली 3x धो लें.
  30. 3 मिलीग्राम collagenase में फेफड़ों गोली Resuspend और 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान में डाल देना. मत करोइस पिपेट की कोशिश, फेफड़ों हिस्सा अपने पिपेट के इंटीरियर के लिए रहना होगा.
  31. गिरने के बाद ट्यूब कुल्ला, और साथ ही 60 मिमी टिशू कल्चर डिश में इस डाल करने के लिए एक अतिरिक्त 3 मिलीलीटर का उपयोग करें.
  32. 37 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें.
  33. पिपेट ऊतक + एक 5 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 15 जी कुंद सुई के साथ collagenase घोल ऊपर और नीचे सभी बड़े फेफड़ों के टुकड़े बाधित कर रहे हैं जब तक. ऊतक + collagenase घोल नहीं दिखाई ऊतक मात्रा के साथ इस बिंदु पर बादल होगा.
  34. एक नए बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डालो और चुंबक के लिए देते हैं.
  35. ऊतक के सभी एकत्र किया गया है कि बीमा करने के लिए पूरी M199 मीडिया के लगभग 5 मिलीलीटर के साथ टिशू कल्चर पकवान धो लें, और शंक्वाकार ट्यूब में इस डालना.
  36. Collagenase + मीडिया तैरनेवाला बंद महाप्राण. इस बार बहुत कुछ प्लवमानपिण्ड हो जाएगा, और एक कॉम्पैक्ट लौह युक्त गोली चुंबक के बगल शंक्वाकार ट्यूब के पक्ष में हो जाएगा.
  37. 5 मिलीलीटर पूरा मेड के साथ धोएं3x आइए. इस collagenase निष्क्रिय करने की आवश्यकता है.
  38. पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और लौह युक्त गोली resuspend करने के लिए कई बार ऊपर नीचे मिश्रण और.
  39. एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में resuspended गोली डालो. एक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, पोत लुमेन में निहित लोहे के कणों के साथ आसपास चल छोटे पोत टुकड़े हो जाएगा.
  40. रात में टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर पकवान (थाली शून्य लेबल) रखें. थाली शून्य पर बंद विस्थापित करने के लिए पहली कोशिकाओं चिकनी पेशी मार्करों के लिए धुंधला के आधार पर लगभग 50% fibroblasts और 50% PASMC हैं. यह प्लेट चढ़ाया शून्य कहा जाता है और अंततः बाद के संवर्धन के कदम के बाद खारिज कर दिया है.

2. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - दिवस दो

  1. एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में थाली शून्य से सतह पर तैरनेवाला मीडिया डालो.
  2. मीडिया तैरनेवाला बंद महाप्राण. इस समय वहाँ लगभग कोई प्लवमानपिण्ड हो, और एक कॉम्पैक्ट लौह conta जाएगाining गोली चुंबक के बगल शंक्वाकार ट्यूब की ओर बनेगी.
  3. 5 मिलीलीटर पूरा मीडिया 3x के साथ धोएं.
  4. पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और लौह युक्त गोली resuspend करने के लिए कई बार ऊपर नीचे मिश्रण और.
  5. एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में डालो. एक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, पोत लुमेन में निहित लोहे के कणों के साथ आसपास चल छोटे पोत टुकड़े में देखा जाता है. यह (चित्रा 1 ए) की थाली में से एक होगा.
  6. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर पकवान.

3. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - छह दिन

  1. एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में थाली एक से सतह पर तैरनेवाला मीडिया डालो. इस चरण को कई बार दोहरा पोत की दीवार में निवासी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के सभी एक सेल संस्कृति की थाली पर बंद विस्थापित करने के लिए एक अवसर है कि सुनिश्चित करता. प्रत्येक थाली यानी हर कदम के साथ एक ह्रासमान रिटर्न कम और कम कोशिकाओं पालन करना होगा है.
  2. मीडिया तैरनेवाला बंद महाप्राण. इस समय लगभग कोई प्लवमानपिण्ड हो जाएगा, और एक कॉम्पैक्ट लौह युक्त गोली चुंबक के बगल शंक्वाकार ट्यूब की ओर बनेगी.
  3. 5 मिलीलीटर पूरा मीडिया 3x के साथ धोएं.
  4. पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और लौह युक्त गोली resuspend करने के लिए कई बार ऊपर नीचे मिश्रण और.
  5. एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में डालो. एक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, पोत लुमेन में निहित लोहे के कणों के साथ आसपास चल छोटे पोत टुकड़े में देखा जाता है. यह प्लेट दो हो जाएगा.
  6. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर पकवान.

4. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - डे नौ

  1. टिशू कल्चर पकवान थाली दो से एक साफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया तैरनेवाला डालो.
  2. Refeed पूरा M199 मीडिया के साथ थाली दो, और जगह वापस टिशू कल्चर मेंइनक्यूबेटर.
  3. मीडिया तैरनेवाला बंद महाप्राण. इस समय लगभग कोई प्लवमानपिण्ड हो जाएगा, और एक कॉम्पैक्ट लौह युक्त गोली चुंबक के बगल शंक्वाकार ट्यूब की ओर बनेगी.
  4. 5 मिलीलीटर पूरा मीडिया 3x के साथ धोएं.
  5. पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें और लौह युक्त गोली resuspend करने के लिए कई बार ऊपर नीचे मिश्रण और.
  6. एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में डालो. एक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, पोत लुमेन में निहित लोहे के कणों के साथ आसपास चल छोटे पोत टुकड़े में देखा जाता है. यह प्लेट तीन हो जाएगा.
  7. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर पकवान.

5. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - डे तेरह

  1. 1-3 प्लेटों के मीडिया बंद महाप्राण.
  2. धीरे गर्म, बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  3. कोशिकाओं बंद trypsinize के लिए प्रत्येक थाली को trypsin (~ 0.25-0.5 मिलीलीटर) trypsin की एक पतली फिल्म जोड़ें. कोशिकाओं को बहुत पक्षपाती हैं और ऊतक cultu में trypsin में होने की आवश्यकता होगीथाली से दूर लिफ्ट करने के लिए लगभग 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर पुनः.
  4. किसी भी अवशिष्ट लोहे के कणों को बाहर खींचने के लिए चुंबक से जुड़ी एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 5 मिलीलीटर पूरा मीडिया में प्लेटें बंद हार्वेस्ट कोशिकाओं.
  5. पूरा मीडिया के एक अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर के साथ प्लेटों के प्रत्येक धो लें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कि मीडिया जोड़ें.
  6. इस समय, मीडिया तैरनेवाला (महाप्राण नहीं है) लेते हैं, और लोहे के कण गोली त्यागें.
  7. प्लेट एक 60 मिमी पकवान में 5 मिलीलीटर पूरा M199 मीडिया में कोशिकाओं के कुछ ही दिनों में मिला हुआ कोशिकाओं के लिए है. वैकल्पिक रूप से, थाली 10 मिलीलीटर पूरा M199 एक 10 सेमी थाली में मीडिया, और PASMC में कोशिकाओं संगम तक पहुंचने के लिए लगभग एक और 1-2 सप्ताह का समय लगेगा.

6. नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी अलगाव - डे चौदह

  1. किसी भी अवशिष्ट trypsin दूर करने के लिए नए सिरे से पूरी M199 मीडिया के लिए मीडिया बदलें. टिशू कल्चर पकवान (चित्रा 1 बी) पर PASMC की एक पतली आबादी की जाएगी.

