Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи

Summary

Традиционные процедуры выделения растворимого типа 1 коллагена (COL1) потребуется около 10 дней с начала до конца из-за длительных инкубации буферных и трудоемких resuspensions фибрилл. Здесь мы описываем средства для очистки COL1 от небольших кожных биопсий менее чем за 3 часа.

Abstract

Растворимый коллаген типа 1 (COL1) широко используется в качестве клейкой подложки для клеточных культур и как сотовый каркаса для регенеративных приложений. Клинически этот белок широко используется для косметической хирургии, кожных инъекций, костной пластики и реконструктивной хирургии. Источники COL1 для этих процедур, как правило, нечеловеческий, что увеличивает потенциал для воспаления и отторжения, а также передачу ксенобиотиков заболевания. В связи с этим, метод, чтобы быстро и эффективно очищать COL1 от ограниченных количеств аутогенно производных тканей бы обойти многие из этих проблем, однако стандартные протоколы изоляции являются длительными и часто требуют большого количества коллагеновых тканей. Здесь мы демонстрируем эффективную COL1 метод извлечения, который уменьшает время, необходимое для выделения и очистки этого белка от 10 дней до менее чем 3 часа. Мы выбрали дермы как нашего источника ткани из-за его доступности во многих хирургических процедур. Тего метод использует традиционные буферы экстракции в сочетании с силовым перемешивании и центробежной фильтрации, чтобы получить высоко-чистый, растворимый COL1 из небольших количеств дермы. Вкратце, кожные биопсии тщательно промывают в ледяной дН ₂ O после удаления жира, соединительную ткань, и волосы. Образцы кожи лишены неколлагеновых белков и полисахаридов с использованием 0,5 М ацетата натрия и высокоскоростное Настольные гомогенизатора. Коллаген из остаточных твердых веществ впоследствии экстрагируют 0,075 М буфере цитрата натрия, используя гомогенизатор. Эти экстракты очищают, используя 100000 МВт отсечения центробежные фильтры, которые дают COL1 препараты сопоставимой или высшего качества в коммерческих продуктов или полученными с использованием традиционных процедур. Мы ожидаем, этот метод будет способствовать использование аутогенно производного COL1 для множества исследований и клинического применения.

Introduction

В течение десятилетий исследователи и коммерческие поставщики выделили солюбилизированного COL1 из ассортимента тканевых источников, включая кожу и сухожилия с помощью некоторые вариации простого протокола экстракции кислотой с последующей нейтрализацией, в результате чего в ресуспендирования матрицы, организованных COL1 фибрилл, которые могут быть использованы для множества биомедицинских приложений ^1-4. В то время как есть много примеров клинических приложений для COL1, некоторые из них используют аутогенно производный COL1 потому подготовка этого белка требует длительных экстракции принимая несколько дней или недель, чтобы выполнить ^5-7. В результате исследований исследователи и врачи обычно используют дорогие, коммерческие препараты COL1, которые получают с помощью нечеловеческие тканей, таких как крысы, быка или свиньи дермы или с использованием кожи удалены из трупов или после обрезания мужчин. Для восстановительных приложений, многие из них изменчивости продукты выставочная с точки зрения их способности сформировать твердоеМатрицы или ткани конструкции, способные поддерживать прикрепление и рост клеток. Следовательно, существует явная необходимость в новом стандартного метода предназначены для быстрого извлечения COL1 из доступного и обильными аутологичных тканевых источников.

Такой метод позволит сэкономить время и деньги в установке исследования, где COL1 могли быть извлечены из животной модели интерес и используется для доклинических испытаний инженерных тканей, собранных на основе коллагена лесов. В то же время, имея возможность использовать быстро изолированы, аутогенно производный COL1 в клинике было бы увеличить общую безопасность для пациентов, которые могли бы получать аллогенных или ксеногенных препараты. Для пациентов, получающих autogeneic подготовку, это обтекаемый метод позволит значительно сократить интервал между сбором биопсии и коллагена применения. По этим причинам, мы стремились улучшить давние методом выделения и очистки COL1 с помощью высокоскоростного AGitation и гель-центрифугирования. Этот метод прост для выполнения с использованием стандартных буферов и оборудования, найденные во многих лабораториях. Используя высокоскоростную агитацию, наш протокол сокращает время, необходимое для выделения растворимого, кожные COL1 от примерно 10 дней до менее чем 3 часа ^8. Важно отметить, что этот метод может быть легко выполнена в клинических условиях с целью подготовки аутогенно производный COL1 для использования у пациентов во время одного набора процедур.

Protocol

Здесь мы продемонстрируем изоляцию COL1 от кожи ягненка. Как написано, этот протокол также может быть использован, чтобы успешно изолировать COL1 из кролика и кожи человека.

