בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

Summary

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.

Abstract

בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה לבודד תאים דנדריטים (DC) ותאי אפיתל (TEC) מבלוטת התימוס האנושית. DC וTEC הם תא אנטיגן הצגה הגדול סוגים (APC) נמצאו בבלוטת התימוס נורמלית והיא מבוססת היטב כי הם ממלאים תפקידים שונים במהלך בחירה הרתי. תאים אלה הם נקודתיים במייקר ברור בבלוטת התימוס וכל סוג APC מפצה אוכלוסייה קלה בלבד של תאים. כדי להבין את הביולוגיה של סוגים אלה של תאים נוספים, אפיון של אוכלוסיות תאים אלה רצוי מאוד אך בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים דורש הליך יעיל ושחזור. פרוטוקול זה מפרט שיטה להשיג תאים מתאימים לאפיון של תכונות סלולריות מגוונות. רקמה הרתי מופרת באופן מכאני ולאחר שלבים שונים של עיכול אנזימטי, ההשעיה תא וכתוצאה מכך הוא מועשר באמצעות צעד צנטריפוגה צפיפות Percoll. לבידודה של מיאלואידית DC (CD11c <sup> +), תאים מהשבר בצפיפות נמוכה (LDF) הם immunoselected ידי מיון תא מגנטי. העשרה של אוכלוסיות TEC (mTEC, cTEC) מושגת על ידי דלדול של תאי hematopoietic ^(היי CD45) מחלק תא Percoll בצפיפות נמוכה המאפשר הבידוד הבא שלהם באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות סמני תא ספציפיים. התאים מבודדים יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם שונים.

Introduction

התימוס הוא האיבר שבו התפתחות תא T מתרחש. גודלו היחסי והמוחלט שלה יורד עם גיל, כאשר הוא הופך להיות מוחלף ברציפות על ידי שומן למרות פעילות הרתי עדיין יכולה להתגלות בגיל המבוגר. חשיבותו לתגובה החיסונית הודגמה בתחילת 1960s ^1.

רפרטואר תא T מעוצב באמצעות האינטראקציה של קולטני תא T עם מתחמי פפטיד-MHC על סוגים שונים של APC הרתי, המספקים רמזי הישרדות או מוות לפיתוח תאי T, וכתוצאה מרפרטואר תא T פונקציונלי ובעיקר עצמי סובלני ^2.

כ 98% מהתאים בבלוטת התימוס האנושי מתפתחים תאי T המכונים thymocytes. 2% הנותרים מורכבים מכמה סוגי תאים שונים, כוללים מגוון רחב של TEC (קליפת המוח, מדולרית, subcapsular), מיאלואידית וDC plasmacytoid (MDC, PDC), מקרופאגים, תאי B, תאי T מחדש במחזור בוגר, גרנולוציטים של, וibroblasts, תאי אנדותל ותאי אפיתל נדירים מאוד עם פנוטיפ ביטוי דומה לזה של תאים מרקמות אחרות כגון שרירים, תאי עצב והאפיתל בדרכי הנשימה (איור 1). מתוכם, TEC ו DC הם סוגי APC העיקריים שנמצאו בבלוטת התימוס נורמלית. בשנים האחרונות, טיהור של סוגי APC הללו לתרבות ולאפיון מולקולרי צברה יותר ויותר עניין. בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים אלה לניתוח מפורט דורש הליך יעיל, לשחזור וחסכוני. השיטה המוצגת כאן היא שינוי ממחקרים שפורסמו בעבר ^3,4.

כמו בכל רקמה אחרת, מיצוי תאים מבלוטת התימוס יכול להיות מושגת על ידי אנזימי disaggregating תאי תאים ורשתות אינטראקציה תאי מטריקס, על מנת לקבל השעיה של תאים בודדים. ישנם פרמטרים מסוימים כמו יעילות דיסוציאציה טובה, תשואת תא, כדאיות תא ושמירה של תא יםסמני urface כי הם קריטיים וצריכים להיות מותאמים לבידוד המוצלח של אוכלוסיות תאים נדירות אלה.

בפרוטוקול זה, בידוד של DC ותת TEC מבוצע על ידי ביצוע השעיה תא בודד של הרקמה על ידי הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. אנו משתמשים Collagenase מClostridium histolyticum, שבו יש יחס מאוזן של פעילות אנזים שונה, כדי לשבור את קולגן המקומי שמחזיק את הרקמה יחד. אני DNase כלול בפתרון האנזים כדי להפחית צבירת תא בשל DNA החופשי מהתאים מתים (thymocytes רגיש מאוד). כמו כן אנו מספקים גישה חלופית לעיכול הרקמה האנזימטית הטיפוסי מעורב טיפול רקמות מכאני והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמות. ההשעיה התא בודדת נתונה אז צנטריפוגה צפיפות Percoll יחידה להעשרת חלק בצפיפות הנמוכה (LDF) של תאים. מחלק זה של תאים, יכול להיות מבודד DC על ידי צביעה ואו סמני DC-פני השטח (כלומר ⁺ CD11c) ושימוש בהפרדה מגנטית או תא הקרינה המופעל מיון (FACS). בניגוד לתאי הלימפה המהווים את הרוב המכריע של תאים בבלוטת התימוס, TEC אינו מבטא CD45 ברמות גבוהות, אבל הם חיוביים לEpCAM מולקולת הידבקות תא אפיתל. ניתן להבחין cTEC מTEC מהדולרי על ידי הביטוי של אנטיגן עדיין לא מוגדר שהוכר על ידי CDR-2 נוגדנים (קליפת המוח הדנדריטים reticulocyte-2) ^4,5 וביטוי EpCAM נמוך במקצת. ההפרש שיתוף הביטוי של EpCAM וCDR2 מאפשר הבידוד יעיל של תת TEC אלה באמצעות סלולריים במהירות גבוהה מיון ^6.

הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לרקמה הרתי אנושית. משך ההליך תלוי בכמות הרקמה וביכולת של הנסיין, כמו גם את המהירות של סדרן התא, אם נעשה שימוש FACS מיון. בדרך כלל, הפרוטוקול לבידוד של DC יכול להסתיים בתוך 5שעה -6 ועבור הבידוד של TEC ב8-10 שעה. הבידוד של DC ותת TEC מרקמות הרתי הוא זמן רגיש. מהר הליך הבידוד, טוב יותר את מצבו של התאים. לבסוף, התאים מבודדים יכולים לשמש לחקירות נוספות כמו מחקרים השוואתיים של mRNA וביטוי חלבונים, ניסויי PCR, בידוד חלבון, פרופיל מולקולרי (כלומר transcriptomics, ניתוח RNA מיקרו), כמו גם תא תרבות ^6.

הצהרת אתיקה

על מנת להיות מסוגל לעבוד עם רקמת התימוס אנושית החוקר צריך לקבל אישור מוועדת האתיקה המקומית או הרשויות אחראים, כמו גם הסכמה מדעת בכתב של התורם (או בדרך כלל הורים שלו או שלה, שכן רקמה בדרך כלל מתקבלת מקטינים ילדים). יתר על כן, יש לטפל בכל הרקמות האנושיות כאמצעי שעלול להיות מדבק ומתאים יש לנקוט, כגון עבודה עם כפפות, וכו '.

Protocol

1. הכנת כלים, פתרונות אנזים, וחוצצים

בצע את השלבים הבאים preparative לפני תחילת הפרוטוקול.

1. כלי עבודה
   חיטוי נקי, יבש ואת הכלים הבאים ולשמור אותם באריזה סטרילית עד לשימוש.
   1. מספריים חדים קטנים עם טיפים או מעוקלים או ישר לחיתוך רקמת התימוס. מלקחיים מעוקלים קטנים עם טיפים משוננים לטיפול ברקמות.
   2. 50 מיליליטר Oak Ridge צינורות צנטריפוגה, PC, לצעד צנטריפוגה Percoll בצפיפות.
2. פתרונות אנזים
   הכן את Collagenase / DNase אני אנזים לערבב (2 Collagenase מ"ג / מיליליטר ו0.1 DNase אני / מיליליטר מ"ג) באופן הבא:
   1. ממיסים 500 מ"ג lyophilized Collagenase (רוש) ב250 מיליליטר של מישור RPMI 1640 (אין FCS) כדי להשיג פתרון 2 מ"ג / מיליליטר Collagenase. Collagenase הוא די קשה לפירוק, ולכן מומלץ להשאיר אותו קצת זמן על רולר-ייקר ב RT.
   2. ממיסים 100 DNase מ"ג אני (רוש) ב10 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. ניתן לאחסן 2.5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. הוסף 2.5 מיליליטר שלי DNase הפתרון 10 מ"ג בפתרון 2 מ"ג Collagenase.
   3. סינון סטרילי תמהיל Collagenase / DNase באמצעות יחידת Stericup מסנן (0.22 מיקרומטר). חנות ב10-20 מיליליטר aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. מאגרים ופתרונות
   1. 1.5 פתרון מניות M NaCl: ממיסים NaCl במים סטריליים מזוקקים לריכוז סופי של 1.5 מ 'סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב RT.
   2. חיץ MACS 10x: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} ללא) המכיל BSA 5% ו20 mM EDTA. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. לפני השימוש להכין פתרון 1x על ידי דילול המניות 10x ל1x ב1x PBS סטרילי הקר.
   3. FACS הצפת: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} ללא) המכיל 1% BSA ו0.02% NaN _3.
   4. FACS הצפת למיון תא: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. הכנה של רקמות

העיבוד של הרקמה צריכה להתבצע באמצעות ריאגנטים סטרילי ועבודה בזרימה למינרית. לפני ההליך מתחיל, להכין את חומרים כימיים וציוד הבאים:

1. 1. לחמם את הפעולות הבאות כדי RT: מדיום 1640 RPMI מלאים (RPMI 1640, 10% עגל בסרום עוברי, 1% עט / סטרפטוקוקוס), RPMI 1640 רגילים, Ca ^{2 +} / Mg ² PBS ⁺ ללא ופתרון אנזים Collagenase / DNase 2x.
   2. חממה תרמית חמה עם יחידת סיבוב 37 ° C ו צנטריפוגות הרוטור מגניב זווית קבועה עד 4 ° C.
   3. הכן את קופסא עם קרח.

הערה: משך הזמן של שלב זה תלוי במצב ואת הגודל של הרקמה. כ 20-30 דקות היא זמן סביר דרושה לפיסת ti גודל בינוניssue במצב טוב (~ 5 ס"מ רוחב).

2. הנח רקמות בצלחת פטרי המכילה PBS סטרילית ולשטוף את כל דם שיורית.
   1. הוסף PBS הטרי כדי למנוע רקמות מייבוש ובאמצעות מלקחיים ומספריים לנקות את הרקמה מקרישי דם, רקמת חיבור ושומן וכל חלק שלא נראה בריא.
   2. תשמור על עצמך כדי להסיר רקמת נמקים כי תגדיל את כמות הפסולת.
   3. לאחר הניקוי, לשקול רקמות להתייחסות.
   4. חותכים את הרקמה בכ 1 סנטימטר ³ חתיכות / גושים. להוסיף PBS מספיק כדי לכסות את הרקמה.

הערה: שחזור של תוצאות, רקמה יש לחתוך לחתיכות בגודל אחיד.