7. नियमित देखभाल

  1. ताजा पूरा M199 मीडिया के लिए मीडिया बदलें लगभग प्रति सप्ताह 2x.
  2. इन कोशिकाओं, trypsin की एक फिल्म में इनक्यूबेटर में लगभग 10 मिनट (0.25-0.5 मिलीग्राम) थाली लिफ्ट बंद करने के लिए कोशिकाओं के बंटवारे की आवश्यकता होती है. Trypsin फिल्म का उपयोग कोशिकाओं नीचे कताई बिना PASMC की replating अनुमति देता है. बहुत ज्यादा trypsin प्रयोग किया जाता है, तो PASMC trypsin के बाहर स्पिन करने के लिए centrifuged किया जाना चाहिए, या कोशिकाओं की थाली के लिए readhere नहीं होगा. कभी कभी, कोशिकाओं नीचे कताई के बाद, यह पूरी M199 मीडिया में resuspended PASMC मिलना बहुत मुश्किल है.
  3. टिप्पणियों में, अलग PASMC 4-5 मार्ग के लिए मज़बूती से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तरह व्यवहार करते हैं, लेकिन चिकनी पेशी सेल बीतने 7 अप करने के लिए मार्कर के लिए अलग कक्षों दाग होगा. मार्ग 2 (trypsin के लिए पहला प्रदर्शन के बाद चढ़ाना) के रूप में दिन तेरह पर पहले जमा 60 मिमी या 10 सेमी थाली गणना.

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Representative Results

अलगाव के दौरान और बाद में, PASMC प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा और चिकनी पेशी सेल मार्कर के लिए immunostaining द्वारा दोनों जांच कर रहे हैं. जल्दी प्रोटोकॉल में प्रकाश माइक्रोस्कोपी करके, PASMC वाहिकाओं (चित्रा 1 ए) युक्त छोटा सा लोहे से टिशू कल्चर पकवान पर पलायन कर देखा जाता है. दिन तेरह पर प्लेटें एक से तीन तक पूलिंग के बाद, फिर लोहे के कणों उन अंतिम पूलिंग चरण में बाहर निकाला गया है के रूप में नहीं देखा जाता है. इसके बजाय, PASMC की आबादी टिशू कल्चर पकवान (चित्रा 1 बी) पर देखा जाता है.

Immunostaining के आधार पर, लौह युक्त वाहिकाओं से विस्थापित कि प्रारंभिक कोशिकाओं लगभग 50% fibroblasts और 50% PASMC (नहीं दिखाया डेटा है) हैं. Fibroblasts के एक महत्वपूर्ण वृद्धि लाभ है, fibroblasts के समय अधिक बढ़ना से अधिक प्लेट शून्य पर PASMC होगा. बाद प्लेटों पर स्पष्ट रूप से अलग PASMC वहाँ एक बार इस कारण से, थाली शून्य खारिज कर दिया है. बाद पूलिंग, आबादीPASMC की α चिकनी पेशी मायोसिन और desmin (चित्रा 2) दोनों के लिए सकारात्मक दाग जो> 90% PASMC है. 20X पर imaged है, जब कई धुरी के आकार की कोशिकाओं को एक चिकनी पेशी सेल phenotype (2A चित्रा) के साथ लगातार देखा जाता है. वे विस्थापित और पकवान (चित्रा 2 बी) पर अन्य चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की दिशा में बढ़ने के रूप में उच्च आवर्धन (40X) पर imaged जब, एकल कक्षों के अग्रणी धार की lamellopodia कल्पना कर रहे हैं.

Phosphodiesterase 5 (PDE5) निष्क्रिय जीएमपी में PASMC और hydrolyzes cGMP, संवहनी टोन की एक प्रमुख मध्यस्थ, में व्यक्त किया है. PDE5 में जन्म के बाद सामान्य फेफड़े संवहनी संक्रमण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है घटाएँ. बड़े पशु मॉडल में, PDE5 विकासात्मक गर्भ में नियंत्रित किया जाता है, और उसकी अभिव्यक्ति और गतिविधि जन्म 27 के बाद नाटकीय रूप से गिर जाते हैं. इन अलग PASMC उनके विकास मंच के साथ एक phenotype लगातार बनाए रखने की पुष्टि करने के लिए, हम PDE5 Enz जांचमाउस PASMC में yme गतिविधि P7, P14, और p21 चूहों, साथ ही वयस्क चूहों से अलग. हम P7 चूहों से अलग PASMC में PDE5 गतिविधि के उच्चतम स्तर देखते हैं. इन स्तरों P14 और P21 चूहों से अलग PASMC में गिर जाते हैं. PDE5 गतिविधि के निम्नतम स्तर पर वयस्क चूहों (चित्रा 3) से अलग PASMC में नोट कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. नवजात PASMC लाइट माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना. PASMC 20X पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए कल्पना कर रहे हैं. प्रोटोकॉल के तीन दिन ए), धुरी के आकार PASMC टिशू कल्चर पकवान पर काले लोहे से भरे छोटे पीए से पलायन कर देखा जा सकता है. बी) पूलिंग के बाद दिन चौदह पर, PASMC की आबादी टिशू कल्चर पकवान पर देखा जा सकता है.

