このプロトコルは、真核細胞に対する全細胞MALDI-TOF質量分析の使用を説明しています。ここでは、マクロファージの微小環境に応じた複数の活性化状態を分析することにより、この手法の精度を示します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
MALDI-TOFは、化学および生化学で広く使用されている質量分析技術です。また、分子やバイオマーカーを特定するために医学にも応用されています。最近では、臨床サンプルから増殖した細菌を、調製や分画のステップなしで日常的に同定するために微生物学で使用されています。私たちと他の人々は、この全細胞MALDI-TOF質量分析技術を真核細胞にうまく適用しました。現在のアプリケーションは、細胞タイプの同定から、細胞培養の品質管理評価、診断アプリケーションまで多岐にわたります。ここでは、サイトカインや熱死菌に応答したマクロファージのさまざまな分極表現型を探索するためのその使用について説明します。これにより、マクロファージのプロテオミクス応答の多様性を代表するマクロファージ特異的なフィンガープリントの同定が可能になりました。このアプリケーションは、メソッドの精度とシンプルさを示しています。ここで説明したプロトコルは、病理学的状態における免疫宿主応答の研究に役立つ場合もあれば、より広範な診断アプリケーションに拡張することもできます。
概要
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)は、生体サンプルを研究するための一般的な質量分析技術です。レーザービームとエネルギー吸収マトリックスを使用すると、ソフトイオン化プロセス、つまり、主に単電荷の大きな生体分子の蒸発と生成が可能になります。このプロセスは脱着/イオン化と呼ばれ、頭字語MALDIを正当化します。次に、これらのイオンは電圧の印加によって加速され、TOFアナライザーに入り、これらのイオンの分離とそれぞれの質量の定量化が可能になります1。
MALDI-TOF MSは、生物学、化学、医学の分野で、分子やバイオマーカー2-4の同定や、proteins5,6の翻訳後修飾を監視するために広く使用されています。最近、いくつかのグループが臨床サンプル7,8からの微生物の同定にMALDI-TOF MSを適用しました。この微生物学的アプリケーションは、現在、臨床現場で日常的に使用されています。全細胞MALDI-TOFは、従来のMALDI-TOF M....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
現在のプロトコルでは、全細胞MALDI-TOF技術を使用して、サンプルのフィンガープリントと見なされる質量スペクトルを取得します。バイオインフォマティクス分析により、これらの指紋の比較と分類が可能になりました。このプロトコルには、次の3つの主要な部分がありました。
- 生物学的サンプルの調製:マクロファージおよび異なるアゴニストで刺激されたマクロファージを制御します。
- 全細胞MALDI-TOF MSによるテクニカルレプリケートによる各タイプのサンプルの分析。
- 生データのバイオインフォマティクス分析。
細胞単離と培養のための無菌溶液を準備します。すべての試薬を調製し、4°Cで保存
します。1. ヒト単球の調製
- 細胞培養液を調製します。55 mLのヒト血清AB+またはウシ胎児血清(FBS)と5 mLの抗生物質溶液(ペニシリン10,000 UI/mL、ストレプトマイシン10,000 μg/mL、最終濃度ペニシリン100 UI/ml、ストレプトマイシン100 μg/ml)をRPMI 1640培地(500 ml)に加えます。
- 末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパック(白血球濃縮物)から単離します。
- 15mlのFicollを含む50mlのチューブを準備します。血液を生理食塩水で希釈....
- 末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパック(白血球濃縮物)から単離します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
本プロトコルの目的は、マクロファージの微小環境に対する応答性を評価するにおける全細胞MALDI-TOF MSの正確性を実証することである。
図1は、血液サンプルからの刺激マクロファージの調製について説明しています。図2は、フローサイトメトリーによる単球およびMDMの解析を示しています。単球はCD14を発現していましたが、CD68は発現していなかったことに注意してください(図1A)。逆に、MDMはCD68を発現していましたが、CD14は発現していませんでした(図1B)。
図 3は、全細胞MALDI-TOF MSの原理を示しています。細胞をマトリックスと共にターゲットプレート上に堆積させます。質量分析計内で、レーザービームをサンプルに複数回（240ショット）照射することで、分子の脱離とイオン化を誘導します。生成されたイオンは磁場によって加速され、チューブ内で
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このプロトコルは、真核生物の全細胞に対するMALDI-TOF-MSの使用について説明しています。ここでは、マクロファージの微小環境に応答した複数の活性化状態を分析することにより、この方法の精度を説明します。
プロトコルの成功は、いくつかの重要なステップに依存しています。まず、溶液汚染物質がスペクトルを変化させる可能性があります。たとえば、ターゲットに沈着する前に、PBSで細胞を洗浄して培地と血清タンパク質を除去することが重要です。再現性のある結果を確保するには、1 x 105 細胞/μlの細胞濃度も必要です。第二に、結晶化はプロトコルの重要なステップです。高品質の結果を得るには、ターゲットプレートを注意深く洗浄し、ターゲットにサンプルを堆積させる前にマトリックスを調製する必要があります。最良の結果は、マトリックス溶液の直前にサンプルをターゲットに堆積させると得られます(ターゲットに堆積する前にサンプルをマトリックスと混合することは避けてください)。サンプルとマトリックス溶液の間の正しい自発的な混合には、均質な堆積物が必要です。第三に、全細胞MALDI-TOF-.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者には宣言すべき利益相反はありません。RO、JLM、CCは、「Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF」と名付けられた国際特許WO 2011/154650の発明者です。
謝辞
Richard Ouedraogo は、Ministère de la Santé (PHRC 2010) からの助成金によってサポートされています。技術支援を提供してくださったLaurent Gorvel氏、Christophe Flaudrops氏、Nicolas Amstrong氏に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
参考文献
- Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
- Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
- D....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