3. שימוש בחלק האחורי של מזרק סטרילי (10-20 מיליליטר) להפעיל לחץ (לא נמרץ או ממושך מדי) על גבי פיסות רקמה הרתי. הליך זה יסיר את חלק הארי של thymocytes, וכך להקטין את נפח הרקמה להתעכל מאוחר יותר. לבצע שלב זה על קרח ולעבוד מהר.
4. הפתרון יהיה מעונן בעליל כthymocytes הם שוחררו. מערבבים את התבשיל בעדינות ולאחר מכן בעזרת פיפטה 5 מיליליטר או aspirator זכוכית להסיר את supernatant המכיל thymocytes נזהר שלא לשאוב את חתיכות הרקמה בטעות.

טיפ: מגרד תרבית תאים סטריליים יכול לשמש כדי לרכז את כל פיסות הרקמה בצד אחד של הצלחת ואז להטות את הצלחת (זווית ° 45) ולשאוב supernatant. החלף עם PBS הטרי ולחזור על הליך זה עד supernatant הוא יחסית שקוף. לבצע שטיפה האחרונה עם מישור RPMI.

5. ברר בפיסות רקמות באמצעות מספריים חדים (כדק ככל האפשר, שברים צריכים להיות לפחות 2-4 מ"מ). הברים צריכים להיות קטנים מספיק כדי להיכנס פיפטה 5 מ"ל.

3. הכנת תרחיף תא בודד מרקמות קורנית

כאן,שתי גישות חלופיות לצעד זה מתוארים. הגישה הראשונה מתארת ​​עיכול אופייני האנזימטית רקמה (סעיף 3.1) ואילו השנייה כרוכה בטיפול ברקמה מכאנית והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמה (סעיף 3.2).

פרוטוקול זה הוא מותאם לעיבוד דגימות רקמה במשקל של 5 גרם. לדגימות רקמה גדולות יותר או קטנות יותר, להתאים כמויות אנזים בהתאם.

3.1 עיכול רקמה האנזימטית אופייני לקבל השעיה תא בודדת

1. הנח רקמת חיה ל50 מיליליטר צינורות עם פתרון 10 collagenase מיליליטר / DNase לכל 5 גרם של רקמה. הוספה רגיל RPMI לתת נפח כולל של 20 מיליליטר.

הערה: בצינור 50 מיליליטר לעכל עד 10 גרם של רקמה. התאם אנזים נפח בהתאם.

2. דגירה ההשעיה הרקמות ל40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב איטי בחממה תרמית.

הערה:

3. פתרון האנזים יהפוך מעונן כמו תאים משתחררים לתוכה. בסופו של תהליך העיכול, צינור צנטריפוגות ב XG 110 למשך 2 דקות למשקעים שברי רקמה.
4. איסוף supernatant מסיבוב עיכול זה. גלולה ההשעיה התא 10 דקות ב 400 x גרם. לשאוב supernatant ותאי resuspend ב 10-50 מיליליטר של שלם RPMI תלוי בגודל של התא גלולה.
5. שמור על השעיה תא ב37 חממת מעלות צלזיוס עם הכובע רופף.
6. אם מספרי תא גדולים יותר הם רצויים, ניתן לחזור על צעד העיכול עם שברי רקמה שנותרו והראשון ולעכל שני ונקווה. כמו כן, אם TEC צריך להיות מבודד, שני סבבים של digestions צריכים להתבצע.
7. מדולל aliquot של ההשעיה התא בtrypan הכחול (1:10-1:100) ולספור תאי קיימא באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה עד מוכן להמשיך לצנטריפוגה Percoll הצפיפות (סעיף 4). הבידוד הבא של תת DC (סעיף 5) יבוצע מהתאים אלה.

הערה: רקמות הרתי יכולות להשתנות בהרכב שלהם, במיוחד עם גיל, מה שמשפיע על יעילות עיכול ואת הדור של השעיה תא בודד.

9. לבידוד הבא של תאי אפיתל הרתי (TEC) נדרש סיבוב של עיכול אנזימטי שלישי. שרידי רקמת resuspend ב 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי בתוספת 10 מיליליטר של RPMI רגיל ולהוסיף טריפסין / EDTA (מניית 01:50 מ2.5%) בפתרון.
10. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 40 עם סיבוב עדין. במהלך 10 האחרונות - 15 דקות של הדגירה להוסיף FCS (1:5) כדי לנטרל את הפעילות של טריפסין.
11. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT למשקעי שברי הרקמה.

g> הערה: הרקמות לא יכולות להתעכל לחלוטין לאחר שלושת סיבובים של digestions אלה. גיל ומצבו הכללי של הרקמות הם שני פרמטרים המשפיעים על יעילות הניתוק של רקמת התימוס.

12. לאסוף את supernatant התא וזורקים את שברי רקמת משקעים.
13. צנטריפוגה supernatant התא XG 400 10 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend תא גלולה בשלם RPMI.

טיפ: כדורים סלולריים הם די רופפים, אז לטפל בעת השלכת / aspirating supernatant.

14. ספירת תאי קיימא באמצעות hemocytometer. מניחים את התאים בחממה 37 מעלות צלזיוס עד שתמשיך לPercoll הפרדה (סעיף 4). טרום העשרה עוקבת של תאי TEC ידי דלדול של תאים ^היי CD45 תבוצע מהתאים אלה (סעיף 6).

3.2 טיפול רקמות מכאני והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמה

ass = "jove_content"> שימוש ברקמה Dissociator מתקרבת, ניתן להפחית את צעדי עיכול רקמה למחצית מהזמן דרוש לגישה שתוארה לעיל (סעיף 3.1). הפרוטוקול הבא הוא גרסה שונה של שנהג לנתק את רקמת בלוטת התימוס עכבר לבידודה של TEC ^7,8.

