Method Article

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

DOI:

10.3791/50921

⸱

October 30th, 2013

 , 
1Integrated Science Center, Biology Department, The College of William & Mary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التجانس بالضرب حبة هو وسيلة سريعة وفعالة لإطلاق سراح DNA، RNA، البروتينات، ونواتج الأيض من خلايا الخميرة في مهدها، والتي من الصعب بمكان أن يتم تعطيل. نحن هنا وصف استخدام الخالط طاحونة حبة لاستخراج البروتينات في مخازن الأمثل للحفاظ على وظائف، والتفاعلات والتعديلات بعد متعدية من البروتينات. تزرع الخلايا المتنامية غاريثمي التعبير عن بروتين من الفائدة في وسائط النمو السائل في الاختيار. يمكن استكمال وسائل الاعلام النمو مع الكواشف للحث على التعبير البروتين من المروجين محرض (مثل اللبن)، وتزامن مرحلة دورة الخلية (مثل نوكودازول)، أو تثبيط وظيفة proteasome و(على سبيل المثال MG132). الخلايا ثم مكعبات ومعلق في منطقة عازلة مناسبة تحتوي على الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات إنزيم الفوسفاتيز وإما معالجتها فورا أو تجميدها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ويتم إنجاز تجانس من قبل ست دورات من 20 ثانية BEAD-الضرب (5.5 متر / ثانية)، تليها كل واحد الحضانة دقيقة على الجليد. يتم مسح جناسة الناتجة بواسطة الطرد المركزي، ويمكن إزالتها عن طريق الترشيح الجسيمات الصغيرة. وعجلت الناتجة تطهيرها استخراج خلية كاملة (WCE) باستخدام 20٪ TCA للتحليل المباشر من مجموع البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الغربية النشاف. مقتطفات هي أيضا مناسبة لتنقية تقارب من بروتينات معينة، والكشف عن التعديلات بعد متعدية، أو تحليل البروتينات شارك في تنقية. كما هو الحال بالنسبة لمعظم بروتوكولات تنقية البروتين، قد تكون بعض الانزيمات والبروتينات تتطلب الظروف الفريدة أو التراكيب العازلة لتنقية والبعض الآخر قد يكون غير مستقر أو غير قابل للذوبان في إطار الشروط المنصوص عليها. في الحالة الأخيرة، يجوز للبروتوكول المعروضة توفير نقطة انطلاق مفيدة لتحديد تجريبيا أفضل استراتيجية حبة الضرب لاستخراج البروتين وتنقية. نقدم لك مجموعة من استخراج وتنقية حاتمة الموسومة السومو E3 يغاز، Siz1، دورة الخليةتنظم البروتين الذي يصبح كلا sumoylated وفسفرته، فضلا عن السومو استهداف اليوبيكويتين الوحيدات يغاز، Slx5.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قوة رهيبة من الخميرة علم الوراثة هو الأسطوري، ولكن إعداد وتحليل البروتينات الأم من الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، غالبا ما يكون محفوفا بالمشاكل. ويرجع ذلك إلى قوة ميكانيكية كبيرة ومرونة جدار خلية الخميرة 1 هذا الأخير. وقد وصفت وسائل مختلفة لالأنزيمية والكيميائية والميكانيكية، والقائم على الضغط تعطيل خلايا الخميرة للحصول على مستخلص بروتين كامل الخلية 2-6. هذه التقنيات تختلف على نطاق واسع في فعاليتها لانتاج الخلايا ممثل وعصائر البروتين الأصلية التي يمكن استخدامها لتحليلات لاحقة أو خطوات تنقية. على سبيل المثال، يمكن إزالة جدار خلية الخميرة مع الانزيمات التحللي (على سبيل المثال zymolyase) وا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنقية البروتينات 6xHIS الموسومة أعرب في خلايا الخميرة في مهدها في ظل ظروف الأم

1. نمو خلايا الخميرة وتحريض من بروتين تعبير

(تم التعديل من 2)

اختياري: استخدم غاريثمي تزايد الثقافات الخميرة معربا عن بروتين من الفائدة بدلا من الثقافات الجالاكتوز التي يسببها هو موضح أدناه.