चित्रा 2 चित्रा 2. नवजात PASMC चिकनी पेशी मार्करों के लिए सकारात्मक दाग. PASMC 4% formaldehyde में तय, कोलेजन का इलाज कांच coverslips पर चढ़ाया, और पहले से 7,23 वर्णित के रूप में 0.2% ट्राइटन-X के साथ permeabilized थे. ए) PASMC P7, P14 से, और p21 चूहों विरोधी desmin (1:200 कमजोर पड़ने) या एक 1:200 कमजोर पड़ने पर rhodamine लाल विरोधी खरगोश माध्यमिक द्वारा पीछा 5% BSA में विरोधी चिकनी मांसपेशियों मायोसिन (1:2,000 कमजोर पड़ने) के साथ दाग रहे थे. प्रतिदीप्ति बी) P14 से PASMC, और p21 चूहों के ऊपर के रूप में विरोधी चिकनी मांसपेशियों मायोसिन या desmin साथ दाग रहे थे. 20X पर एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना थी, और रोशनी के रूप में ऊपर 40X में कल्पना की गई थी.

चित्रा 3
चित्रा 3. Phosphodiesterase 5 (PDE5) गतिविधि हैDevelopmentally. PASMC में नियमित PASMC कुल प्रोटीन के लिए काटा गया है और पहले से न्यूक्लियोटाइड एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्णमिति चक्रीय फॉस्फोडाइस्टरेज़ परख किट 7 का उपयोग कर के रूप में वर्णित PDE5 enzymatic गतिविधि के लिए assayed. प्रत्येक नमूना ± sildenafil (100 एनएम) पढ़ा था. प्रति मिनट मिलीग्राम कुल प्रोटीन प्रति pmol cGMP हाइड्रोलाइज्ड ± sildenafil के बीच अंतर PDE5 विशेष cGMP-hydrolytic गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. एन = 4 P7 PASMC के लिए, एन = 10 P14 के लिए PASMC, एन = 4 वयस्क PASMC के लिए P21 PASMC, और एन = 8. * पी <0.05 पी 7 PASMC, # पी <0.05 बनाम P14 PASMC बनाम.