1. Подготовка Кожные пробы

1. Уравновесьте все реактивы до 4 ° С до использования.
2. Промыть кожной пробы (25-50 г) в ледяной дН ₂ O и удалите шерсть, мех, или волосы с депиляции кремом.
3. Используйте одно-край лезвия бритвы, чтобы очистить образец чистоте соединительной ткани и жира.
4. Промыть образец в ледяной дН ₂ O.
5. Нарежьте образец кожи в 1 см х 1 см шт с одной кромки лезвия бритвы.

2. Удалить неколлагеновых солюбилизированных Материал

1. Взвесить 5 г образца в 50 мл коническую трубку и добавляют 30 мл ледяной 0,5 М ацетата натрия.
2. Смешайте трубки в течение 1 мин в обстановке м / 6 с использованием адаптера 50 мл трубки в настольном гомогенизатора.
3. Откажитесь вирernatant и повторите в общей сложности 7 ацетата циклов стирки натрия.
4. Промыть образец в ледяной дН ₂ O и перемешивают один раз, чтобы удалить остаточный ацетат натрия.
5. С помощью шпателя для сжатия образца по отношению к стороне трубы для удаления избытка жидкости, а затем передать на свежий 50 мл коническую пробирку.

3. Тип I коллагена Добыча

1. Промыть образец дважды в 2 мл / г 0,075 М буферный цитрат натрия течение 1 мин при 6 м / сек в настольном гомогенизатора сжатия образца и отбрасывая супернатант после каждой промывки.
2. Добавить свежий 2 мл / г аликвоты 0,075 М натрийцитратный буфер для образца.
3. Выполните 6 последовательный 1 мин, 6 м / с циклов настольный гомогенизатор переменная агитации без удаления буфера между каждым циклом.
4. Перенести толстый, прозрачного супернатанта в пробирку.
5. Добавить дополнительный 1 мл / г 0,075 М буфер цитрата натрия к образцу и выполнять один заключительный Настольные гомогенизатора AGITAЦикл Тион.
6. Добавить эту последнюю супернатант в пробирку.
7. Центрифуга пробирку в 3200 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
8. Передача супернатант в верхнем отсеке молекулярной массой 100000 отрезать центробежный фильтрующее устройство.
9. Центрифуга на 3200 мкг в течение 30 мин при 4 ° С.
10. Трансфер очищенного COL1 из верхнего отсека на чистую коническую трубку и хранить при 4 ° С.

Representative Results

Этот протокол изоляции COL1 требуется около 2 ч и 15 мин для завершения. На рисунке 1 показана схема с описанием основные шаги этой процедуры. Подготовка образца и выполнения 7 циклов высокоскоростных волнений и полоскания с ацетата натрия занимает около 35 мин (1А-C). Выполнение одного агитацию и промыть цикл с немецкой шкале ₂ O занимает около 5 мин (рис. 1D и 1E). Добавление цитрата натрия и подвергание данной пробы один перемешивании и полоскания с последующим 6 циклов перемешивании занимает около 45 минут (данные 1F и 1G). Центрифугирование оставшихся твердых частиц из жидкого экстракта занимает 15 мин (рис. 1H). Наконец, перенос образца фильтрующего устройства и выполнением другой стадии центрифугирования, чтобы сконцентрировать очищенный, солюбилизированного COL1 и удалить мелкие белкизанимает 30 минут (фиг. 1I и 1J). Конечный продукт представляет собой концентрированный, высоко-чистый препарат растворимого COL1, которые могут быть дополнительно полимеризуют путем добавления Na ₂ HCO ₃ и инкубации при 37 ° С Фазовые контрастной микроскопии снимки этот продукт затвердевает показывают COL1 фибриллы, которые могут служить в качестве субстрата для прикрепления клеток на культуре ткани пластин или быть использованы в качестве каркаса для 3-D тканевой инженерии (фиг.2А и 2В).

Рисунок 1. Схематический обзор усовершенствованного способа изоляции COL1. A) Ломтики дермы добавляют к 50 мл коническую трубку. B) 0,5 М ацетата натрия добавляют к образцу. С)Образец подвергают 7 циклов перемешивании с натрий-ацетатного буфера заменены после каждого цикла. D) дН ₂ O добавляют к образцу кожи. E) Препарат подвергается один цикла перемешивания и дН ₂ O сливают. F) 0,075 М цитрат натрия добавляют к образцу. G) Образец подвергают 6 циклам перемешивании. Н) Образец центрифугируют для удаления крупных твердых частиц. I) Супернатант переносили в молекулярной массой 100000 отрезать центробежный блок фильтров в коническую трубку. Дж) Это устройство центрифугировали и вязкую жидкость, которая остается в верхнем отсеке собирают.

