Summary
Traditionele procedures voor de isolatie van oplosbare type 1 collageen (COL1) hebben ongeveer 10 dagen van start tot finish vanwege langdurige buffer incubatie en moeizame resuspensions van fibrillen. We beschrijven hier een middel te zuiveren KOL1 van kleine huid biopten in minder dan 3 uur.
Abstract
Oplosbaar type 1 collageen (COL1) wordt uitgebreid gebruikt als kleefstof substraat voor celculturen en als cellulaire matrix voor regeneratieve toepassingen. Klinisch wordt dit eiwit veel gebruikt voor cosmetische chirurgie, huid injecties, bottransplantatie en reconstructieve chirurgie. De bronnen van KOL1 voor deze procedures vaak humane, die de kans op ontsteking en afwijzing en overdracht xenobiotische ziekte verhoogt. Met het oog hierop zou een methode om snel en efficiënt zuiveren KOL1 van beperkte hoeveelheden autoloog afgeleide weefsels veel van deze problemen te omzeilen, maar standaard isolatietechnieken protocollen lang en vereisen vaak grote hoeveelheden collageen weefsels. Hier tonen we een efficiënte KOL1 extractiewerkwijze dat de tijd die nodig isoleren en zuiveren van dit eiwit van ongeveer 10 dagen tot minder dan 3 uur vermindert. Wij kozen de dermis als onze weefselbron vanwege de beschikbaarheid gedurende vele chirurgische procedures. Tzijn methode gebruikt traditionele extractiebuffers gecombineerd met krachtige agitatie en centrifugale filtratie om zeer zuiver, oplosbaar COL1 verkrijgen van kleine hoeveelheden lederhuid. In het kort worden dermale biopten grondig gewassen in ijskoude dH 2 O na verwijderen van vet, bindweefsel, en haar. De huid monsters worden ontdaan van collagene eiwitten en polysachariden met behulp van 0,5 M natriumacetaat en een hoge snelheid bench-top homogenisator. Collageen van overblijvende vaste stoffen wordt vervolgens geëxtraheerd met een 0,075 M natriumcitraatbuffer met de homogenisator. Deze extracten worden gezuiverd met behulp van 100.000 MW cut-off centrifugale filters die COL1 bereidingen van vergelijkbare of betere kwaliteit aan commerciële producten of die verkregen met behulp van traditionele procedures opleveren. We verwachten dat deze methode het gebruik van autoloog-afgeleide KOL1 voor een veelheid van onderzoek en klinische toepassingen te vergemakkelijken.
Introduction
Voor decennia, onderzoekers en commerciële verkopers hebben geïsoleerd oplosbaar KOL1 uit een assortiment van weefselbronnen zoals huid en pezen met een variant van een eenvoudige zuur-extractie protocol gevolgd door neutralisatie, waardoor een resuspensie van een matrix van georganiseerde KOL1 fibrillen die kunnen worden voor een veelheid van biomedische toepassingen 1-4. Hoewel er vele voorbeelden van klinische toepassingen COL1, enkele van deze dienst autoloog afgeleide KOL1 vanwege bereiding van dit eiwit vereist een langdurig extracties nemen dagen of weken uit te voeren 5-7. Daardoor onderzoekonderzoekers en artsen algemeen gebruik van dure, commerciële preparaten van KOL1 die worden bereid met humane weefsels zoals ratten, runder of varkens lederhuid of middels vel verwijderd uit kadavers of na besnijdenis. Voor regeneratieve toepassingen veel van deze producten vertonen variabiliteit wat betreft hun vermogen om vaste vormenmatrices of weefsel constructen kunnen ondersteunen celhechting en groei. Bijgevolg is er een duidelijke behoefte aan een nieuwe gestandaardiseerde methode ontworpen om snel extraheren KOL1 van toegankelijke en overvloedig autoloog weefsel bronnen.