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम पहली बार P7, P14, और p21 में चूहों से PASMC के अलगाव के लिए वर्णन. यह पूरा करने के लिए, agarose और 0.2 माइक्रोन लोहे के कणों का एक घोल देहात में आर.वी. के माध्यम से संचार कर रहे हैं. लोहे के कणों के छोटे आकार के कारण, वे फेफड़े केशिका बिस्तर के माध्यम से पारित नहीं कर सकते हैं और इस प्रकार छोटे अथॉरिटी में जमा कर रहे हैं. फेफड़ों, फुलाया हटा दिया है और अलग कर रहे हैं. लौह युक्त जहाजों एक चुंबक का उपयोग कर समाधान के बाहर खींच रहे हैं. अंत में, जहाजों के एक ऊतक संस्कृति डिश में चढ़ाया, और कोशिकाओं वाहिकाओं से विस्थापित और संस्कृति की थाली पर कर रहे हैं. कोशिकाओं के प्रारंभिक प्लेट fibroblasts और PASMC का एक मिश्रण है, और प्रक्रिया नीचे खींच एक समृद्ध PASMC जनसंख्या प्राप्त करने के लिए कई बार दोहराया है. उच्च स्तर पर लंबे समय तक निवेश के साथ, अवशिष्ट लोहा अलग कक्षों के भीतर redox के संतुलन को प्रभावित कर सकता है कि एक सैद्धांतिक खतरा नहीं है. इस प्रकार, सभी अवशिष्ट लोहा निकालने के लिए अंतिम चरण में ध्यान रखा जाता हैपहले कोशिकाओं पूलिंग और प्रचार करने के लिए. Α चिकनी पेशी मायोसिन और desmin लिए immunostaining समृद्ध आबादी> 90% PASMC है कि पुष्टि करने के लिए किया जाता है. इन कोशिकाओं को एक संवहनी चिकनी मांसपेशी सेल phenotype के साथ संगत, PDE5 enzymatic गतिविधि है. दिलचस्प है, PDE5 एंजाइम गतिविधि अलगाव के बाद PASMC भीतर निरंतर विकास के विनियमन का सुझाव दे, अलग अलग उम्र के चूहों से अलग PASMC में अलग है.

इस तकनीक को बौद्धिक रूप से बहुत सीधा है, वहीं एक आम समस्या PASMC की कम उपज है. 2-3 चूहों एक साथ जमा कर रहे हैं, तब भी जब इस समस्या के लिए कई कारणों से हो सकता है. माउस isoflurane अधिक मात्रा को succumbs के बाद अलगाव की प्रक्रिया तुरंत शुरू की है तो सबसे पहले, सबसे अच्छा सेल उपज हासिल की है. संवहनी बिस्तर भर में एक बार मौत हुई है, सूक्ष्म थक्के फार्म. फेफड़े vasculature में ये थक्के जिससे डे के रूप में कई छोटे देहात में हो रहा से लोहे के कणों को रोकने जाएगापैदावार बढ़ती है. इसके अलावा, पृथक PASMC की व्यवहार्यता अब माउस पूर्व अलगाव के लिए मर चुका है अधिक चिंता का विषय बन जाता है. PASMC उपज को प्रभावित करता है कि पूर्ण महत्वपूर्ण कदम लोहा जान फूंकना है. फेफड़ों लोहा निषेचन के बाद काफ़ी बूढ़ा नहीं कर रहे हैं, तो संभव कारण हैं: 1) लोहा आर.वी. में छेद या आंसू नहीं है, या 3) सूक्ष्म थक्के हैं) सही आलिंद और जिगर, 2 में पतित हो रहा है फेफड़े के संचलन में कहीं अच्छा लोहा निषेचन को रोकने. अन्त में, हम चूहों के विभिन्न आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों से अलग PASMC अलगाव के बाद संस्कृति में आश्चर्यजनक ढंग से विभिन्न विकास दर का प्रदर्शन देखा है. इसलिए, पहली बार इस तकनीक का प्रयास करते हैं, यह चूहों के एक जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है.

जाहिर है, प्रदूषण चिंता का विषय एक एक पूरे जानवर से कोशिकाओं को अलग किया जाता है किसी भी समय है. सभी उपकरणों निष्फल और पोंछा शराब के साथ प्रक्रिया से पहले, और फिर एक बार दिल फेफड़ों गुट अल, निकाल दिया जाता है कर रहे हैंबाद के चरणों के एल बाँझ तकनीक के साथ एक टिशू कल्चर हुड में किया जाता है. एंटीबायोटिक युक्त मीडिया के साथ एक साथ इन सावधानियों का उपयोग वास्तव में किसी भी प्रदूषण को समाप्त कर दिया है.