  1. تحويل خلايا من غال + سلالة الخميرة مع ترميز البلازميد والجالاكتوز محر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتائجنا ممثل تكشف عن أن بروتوكول استخراج حبة الضرب والبروتين وصف مفيد لإعداد استنساخه من البروتينات لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب (تلخيصها في الجدول رقم 2). SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie من WCEs تبين أن مجموعة واسعة من البروتينات (~ 12 ل> 250 كيلو دالتون) ويمكن استخراج بتكاثر من خلايا الخميرة (الشكل 1A). نطاقات منفصلة على مجموعة من الأوزان الجزيئية تدل على ارتفاع مقتطفات البروتين الجودة. ويمكن التأكد من نوعية مقتطفات عن طريق ويسترن النشاف .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويركز هذا البروتوكول على إعداد سليمة، والأم، وتعديلها بعد translationally البروتينات من خلايا الخميرة في مهدها لتطبيقات أسفل تيار. قبل محاولة هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف عن البروتين بسهولة في مقتطفات أعدت في ظل ظروف تغيير طبيعة 12. إذا الأجسام المضادة ليست متاحة أنه قد يكون من المفيد أن حاتمة العلامة بروتين من الفائدة بحيث يمكن الكشف عن هذا البروتين الانصهار على البقع الغربية. في هذا البروتوكول، ونحن الموسومة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kerscher لدعمهم. نشكر كافة Hochstrasser للخميرة سلالة MHY3765. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1051970 (إلى OK) ومعهد هوارد هيوز الطبي الجامعية منحة السفر ومونرو علماء برنامج منح (لES).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
سلالة الخميرة Omni Bead Ruptor 24Omni International19-010
Yeast ORF في سلالة الخميرة BG1805ThermoScientificYSC3869GAL+ التي يمكن استخدامها للحث والاستخراج
pYES2.1 TOPO vectorLife TechnologiesK4150-01GAL + سلالة الخميرة التي يمكن استخدامها للحث والاستخراج ؛ يحتوي على كوكتيل V5 / 6xHIS
إيقاف مثبطات البروتياز للاستخدام الواحد ( 100x)ThermoScientific 1860932
2.0 مل أنبوب حوارية مع غطاء لولبيBioExpressC-3369-3تأكد من أن الأنبوب يناسب بشكل صحيح الخرز
الزجاجي الممزق ، مغسول بالحمض ، 425-600 ومايكرو ؛ م (30-40 غربال أمريكي)Sigma-AldrichG8772
Corning Costar Spin-X مرشحات أنبوب الطرد المركزيSigma-AldrichCLS8161استخدم لتصفية إضافية للمحللة الموضحة
TALON Metal Affinity ResinClontech635502لتنقية البروتينات الموسومة 6xHIS
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Life TechnologiesNP0007لتحضير و / أو شطف العينات قبل SDS-PAGE و Western Blotting
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris GelLife TechnologiesNP0321BOXالمواد الهلامية مسبقة الصب غالبا ما تستخدم ل SDS-PAGE قبل Western Blotting
Simply BlueLifeTechnologies#LC6060بقعة جل البروتين
Mammalian Lysis BufferPromegaG9381عازلة التحلل التجارية البديلة
Anti-V5 agaroseSigmaA7345طريقة الترسيب المناعي
ECLMilliporeWBKL S0 050
PVDF غشاءMilliporeIPVH00010
BIS-TRIS المواد الهلاميةLife TechnologiesNP0321BOX
الجسم المضاد المضادل Myc Covancemms-150R
الجسم المضاد الثانويAbcamab97040الماعز pAb إلى الفأر IgG (HRP)
علامة مربوط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
  2. Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Protein ExtractionBead Beating HomogenizationAffinity PurificationPost translational ModificationsWhole Cell ExtractTCA PrecipitationWestern Blot AnalysisEpitope tagged ProteinsMetal Affinity ResinProtease Inhibitors

Related Articles