Een dergelijke methode zou zowel tijd als geld te besparen in de onderzoeksomgeving waar COL1 kon worden gewonnen uit het diermodel van belang en wordt gebruikt voor preklinische testen van gemanipuleerde weefsels samengesteld op basis van collageen steigers. Tegelijkertijd heeft de optie om een snel geïsoleerd autoloog-afgeleide KOL1 in de kliniek zou de algemene veiligheid voor patiënten die anders allogene of xenogene preparaten zouden ontvangen toenemen. Voor patiënten die een autogeneic voorbereiding, zou dit gestroomlijnde methode sterk verminderen van de tijd tussen biopsie collectie en collageen toepassing. Daarom wilden we verbeteren lang gevestigde KOL1 isolatie en zuiveringsmethoden met hoge snelheid agtatie en de grootte-uitsluiting centrifugeren. Deze werkwijze is eenvoudig uit te voeren met behulp van standaard buffers en apparatuur in veel laboratoria. Door het gebruik van high-speed agitatie, ons protocol vermindert de tijd die nodig is om te isoleren oplosbaar, dermal COL1 van ongeveer 10 dagen tot minder dan 3 uur 8. Belangrijk is, kan deze werkwijze gemakkelijk worden uitgevoerd in de klinische setting om autoloog afgeleide KOL1 bereiden voor gebruik bij patiënten tijdens een enkele reeks procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hier zullen we de isolatie van COL1 van lamsvlees huid te tonen. Zoals geschreven kan dit protocol worden gebruikt om met succes isoleren KOL1 van konijn en menselijke huid.
1. Bereid Dermal Sample
- Equilibreer alle reagentia tot 4 ° C vóór gebruik.
- Spoel de huid monster (25-50 g) in ijskoud dH 2 O en verwijder alle wol, bont, of haar met ontharingscrème.
- Gebruik een single-edge scheermesje om het monster schoon van bindweefsel en vet te schrapen.
- Spoel het monster in ijskoude dH 2 O.
- Snijd de huid monster in 1 cm x 1 cm stukken met een single-edge scheermesje.
2. Verwijder niet collagene Gesolubiliseerde Materiaal
- Weeg 5 g monster per 50 ml conische buis en voeg 30 ml ijskoude 0,5 M natriumacetaat.
- Meng buizen gedurende 1 min bij 6 m / sec instelling met een 50 ml buisje adapter in bench-top homogenisator.
- Gooi supernatant en herhaal voor een totaal van 7 natriumacetaat wasbeurten.
- Het monster spoelen in ijskoud dH 2 O en meng een keer om de resterende natriumacetaat verwijderen.
- Gebruik een spatel om het monster tegen de zijkant van de buis comprimeren om overtollige vloeistof te verwijderen en vervolgens over een nieuwe 50 ml conische buis.
3. Type I collageen Extraction
- Was tweemaal het monster in 2 ml / g 0,075 M natriumcitraat buffer gedurende 1 min bij 6 m / sec in bench-top homogenisator comprimeren het monster en gooi de supernatant na elke wasbeurt.
- Voeg een nieuwe 2 ml / g deel van 0,075 M natriumcitraat buffer aan het monster.
- Voer 6 sequentiële 1 min., 6 m / sec bench-top homogeniseerapparaat mix cycli van agitatie zonder het verwijderen van de buffer tussen elke cyclus.
- Breng de dikke, heldere supernatant naar een verzameling buis.
- Voeg een extra 1 ml / g 0.075 M natriumcitraatbuffer aan het monster en het uitvoeren van een laatste bench-top homogeniseerapparaat agitatie cyclus.
- Voeg deze laatste supernatant naar een verzameling buis.
- Centrifugeer de verzamelbuis bij 3200 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Breng de bovenstaande naar de top compartiment van een 100.000 molecuulgewicht afgesneden centrifugaalfilter apparaat.