किसी भी प्राथमिक सेल लाइन के अलगाव के साथ, एक सेल संस्कृति में इसके लक्षण प्रारूप को बनाए रखना होगा कि कितने समय तक के बारे में एक चिंता का विषय है. नियंत्रण और PPHN भेड़ के बच्चे से अलग ovine FPASMC क्रमश: 7,14, 8 और 5 मार्ग के लिए उनकी चिकनी पेशी फेनोटाइप बनाए रखें. माउस PASMC के लिए, कोशिकाओं के पारित होने के 5 और मार्ग 7 (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा चिकनी पेशी मार्कर द्वारा संकेत प्रतिक्रियाओं खोने लगते हैं. यह इस तकनीक की सीमाओं में से एक पर प्रकाश डाला गया. एकाधिक चूहों की कोशिकाओं की छोटी मात्रा में प्राप्त करने की आवश्यकता है, और अलगाव से प्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को समय लंबा है, 2-4 हफ्तों की जरूरत कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है. वे संकेत उनकी चिकनी पेशी सेल खोने से पहले अंत में, एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, एक ही उन लोगों के साथ काम करने के लिए तीन मार्ग हैप्रतिक्रियाओं. सुधार के लिए एक संभावित क्षेत्र में इन कोशिकाओं जमे हुए और तरल नाइट्रोजन से सफलतापूर्वक ठीक किया जा सकता है जिससे एक विधि विकसित करने के लिए किया जाएगा. यह चूहों उपलब्ध हैं, और फिर जरूरत के रूप में जांचकर्ताओं प्रयोगों के लिए कोशिकाओं पिघलना और उपयोग सकता है के रूप में एक प्रयोगशाला नियमित रूप से बनाने के लिए और कोशिकाओं को फ्रीज करने की अनुमति होगी.

अलगाव के लिए अलगाव और लंबे समय प्रदर्शन के तकनीकी चुनौती के बावजूद, इन PASMC विकासशील murine फेफड़े vasculature में संकेत दे रास्ते के अध्ययन के लिए एक उपन्यास और अमूल्य उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम नवजात माउस PASMC अलग करने के लिए इस तकनीक का रोग रोगजनन की बेहतर समझ के लिए नेतृत्व और नए उपचार के विकास के लिए अनुमति देगा जो फेफड़े के उच्च रक्तचाप के विकास में शामिल कुंजी संकेत दे रास्ते की बढ़ी जांच के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच HL109478 (KNF) द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों को अलग और संस्कृति में PASMC बनाए रखने में स्वीकार करते हैं और उनकी सहायता के लिए जीना किम और Joann टेलर धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bard Parker surgical blade handle BD 371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile) Miltex 4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) BD 309657 and 306646
Needles (27 G, sterile) BD 305109
Angiocatheter (24 G, sterile) BD 381412
Monoject blunt cannula (15 G) Kendall SWD202314Z
Sutures Fisher Scientific NC9782896
Dynal magnet particle collector Invitrogen 120-01D This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) BD 353001, 353004, and 353003 Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) American Diagnostic Corporation 3424
Forceps (4 inch stainless steel) Quick Medical L5-5004
D-PBS Mediatech 21-031-CV
M199 media Mediatech 10-060-CV
Penicillin/streptomycin VWR TX16777-164NWU
Fetal bovine serum Hyclone/Thermo Scientific SH3091003 Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder) Aldrich Chemical Company #31,006-9
Agarose Sigma A9539
Collagenase (made to 80 U/ml) Sigma C5138
Isoflurane Butlet Schein NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera Nikon TE2000-U Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody Sigma D-8281 Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin Biomedical Technologies BT-562 Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary Molecular Probes/Invitrogen R-6394 Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera Nikon TE300 Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit Enzo Life Sciences BML-AK800-0001 This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil Sigma PZ-0003 A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.

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References

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बेसिक प्रोटोकॉल अंक 80 बलवान चिकना नाड़ी हृदय असामान्यताएं उच्च रक्तचाप फेफड़े संवहनी चिकनी मांसपेशी पल्मोनरी हाइपरटेंशन विकास phosphodiesterases cGMP immunostaining
नवजात चूहे से पल्मोनरी धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव
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Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (80), e50889, doi:10.3791/50889 (2013).

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