1. העברה 5 גרם של חתיכות טחונות רקמות (שלב 2.5) לתוך צינור C מכיל 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase.
2. להתאים צינור C על Dissociator הרקמות וm_spleen_02 תכנית הריצה (10 שניות). חזור על תכנית זו 4-5x (40-50 שניות).
3. דגירה עם סיבוב עדין ל20 דקות ב 37 ° C.
4. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT.
5. איסוף supernatant והמשך כמו בשלב 3.1.4. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי.
6. להתאים צינור C על Dissociator הרקמות וm_spleen_01 תכנית הריצה (56 שניות).
7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם סיבוב עדין.
8. צנטריפוגה ב110 XG במשך 2 דקות ב RT.
9. אוסףsupernatant תא T וגלול את ההשעיה תא 10 דקות ב 400 x גרם. המשך כמו בשלב 3.1.4.
10. כפי שתואר ב3.1.9 סיבוב של מערכת העיכול שלישי נחוץ לבידוד הבא של תאי אפיתל הרתי (TEC). לשם כך, שרידי רקמת resuspend ב 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase / DNase טרי בתוספת טריפסין / EDTA (01:50 דילול של מניות 2.5%)
11. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך עוד דקות 20 עם סיבוב עדין. הוספת FCS (1:5) ו דגירה של יותר 10 דקות.

שים לב: שימוש בגישה זו, לאחר העיכול אחרון זה צעד הרקמות בדרך כלל מנותקת לחלוטין ואין שברי רקמות מעוכלים הם נצפו.

12. המשך כמו בשלבים 3.1.11-3.1.14.

4. העשרת LDF של תאים באמצעות הפרדת Percoll צפיפות

לאחר עיכול אנזימטי של הרקמות, הכוללת השעיות תא בודדות הרתי חשופים לcentrifugat צפיפות Percoll אחתצעד יון להעשיר לתאי LDF. LDF של תאים מועשר לAPC. DC וTEC שניהם זוהו בחלק זה של תאים.

1. השתמש השעיה תא בודדת המתקבלת ^מst 1 ו 2 ^nd מעכל לבידוד MDC (תאים נקוו, ראה צעד 3.1.8) או 3 ^rd לעכל (לבידוד TEC) (3.1.14). השעיה צנטריפוגה תא בודדת המתקבלת מכל אחד משלבי העיכול ב XG 400 10 דקות.
2. הכן פתרון Percoll עם צפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר במהלך שלב זה לשטוף (ראה דוגמא בטבלה שלהלן).

   הכנת פתרון Percoll לצפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר (ρ = 1.07)
   מס 'צינור	1	2	3	4
   חי Percoll (ρ = 1.130) (מיליליטר)	2.96	5.92	8.88	11.84
   1.5 M NaCl (מיליליטר)	0.6	1.20	1.8	2.4
   מזוקקי H 2 O (מיליליטר)	2.44	4.88	7.32	9.76
   היקף דילול עבודה סופי	6 מיליליטר	12 מיליליטר	18 מיליליטר	24 מיליליטר

3. מספר צינורות Percoll תלוי במספרים הסלולריים שנקבעו בשלבי 3.1.8 ו / או 3.1.14. לשלב את פתרונות סטרילי ומערבבים היטב. לבידוד אופטימלי, ניתן לטעון 0.6-1 x 10 ⁹ תאים לכל צינור של Percoll. לשלב את פתרונות סטרילי ומערבבים היטב.

טיפ: Percoll הוא רגיש לאור ובנוסף הוא צריך להיות כל הזמן קר. הכן ראשון התערובת המכילה NaCl ו-H ₂ O (RT) ולהוסיף Percoll חי אחרון, ממש לפני resuspending התאים בפתרון Percoll.

אוהל "> הערה: צפיפות Percoll עשויה להשתנות בין ספקים וקבוצות שונים אם הצפיפות של פתרון Percoll חי אינה שווה ל1.130 גר '/ מיליליטר, השתמש בהוראות המסופקות על ידי היצרן כדי לחשב את סכומי Percoll ו-H ₂ O המדויקים נדרש כדי לקבל צפיפות סופית של 1.07 גר '/ מיליליטר.

4. Resuspend עד 1 x 10 ⁹ תאים ב6 מיליליטר של הפתרון מוכן Percoll (ρ = 1.07), לערבב במידה מספקת כדי לקבל השעיה הומוגנית, ולהעביר צינור צנטריפוגות כובע בורג פוליקרבונט 50 מיליליטר Oak Ridge.
5. שכבת זהירות 30 מיליליטר של RPMI מלא לכל צינור עם טפטפת על גבי ההשעיה פתרון Percoll / תא. טען את המדיום באיטיות, כך שהוא נשאר בחלק העליון של ההשעיה ודואג שלא להפריע את השכבה.
6. לשקול את הצינורות כדי לוודא שיש להם משקל שווה, כך שהם מאוזנים במהלך צנטריפוגה. אם הם לא, בזהירות להוסיף עוד מדיום לצינור הקל יותר (מתחת stתנאי erile).
7. בזהירות להעביר את הצינורות לצנטריפוגה מקוררת מראש עם הרוטור קבוע זווית, ואת ספין ב3,500 XG במשך 35 דקות, בשעה 4 ° C עם הבלם משם. ודא שהטמפרטורה של צנטריפוגות בגבוהה יותר מאשר 4 ° C. לא
8. הסר את הצינורות מצנטריפוגות ובזהירות לאסוף את APC המועשר, שנמצא בשלבי ביניים בין Percoll ובינוני (חלק בצפיפות נמוכה) מכל צינור באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. העברת תאים לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל מלא RPMI קר. מלא את הצינור על מנת לדלל את Percoll הנותר.
9. צנטריפוגה ההשעיה התא 10 דקות ב 300 XG ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף חוזר.
10. Resuspend התא גלולה במדיום ולקבוע את המספר הסלולרי (באמצעות trypan הכחול וhemocytometer). מניסיוננו, אחוז תאי LDF הוא כ 2-20% מהשעית התא הבודד הכוללת המתקבלת לאחר עיכול אנזים. Y טיפוסיield של תאים מועשרים בצפיפות נמוכה (מהתימוס צעיר שנות יום 2 1 טווח,) הוא 1x10 ⁸ תאים לכל 1 x 10 ^9, המייצג 10% מתאי השעיה תא בודדים בסך הכל.