- Centrifugeer bij 3200 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Breng de gezuiverde KOL1 van het bovenste compartiment een schone conische buis en bewaar bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit COL1 isolatie protocol vereist ongeveer 2 uur en 15 minuten in beslag. Figuur 1 toont een schematisch diagram waarin de belangrijkste stappen in deze procedure. De voorbereiding van het monster en het uitvoeren van de 7 cycli van high-speed beroeringen en spoelt met natriumacetaat duurt ongeveer 35 min (figuren 1A-C). Het uitvoeren van een agitatie en spoel cyclus met dH 2 O duurt ongeveer 5 minuten (figuren 1D en 1E). Natriumcitraat toe te voegen en het onderwerpen van het monster aan een agitatie en spoel cyclus gevolgd door 6 cycli van agitatie duurt ongeveer 45 min (fig. 1F en 1G). Centrifugeren de resterende vaste stoffen uit de vloeistof extract duurt 15 minuten (Figuur 1H). Ten slotte, de overdracht van het monster aan een filter apparaat en het uitvoeren van een andere centrifugeren stap om het gezuiverde, opgeloste COL1 concentreren en verwijder kleine eiwittenduurt 30 min (fig. 1I en 1J). Het eindproduct is een geconcentreerd, zeer zuivere bereiding van oplosbare KOL1 die verder kunnen worden gepolymeriseerd door toevoeging Na 2 HCO 3 en incubatie bij 37 ° C. Fase contrast microscopie foto van het gestolde product blijkt KOL1 fibrillen die als substraat voor celhechting aan weefselkweekplaten of gebruikt als een matrix voor 3-D tissue engineering toepassingen (Figuren 2A en 2B) kunnen dienen.
Figuur 1. Schematisch overzicht van de verbeterde KOL1 isolatiemethode. A) Gesneden dermis wordt toegevoegd aan een 50 ml conische buis. B) 0,5 M natriumacetaat wordt toegevoegd aan het monster. C) demonster wordt onderworpen aan 7 cycli van roeren met natriumacetaatbuffer vervangen na elke cyclus. D) dH 2 O wordt toegevoegd aan het huidmonster. E) Het preparaat wordt onderworpen aan 1 cyclus van agitatie en dH 2 O wordt afgegoten. F) 0,075 M natriumcitraat toegevoegd aan het monster. G) Het monster wordt onderworpen aan 6 cycli van agitatie. H) Het monster wordt gecentrifugeerd om grote deeltjes te verwijderen. I) Het supernatant wordt overgebracht naar een 100.000 molecuulgewicht af centrifugale filtereenheid een conische buis. J) Dit toestel wordt gecentrifugeerd en de stroperige vloeistof die in het bovenste compartiment blijft wordt verzameld.
Figuur 2. Snelle isolatie from dermis KOL1 gepolymeriseerd tot fibrillen verkregen. Oplosbaar KOL1 werd geneutraliseerd door toevoeging van Na 2 HCO 3 en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C. Een afbeelding fase contrast (A) en transmissie electronen microscoop (met de bewaarde d-banding) (B) van COL1 fibrillen gegenereerd met behulp van onze snelle isolatie methode. Schaal bars = 10 micrometer en 500 nm (respectievelijk). Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een essentieel onderdeel van deze methode is de herhaalde efficiënte compressie van de huid monster om overtollige vloeistof te verwijderen. Het is cruciaal om zoveel natriumacetaat mogelijk in stap 2.5 verwijderen door het monster comprimeren. We gebruiken een spatel om de huid tegen de zijkant van de buis compact, maar kan kaasdoek worden gebruikt, hoewel dit het verwijderen van het monster zou vergen van de buis en verhogen de tijd nodig om deze stappen uitvoert. Evenzo is het belangrijk om het monster in stap 3.1 comprimeren zodat het volume natriumcitraat juist in de daaropvolgende extractiestappen is. Gebrek aan vloeistof uit het monster in een van deze stappen adequaat te verwijderen zal een nadelig effect op de uiteindelijke COL1 rendement hebben. Een ander belangrijk onderdeel van dit protocol alle reagentia houden bij 4 ° C. Dit garandeert een efficiënte extractie van zuur oplosbaar KOL1 en voorkomt stolling van het collageen. Daarnaast kan de procedure worden uitgevoerd met allesteriel reagens in een steriele omgeving. Dit zou van bijzonder belang zijn voor diegenen die deze methode KOL1 isoleren voor gebruik bij mensen te gebruiken. Veel commerciële bronnen van COL1 werden effectief gesteriliseerd met gammastraling. Helaas is deze praktijk vermindert het vermogen om gels door eiwitfragmentatie en denaturatie 9,10 vormen.