Рисунок 2. Быстрая развязка сюдам дерма с получением COL1 полимеризуют в фибриллы. Растворимый COL1 нейтрализовали добавлением Na ₂ HCO ₃ и затем инкубировали при 37 ° С Фазового контраста изображения (А) и просвечивающей электронной микрофотографии (показывая сохранившийся д-диапазонов) (В) COL1 волокон, полученных с помощью нашего быстрый метод изоляции. Масштабные бары = 10 мкм и 500 нм (соответственно). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Discussion

Важнейшим компонентом этого метода является повторное эффективное сжатие образца кожного для удаления избытка жидкости. Очень важно, чтобы удалить как можно больше ацетат натрия, как это возможно в шаге 2,5 путем сжатия образца. Мы используем лопаточку, чтобы уплотнить кожу от стороны трубки, однако марлю также могут быть использованы, хотя это потребует удаление образца из трубки и увеличивает время, необходимое для выполнения этих шагов. Кроме того, важно, чтобы сжимать образец на шаге 3.1, так что объем цитрата натрия точна в последующих стадий экстракции. Неспособность адекватно удалить жидкость из образца в любом из этих этапов будет иметь отрицательное воздействие на конечный COL1 выходом. Другим ключевым компонентом этого протокола заключается в поддержании все реагенты при 4 ° С. Это обеспечивает эффективную экстракцию кислотных солюбилизированного COL1 и предотвращает затвердевание коллагена. Кроме того, процедура может быть выполнена с использованием всехстерильные реагенты в стерильной среде. Это было бы особенно важно для тех, кто желает использовать этот метод, чтобы изолировать COL1 для использования в организме человека. Многие коммерческие источники COL1 были эффективно стерилизовали гамма-облучением. К сожалению, эта практика значительно снижает его способность образовывать гели из-за фрагментации белка и денатурации ^9,10.

Эта процедура представляет оптимальные условия для извлечения COL1 как это определено из многих экспериментов, выполненных для установления идеальной пропорции образца кожного для буферизации громкости. Добавление более трубок предложено когда исследователь желает использовать эту процедуру для больших образцов кожи. Основываясь на нашем опыте, это не рекомендуется, чтобы добавить больше образец или буфер, чем указано для каждой трубки. Стоит также отметить, что шарики, состоящие из кремнезема, керамики, граната, оксид алюминия, карбид кремния, или оксида циркония, которые обычно используются в сочетании с бEnch-топ гомогенизаторы, опущены из нашей процедуры. В 6 последовательных циклов 1 мин перемешивания, описанные в шаге 3.3 необходимы вследствие ограничения, введенного нашей агитационной оборудования. Мы можем только перемешивания образец в общей сложности 60 сек, в то время, после чего машина требует остановки. Если у человека есть оборудование, которое может быть установлено в течение 6 мин прямо, это, вероятно, будет прекрасно, чтобы перейти на один, шесть-минутный цикл. Мы, однако, предложить строгое соблюдение образца весом и буферных объемов описанных.

Мы обнаружили, что это способ получения эффективно изолирует растворимый COL1 от баранины, кролика, и образцов человека кожных ^8. С другой стороны, этот протокол не был успешным на очистку COL1 из свиных образцов кожи. Даже с обширными модификации метода, свиной дермы производится непомерную сумму пены из-за остаточных липидов и жиров приводит к неэффективному COL1 экстракции. С другой стороны, COL1 может быть очищен из целых хвостов крысили выделены хвост сухожилия крысы, используя слегка измененный подготовку, которая включает Лизирующий матричные бусы. Это было ранее описано подробно ^8.

Для исследования ученых, потенциальные применения конечного кислотно-солюбилизированного COL1 продукта, полученного с помощью этого метода включают: а) обеспечение адгезивный субстрат для культуральных планшетах для поддержки прикрепление клеток и пролиферацию, б) микро-структурирование поверхностей для 2 - или 3 - мерные (2 - или 3-D) культуры клеток, в) создание 3-D лесов для тканевой инженерии. Хотя некоторые небольшое количество грунта к партии изменчивости и следовало ожидать от любого способа очистки, мы обнаружили, что эти жидкие COL1 препараты последовательно могут быть объединены с различными клеточных популяций и бросил в формы. После нейтрализации рН и потепление, в результате затвердевший инженерии тканей построить с пространственно-ориентированных клеток, равномерно распределенных в матрице. В зависимости от формыплесени, эти конструкции могут быть сделаны в практически любой формы и размера ^3,4,11-14.

Таким образом, по нашему мнению, что наиболее веской причиной, чтобы использовать этот метод является то, что значительно сокращает время и усилия, необходимые для выделения высоко-чистый, растворимый COL1 из аутологичных источника ткани, такие как небольшие биопсии кожи. Метод основан на давно сложившихся процедур и производит продукт, который соответствует или превышает качество дорогих коммерческих препаратов в отношении COL1 чистоты и способности образовывать стабильные 3-D тканей. В то же время, этот упрощенный метод позволяет эффективно и быстро изоляцию аутогенно производного COL1, которые могут быть безопасно использованы для множества клинических приложений.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Centrifuge	Beckman	J6-MI	Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g.