הערה: בשלב זה, אתה עשוי לצפות כי תאים מצטברים בהשעיה (במיוחד עם דגימות מילדים בגיל מבוגר יותר). גושים סלולריים הם אינדיקציה למוות של תאים והתוצאה משחרורו של ה-DNA מהתאים המתים שיכול להיצמד לתאים יחד. במקרה כזה, להוסיף DNase אני לתוך המדגם (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו דגירה אותו לתקופה של עד 20 דקות ב RT (בעדינות להפוך כל 5 דקות) כדי לעכל את מולקולות ה-DNA בחינם.

5. בידוד של הרתי MDC

לאחר העשרת APC (באמצעות הפרדת Percoll), MDC יכול להיות מבודד ביעילות מLDF הבא בסיבוב הראשון והשני של digestions האנזימטית. הפרוטוקול הבא הוא גרסה שונה של הפרדת תאים המגנטית לבידודה של MDC (CD11c

1. צנטריפוגה APC מועשר בתאים מבודדים מהשעית התא בודדת המתקבלת מעיכול אנזימטי הראשון והשני ונקווה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה במאגר 100 MACS μl לכל 10 ⁷ תאים.
2. הוסף 5 μl של נוגדן CD11c-PE לכל 10 ⁷ תאים.

הערה: ניסויי כותרות מומלצים לתוצאות אופטימליות.

3. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
4. שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 מיליליטר של חיץ MACS לכל 10 ⁷ תאים ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות.
5. לשאוב supernatant לחלוטין וresuspend עד 10 ⁷ תאים ב80 μl של חיץ MACS.
6. הוספת microbeads אנטי PE 20 μl לכל 10 ⁷ תאים.
7. מערבבים היטב (לא מערבולת) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
8. חזור כמו בשלב 5.4. Resuspend עד 10 ⁸ תאים ב500 μl של חיץ.
9. במידת צורך, השעיה תא סינון באמצעות מסננת 40 תא מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים פסולת ותא שעלולה לחסום את הזרימה של העמודה.
10. השתמש בעמודת LS מאז השעיות תא התימוס לזרום טוב יותר באמצעות עמודות LS. הכן LS טור הבא הוראות יצרן. השעיה תא פיפטה לאט לתוך טור הימנעות בועות שהניבו. השתמש בעמודה אחת עבור כל 1 x 10 ⁸ תאים.
11. שטוף טור הבא הוראות היצרן. הסר את העמודה מהמגנט ולמקם אותו ב12 מיליליטר סטרילי סביב צינור פוליפרופילן תחתון. הוסף 3 MACS מיליליטר החיץ על הטור ולאסוף תאים מגנטיים שכותרתו על ידי הכנסה ובתקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור.
12. לאסוף את שבר eluted המייצג את CD11c ⁺ MDC ו צנטריפוגות ב XG 400 במשך 6 דקות.
13. לקבוע מספר תא ולאשר טוהר populati התא הנבחרעל ידי ניתוח התזרים cytometric. סמנים הציעו לכלול CD45, CD11c, וHLA-DR.

הערה: CD11c ⁺ MDC עשוי גם להיות מבודד באמצעות סדרן FACS.

6. העשרה של תאי ^{lo / נג} CD45 למיון תא של TEC

לבידוד תרמי של TEC, ניתן מראש מועשרים תאים על ידי דלדול של תאים ^היי CD45 באמצעות microbeads CD45, על מנת להאיץ את הבידוד שלהם באמצעות מיון תא.

השתמש השעיה תא בודדת המתקבלת מהשלב 3 ^rd העיכול (3.1.14) ולאחר מכן הופרדה על ידי צנטריפוגה Percoll.

1. צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה ב80 MACS μl חיץ לכל 10 ⁷ תאים.
2. השתמש microbeads CD45 ב 1/3 מהכמות המומלצת (6.7 μl) לכל 10 ⁷ תאים.

הערה: על ידי שימוש בכמות נמוכה יותרשל microbeads מראש להעשיר את התאים לשניהם CD45 ^{הפלא ותאי נג} CD45. הכותרות מומלצת לתוצאות אופטימליות.

3. מערבבים היטב בעדינות על ידי מצליף את הצינורית (לא מערבולת) ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
4. microbeads מאוגד לשטוף ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ MACS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות XG 300 ב 4 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין.
5. Resuspend עד 10 ⁸ תאים ב500 μl של חיץ.
6. במידת צורך, השעיה תא סינון באמצעות מסננת 70 תא מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים פסולת ותא שעלולה לחסום את הזרימה של העמודה.
7. השתמש בעמודת LS מאז השעיות תא התימוס לזרום טוב יותר באמצעות עמודות LS. הכן LS טור הבא הוראות יצרן. השעיה תא פיפטה לאט לתוך טור הימנעות בועות שהניבו. השתמש בעמודה אחת לכל 10 ⁸ תאים.
8. איסוף תאים ללא תווית (זרימה דרך ושוטף) המכיליםשבריר תא ^{lo / נג} CD45 ולשטוף טור הבא הוראות יצרן.
9. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend תא גלולה במאגר FACS סטרילי על מנת לקבוע את המספר נייד ולהמשיך מכתימים את מיון תא.