Deze procedure is de optimale omstandigheden voor KOL1 extractie bepaald uit vele experimenten uitgevoerd om de ideale verhouding van dermale steekproef vast volume buffer. De toevoeging van meer buizen voorkeur wanneer de onderzoeker wenst te gebruiken procedure voor groter huidmonsters. Op basis van onze ervaring, is het niet raadzaam om meer monster toe te voegen of buffer dan het voor elke buis. Het is vermeldenswaard dat kralen uit silica, keramiek, granaat, aluminiumoxide, siliciumcarbide of zirkoonoxide, die gewoonlijk worden gebruikt in combinatie met bench-top homogeniseerders, worden weggelaten uit onze procedure. De 6 sequentiële 1 min agitatie cycli in stap 3.3 beschreven die nodig zijn als gevolg van een beperking opgelegd door onze agitatie apparatuur. Alleen het monster roeren in totaal 60 seconden per keer, waarna de machine stilstand vereist. Als men apparatuur die kan worden ingesteld op 6 min rechte, zou het waarschijnlijk goed omschakelen naar een zes-minuten cyclus. Wij hebben echter, suggereren strikte naleving van de af te wegen en buffer volumes beschreven.
We hebben gevonden deze bereidingswijze efficiënt isoleert oplosbaar COL1 van lam, konijn, en de menselijke huid monsters 8. Aan de andere kant, dit protocol was niet succesvol bij het zuiveren COL1 van varkenshuidmonsters. Zelfs met uitgebreide modificaties van de werkwijze, varkens dermis produceerde een buitensporige hoeveelheid schuim door residuele lipiden en vetten waardoor inefficiënte COL1 extractie. Omgekeerd kan COL1 worden gezuiverd uit hele staarten ratof geïsoleerd rattenstaart pezen met een licht gewijzigde voorbereiding die lyseren matrix kralen omvat. Dit is eerder beschreven 8.
Voor onderzoekers, de gebruiksmogelijkheden van het uiteindelijke zuur-oplosbaar KOL1 verkregen middels deze methode zijn: a) een kleefmiddel substraat voor kweekplaten celbinding en proliferatie ondersteunen, b) micro-patroonvorming van oppervlakken voor 2 - of 3 - dimensionale (2 - of 3-D) celkweek, en c) de oprichting van 3-D scaffolds voor tissue engineering toepassingen. Sommige kleine hoeveelheid partij tot batch variabiliteit wordt verwacht van een zuiveringsmethode, hebben wij gevonden dat deze vloeibare preparaten KOL1 consequent kunnen worden gecombineerd met diverse celpopulaties en gegoten in mallen. Na neutraliseren van de pH en opwarming, het resultaat is een gestolde ontworpen weefselconstruct met ruimtelijk-gerichte cellen gelijkmatig verdeeld over de matrix. Afhankelijk van de vorm van deschimmels, kunnen deze constructen worden in vrijwel elke vorm en grootte 3,4,11-14.
Samengevat, het is onze mening dat de meest dwingende reden om deze methode te gebruiken is dat het dramatisch vermindert de tijd en inspanning die nodig is om te isoleren zeer zuiver, oplosbaar COL1 uit een autoloog weefsel bron zoals kleine huidbiopsies. De methode is gebaseerd op reeds lang bekende procedures en produceert een product dat voldoet aan of overtreft de kwaliteit van dure commerciële preparaten betreft KOL1 zuiverheid en het vermogen om stabiele 3-D weefsels maken. Tegelijkertijd, maakt deze vereenvoudigde werkwijze efficiënte en snelle isolatie van autoloog-afgeleide KOL1 die veilig kan worden gebruikt voor een veelheid aan klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van de National Institutes of Health (HL068915 naar DBC), een in New Onderzoeker Award van het Fonds Thrasher Onderzoek (naar CAP), een Grant-in-Aid van de American Heart Association (12GRNT11910008 naar DBC) , een onderzoek subsidie van de Children's Heart Foundation (naar DBC), en donaties aan Ziekenhuis hartgeleiding Fonds de Boston Children's, de Ryan Family Endowment, en door David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