7. תאי כתם למיון תא הקרינה הופעל

1. בצע FCR חסימה לפני מכתים תא, על מנת להפחית את הנוגדן שאינו ספציפי המחייב. דגירה השעיה תא עם פתרון נוגדנים אנושיים ונקווה ל15 דקות ב RT. ריאגנטים אלה הם זמינים באופן מסחרי (כלומר פתרון 10% Gammunex).
2. שטוף תאים על ידי הוספת חיץ FACS סטרילי קר. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 6 דקות ב 4 ° C.
3. בטל supernatant ותאי resuspend במאגר FACS סטרילי קר. הכן 5 דגימות על פי הדוגמא הבאה:
   

   * SCC; שליטת צבע אחד

   דגירה תאים עם נוגדנים ל30 דקות, על קרח בחושך.
   שטוף פעמיים עם חיץ FACS ידי צנטריפוגה תאים ב XG 400 במשך 6 דקות ב 4 ° C.
   התאם את ריכוז התא של המדגם להיות מסודר לx10 1 ⁷ תאים / מיליליטר (או לריכוז מומלץ על ידי מתקן מיון התא) באמצעות FACS חיץ סטרילי למיון תא (כלומר ללא NaN _3).
   לעבור מדגם תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להסיר כל גושי תאים שעלולות לסתום cytometer במהלך מיון.
   Resuspend דגימות שליטה ב200-400 μl של חיץ. שמור צינורות על קרח ומוגן מפני אור.
   הכן צינורות אוסף עם מדיום.

   הערות:

   • בצע טיטרציה של הנוגדנים עבור מכתים אופטימלי.
   • בדגימה אחת למיון, יכולים להיות מוכתמים עד 50 x 10 ⁶ תאים בסך הכל תגובת נפח500 μl.
   • לבצע צביעה של המדגם להיות מסודר ב5 מיליליטר צינורות תחתית עגולים פלקון פוליסטירן. יכול להיות מוכתם שולט צבע אחד בבארות נפרדות מצלחת 96 היטב.
   • מאז תת TEC הם אוכלוסיות נדירות, מומלץ לשימוש אחר סמן חיובי (של תדר גבוה) לכל fluorochrome כדי להקל על קביעת הגדרות FACS תקינה ולוודא שיש לך פיצוי הולם אם הבחירה של fluorochromes דורשת פיצוי. תאים משבריר CD45 ⁺ יכולים להיות מוכתמים עם סמנים כגון CD45, CD3 או CD8 לfluorochromes השונים ולאחר הצביעה ניתן להוסיף CD45 ⁺ תאים בלא כתם למדגם.

   8. בידוד של TEC ידי מיון תא קרינה המופעל

   ניתן למיין תת TEC משבריר CD45 ^{lo / נג} כCDR2 ^היי EpCAM ^- (mTEC) או EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (cTEC).

   1. הפעל את שנינות המדגםשעות התאים בלא כתם ולהתאים את קדימה ופיזור בצד על מנת למקם את אוכלוסיית העניין בקנה מידה. התאם את המתח בכל גלאי, כך שהתאים גלויים אך ממוקם ביד החלק השמאלי של ההיסטוגרמה.
   2. הפעל כל דגימה מוכתמת בודדת ולהתאים את הפיצוי לכל צבע.
   3. לאחר התאמת המתח ופיצוי על הפקדים המוכתמים בלא כתם ואחד להפעיל את המדגם כדי להיות מסודר וכלים gating השימוש כדי להגדיר את האוכלוסייה של עניין. השתמש רחב קדימה ושער פיזור הצד כדי להבטיח הכללת כל גדלי תאי סטרומה, תוך הדרת פסולת תא.
   4. על המגרש הנקודה עם CD45 פסיפיק בלו מול שער Forward פיזור על תאי ^{נג נמוכים} וCD45 CD45.
   5. החל השער הזה לEpCAM לעומת עלילת נקודת CDR2 ולקבוע על ידי gating האוכלוסיות להיות מסודרים.
   6. ברגע ששערים כבר נקבעו, בחר בשערים המכילים אוכלוסיות של עניין ולהתחיל למיין.

   הערה: במהלך מיון כדי למנוע מתאים מלהידבק לדפנות צינור האיסוף, הצינור יכול להיות מראש מצופה על ידי מילוי אותו עם 50% FCS ב-PBS וטופחו על RT במשך 30 דקות. מחק את פתרון הציפוי לפני הוספת תקשורת אוסף.

   Representative Results

   כחומר מוצא בפרוטוקול זה אנו משתמשים ברקמת בלוטת התימוס הוסרה מילדים שעברו ניתוח לתיקון לב וכלי דם (מחלקה לבית החזה וניתוח לב וכלי דם, אוניברסיטת מרפאת טובינגן) שהושגו לאחר הסכמה מדעת ותחת הנחיות מוסדיות. חומר שהושלך זה יכול להשתנות במידה רבה בגודל 2-30 גרם או יותר. מספר MDC ותת TEC (cTEC וmTEC) שמתקבלים תלוי בגודל, כמו גם את גיל דגימת רקמת התימוס המשמשת לבידוד.

   איור 2 מראה חתיכה די גדולה של רקמה (~ 9 ס"מ) המתקבלת מילד בן שש. צעד ראשון חשוב בהכנה של פרוטוקול זה הוא הניקוי של הרקמות מחלקים לא רצויים (המסומנים בחצים לבנים).

   טופלה רקמת התימוס כפי שמתואר בסעיפים 2 ו 3.1 של הפרוטוקול לקבל השעיה תא בודדת שהופרדה באמצעות צנטריפוגה של צפיפות Percoll אחתTEP בעוד ההשעיה התא בודדת מכילה כ 3% של HLA-DR + תאים (איור 3 א), לאחר צנטריפוגה Percoll אחוז זה גדל בשבריר בצפיפות נמוכה (LDF), המכיל תאים גדולים בגודל, ל15-40% ואילו חלק קטן בצפיפות גבוהה (HDF) שמורכב בעיקר של thymocytes הקטן בגודל האחיד מכיל כמעט שום תאים כאלה (איור 3 ב). את החלק היחסי של ריבית (LDF), APC המועשר המכיל נאסף לאחר מכן ורחץ לאיסוף תאים לשימוש בצעדי בידוד שלאחר מכן.

   בעוד MDC הרתי ניתן לזהות על ידי הביטוי של מספר סמני פני השטח, כולל CD11c9, 10, PDC להביע סמנים כגון BDCA-2, BDCA-4, CD45RA וCD123 ^11,12. לאחר העשרת תאי LDF, שני סוגי התאים מהווים 2-10% מחלק זה, המאפשר בידוד יעיל שלהם גם במספרים גדולים יותר, או על ידי הפרדת תא מגנטית או לזרום מיון של CD11c ⁺ או BDCA-4 ⁺תאים ^6.

   איור 4 מראה את הבידוד יעיל של CD11c תאים ⁺ באמצעות פרוטוקול הפרדת תא מגנטי שונה אמור בסעיף 5. לאחר בידוד, טוהר CD11c ⁺ DC היה 93% כפי שנקבע על ידי immunostaining של תאים מבודדים. בממוצע, ההתאוששות של CD11c המבודד ⁺ DC היא 5 X 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ MDC לכל 10 ⁹ תאים הרתי מוחלט. טבלת 1 מציג נתונים המתקבלים מכמה דגימות התימוס בודדות של גיל שונה ומשקל רקמה עם מגוון של קלט יחיד השעיות תא, כמו גם מספרים מוחלט LDF והתשואה שלאחר מכן CD11c ⁺ וטוהר.

   בשבריר APC מועשר, רק כ 0.5% מהתאים CD45 ^lo EpCAM ^{+ +} או EpCAM ^נג CD45. ניתן למיין cTEC וmTEC מתאי טריפסין-מתעכל CD45 ^{lo / נג} המועשר סטרומה ^כl EpCAM o CDR2 ⁺ וCDR2 ^היי EpCAM ^-, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 5.

   
   איור 1. תרשים פשוט של ארגון ובהרכב של התימוס האנושי הסלולריים. התימוס מורכב מthymocytes, בשלבי הבשלה שונים, ורשת סלולרית הטרוגנית מכונות stroma הרתי יוצר סביבה הרתי. סוגי התאים העיקריים של stroma הרתי הם, תאי MDC וPDC אפיתל (לחלק לשתי קטגוריות עיקריות על פי הלוקליזציה שלהם בתוך lobule: בקליפת המוח, ודולרי) ומקרופאגים קיצורים: DC, תאים הדנדריטים, MDC, תאים הדנדריטים מיאלואידית;. PDC, תאים הדנדריטים plasmacytoid; Mφ, מקרופאג; מונו, מונוציטים; cTEC, תאי האפיתל בקליפת המוח; mTEC, תאי האפיתל מדולריים.

   אוהל "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
   איור 2. צעד preparative הראשון של הרקמה לתא בודד הכנה. נקודת חצים כדי חלקי הרקמה רצויים שצריכים להיות מושלכים לפני הוצאתו להורג של הפרוטוקול.

   
   איור 3. טיהור של ניתוח APC. FACS הרתי של שלבים שונים של הליך הטיהור. השעיות תא בודדות של רקמת בלוטת התימוס התקבלו על ידי הפרעה מכאנית וdigestions האנזימטית הסידורי וAPC מועשר (תאי LDF) על ידי הפרדת Percoll בצפיפות. תאים לפני () ואחרי (ב ') את הפרדת Percoll הצפיפות היו מוכתמים עם נוגדן HLA-DR-PE כדי לבדוק להעשרת APC. אחוז הטווח של + תאי HLA-DR נצפו בדרך כלל הוא המבטא ed.

   
   איור 4. בידוד של CD11c ⁺ MDC. רקמת קורנית היה מתעכל באמצעות Collagenase / DNase אני ליצור השעיה תא בודדת. CD11c ⁺ MDC מייצג אוכלוסייה קלה בלבד של ההשעיה תא הבודד (0.6%). לאחר העשרת תאי LDF באמצעות הפרדת Percoll צפיפות אחוז של עליות CD11c ⁺ תאים ל~ 9%. תאי LDF תויגו עם נוגדני CD11c-PE ובהמשך מבודד באמצעות חרוזים מגנטיים (אנטי PE). ניתוח מחודש של CD11c ⁺ אוכלוסייה מייד לאחר תא מגנטי הפרדה על ידי FACS הצביע טוהר 93%. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

   0951/50951fig5.jpg "/>
   איור 5. העשרה של תאי ^{lo / נג} CD45 ומיון הבא של תת TEC.) חלקות נקודת נציג מראים אחוזי CD45 שליליים / תאי סטרומה הרתי נמוכים בהשעיות תא בודדות בסך הכל לפני ואחרי הפרדת Percoll צפיפות (9% ו16.2%, בהתאמה). B) תאי LDF היה מדולדל של תאי CD45 ^היי באמצעות חרוזים מגנטיים ותת TEC מסודרים מהשבריר המדולדל כCDR2 ^היי EpCAM ^- (mTEC) או EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (cTEC).

   מדגם	סוג המדגם נוגדן	מספר סלולרי	נפח כולל
   1. ללא רבב	שליטה		1 x 10 6	50 μl
   2.scc * פסיפיק בלו	שליטה	CD45 פסיפיק בלו	1 x 10 6	50 μl
   3. SCC-APC	שליטה	CD3-APC	1 x 10 6	50 μl
   4.scc-Alexa 488	שליטה	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 μl
   5. מיון תא	אנליטי	CD45 פסיפיק בלו EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6-50 x 10 6	500 μl 10 x 10 6 μl cells/100

   תדרי CD11c + MDC, תשואות תא וpurities של תורמים שונים
   תורם	גיל	משקל רקמה	סך הכל תאים לדגימה	תאי LDF לדגימה	CD11c+%	+ CD11c מבודד לדגימה	CD11c + טוהר
   1	5 ימים	7 גרם	1.45 x 10 9	9.5 x10 7	12.6	2.4 x 10 6	89%
   2	3 שנים	15 גרם	2 x 10 9	6.5 x10 7	4.3	1.9 x 10 6	81%
   3	21 ימים	9 גרם	2.6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3.6 x 10 6	93%
   4	6 שנים	13 גרם	1.4 x 10 9	25.4 x10 7	4.2	5.7 x 10 6	82%
   5	5 ימים	6.5 גרם	1.3 x 10 9	16.2 x10 7	6	2.9 x 10 6	91%
   6	39 ימים	3 גרם	0.6 x 10 9	8 x10 7	3.4	1.3 x 10 6	80%

   טבלת 1. מספרים של תאי השעיה תא כולל אחת שוחררו לאחר שני סבבים של מערכת העיכול, כמו גם תשואות של תאי LDF לאחר הפרדת Percoll מוצגים לבידודים שבוצעו בדגימות התימוס של שישה אנשים מגיל שונה ומשקל רקמה. תדרים של MDC נקבעו על ידי cytometry זרימה מבוססת על ביטוי CD11c בסך הכל תאי LDF (APC מועשר). תשואה וטוהר של CD11c ⁺ תאים לאחר הפרדת חרוז מגנטית מוצגות לכל תורם בודד.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם על ידי Gotter et al ^4. שלבים קריטיים בפרוטוקול הם המצב והכנה ראשונית של הרקמה, כמו גם את הפרדת צפיפות Percoll. אנו ממליצים בחום לעבד את הרקמה בהקדם האפשרי לאחר איסוף. חשוב לעבוד מהר אך ביסודיות בעת ניקוי וחיתוך הרקמות. במהלך שטיפת thymocyte המתוארת בשלב 2.3, חשוב למצוא את האיזון הנכון בעת ​​הפעלה לחץ בגב בוכנת המזרק בחתיכות הרקמה כמו לחץ נמרץ מדי וממושך עלולים לגרום נזק לתאי סטרומה. גם שכבות בינוניות על גבי הפתרון / ההשעיה תא Percoll מבלי לגרום להפרעות עשויה לדרוש חלק באימון. לאחר צנטריפוגה, חשוב לאסוף את כל התאים שבר בצפיפות נמוכים במהירות אפשרית משיכבת Percoll עם כמות מינימאלית של תמיסת Percoll.

תשואות תא כוללת ומספרי APC יחסי יכולים להיות מאוד משתנים (ראה טבלה 1) ותלויות בתורם (במיוחד ביחס לגיל) וכישורי preparative של הנסיין. לסקירה קצרה, יכולות להיות מוכתמות השעיות תא עם HLA-DR ו / או סמנים אחרים ביצוע שלבים שונים של הפרוטוקול כמבוקש. כל הנוגדנים המשמשים לניתוח פנוטיפי יש טיטרציה כדי להשיג תוצאות אופטימליות.

בשל ריבוי הנמוך יחסית של סוגי APC בבלוטת התימוס לעומת thymoctyes, חתיכות גדולות יותר של התימוס ייתכן שתידרשנה אם מספרים גבוהים יותר של תאים מבודדים הם רצויים.

אם Dissociator רקמה זמין במעבדה, זה יהיה משמעותי את מהירות עיבוד רקמות, אבל שני הווריאציות שתוארו כאן עבודה לא פחות טובה. בעיה תכופה יחסית עשויה להיות התקבצות של התאים, במיוחד במהלך השלבים בין הפרדת Percoll ומיון MACS / FACS. במקרה זה, DNase קצר אני חופרestion כפי שתואר בפרוטוקול בדרך כלל יפתור את הבעיה. מאז רקמת התימוס מוחלפת ברציפות על ידי רקמת שומן במהלך הזדקנות, thymi מתורמים מבוגרים עשויים להכיל קצת שומן, שישחה בחלק העליון של הצינור לאחר צנטריפוגה השעיות תא בודדות המתקבלות משלבי העיכול השונים. במקרה כזה, שומן יש להסיר עם פיפטה לפני שתמשיך את הפרוטוקול. לקבלת תוצאות אופטימליות, כמו גם מסיבות כלכליות אנחנו ייעוץ לכייל לא רק נוגדנים אלא גם microbeads אנטי-PE (סעיפים 5 ו -6). לבידוד תרמי של TEC מהתימוס העכבר, תערובות אנזים חלופיות תוארו כדי לשפר את תשואת TEC ^8,13, אבל אנחנו עדיין לא נבחנו אותם עם רקמה אנושית.

באופן עקרוני, יכולים גם להיות מבודדים מתאי LDF (בעקבות עיכול collagenase / DNase וPercoll) תאי APC וסטרומה הרתי אחרים כמו תאי B וPDC ידי FACS / MACS מיון אם ידועים סמני בהתאמה. לדוגמא, עבור PDC, BDCA-2, BDCA-4 וCD123 תוארו ^כ6,14 סמנים. אם ניתוח או בידוד של תת thymocyte הוא רצוי, מומלץ להשתמש בתאים שפורסמו על ידי הכיווץ (שלב 2.3), שכן הם די טהורים ועברו מניפולציה מינימאלית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator