Summary
Les procédures traditionnelles pour l'isolement de soluble de type 1 collagène (COL1) nécessitent environ 10 jours à partir de début à la fin en raison d'incubations de tampons de longues et laborieuses remises en suspension de fibrilles. Ici, nous décrivons un moyen de purifier COL1 de petites biopsies cutanées en moins de 3 heures.
Abstract
Type de collagène soluble 1 (COL1) est largement utilisé comme un substrat adhésif pour des cultures de cellules et comme échafaudage pour des applications de régénération cellulaire. Cliniquement, cette protéine est largement utilisé pour la chirurgie esthétique, les injections par voie cutanée, greffe osseuse, et la chirurgie reconstructrice. Les sources de COL1 pour ces procédures sont souvent non-humain, ce qui augmente le potentiel de l'inflammation et de rejet ainsi que la transmission de la maladie des xénobiotiques. Compte tenu de cela, une méthode pour purifier efficacement et rapidement COL1 de quantités limitées de tissus autologue dérivés serait de contourner la plupart de ces questions, mais les protocoles d'isolement classiques sont longues et nécessitent souvent de grandes quantités de tissus de collagène. Ici, nous démontrons une méthode d'extraction COL1 efficace qui réduit le temps nécessaire pour isoler et purifier cette protéine d'environ 10 jours à moins de 3 heures. Nous avons choisi le derme que notre source de tissus en raison de sa disponibilité au cours de nombreuses interventions chirurgicales. Tsa méthode utilise des tampons d'extraction traditionnelles combinées avec une agitation énergique et filtration centrifuge pour obtenir très pur, COL1 soluble de petites quantités de corium. Brièvement, des biopsies dermiques sont lavées à fond dans glacée dH 2 O après élimination de la graisse, le tissu conjonctif, et les cheveux. Les échantillons de peau sont dépouillés de protéines non collagéniques et des polysaccharides à l'aide de 0,5 M d'acétate de sodium et d'un homogénéisateur de paillasse à grande vitesse. Le collagène de solides résiduels est ensuite extrait avec un tampon de citrate de sodium 0,075 M à l'aide de l'homogénéisateur. Ces extraits sont purifiés en utilisant des filtres de 100 000 MW de coupure centrifuges qui produisent des préparations COL1 de qualité comparable ou supérieure à celle des produits du commerce ou de ceux obtenus en utilisant des procédures traditionnelles. Nous prévoyons que cette méthode facilitera l'utilisation de COL1 autologue dérivée pour une multitude de recherche et les applications cliniques.
Introduction
Pendant des décennies, les chercheurs et les fournisseurs commerciaux ont isolé solubilisé COL1 à partir d'un assortiment de sources tissulaires, y compris la peau et des tendons à l'aide des variations d'un protocole d'extraction de l'acide simple, suivie d'une neutralisation, ce qui conduit à une remise en suspension d'une matrice de fibrilles COL1 organisés qui peut être utilisé pour une multitude d'applications biomédicales 4.1. Bien qu'il existe de nombreux exemples d'applications cliniques pour COL1, quelques-uns de ces emploient COL1 autologue dérivée parce que la préparation de cette protéine nécessite de longues extractions de prendre des jours ou des semaines pour effectuer 5-7. En conséquence, les enquêteurs de la recherche et les médecins utilisent généralement coûteux, les préparations commerciales de COL1 qui sont préparés à partir de tissus non humains tels que le rat, le boeuf, ou corium porcine ou en utilisant la peau retirée de cadavres ou après la circoncision. Pour les applications de régénération, beaucoup de ces produits présentent la variabilité par rapport à leur capacité à former solidedes matrices ou des constructions de tissu capables de supporter la fixation et la croissance cellulaires. Par conséquent, il ya un net besoin d'une nouvelle méthode normalisée conçu pour extraire rapidement COL1 à partir de sources de tissus autologues accessibles et abondantes.
Une telle méthode permettrait d'économiser à la fois temps et argent dans le cadre de la recherche où COL1 pourrait être extrait du modèle animal d'intérêt et utilisé pour les essais précliniques de tissus modifiés assemblés sur des échafaudages à base de collagène. Dans le même temps, ayant la possibilité d'utiliser, d'une manière autologue COL1 dérivé rapidement isolées en clinique augmenterait la sécurité globale des patients qui seraient autrement recevoir allogénique ou xénogénique préparations. Pour les patients recevant une préparation autogène, cette méthode simplifiée permettrait de réduire considérablement l'intervalle entre la collecte de biopsie et de l'application de collagène. Pour ces raisons, nous avons cherché à améliorer une méthode d'isolement et de purification COL1 établie de longue date en utilisant ag haut débititation et d'exclusion de taille centrifugation. Cette méthode est simple à réaliser en utilisant des tampons et les équipements standards trouvés dans de nombreux laboratoires. En employant une agitation à grande vitesse, notre protocole réduit le temps nécessaire pour isoler soluble, cutanée COL1 d'environ 10 jours à moins de 3 h 8. Fait important, cette méthode peut être facilement réalisée dans le cadre clinique pour préparer COL1 dérivé autologue pour une utilisation chez les patients au cours d'une seule série de procédures.
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Protocol
Ici, nous allons démontrer l'isolement de COL1 de peau d'agneau. Comme écrit, ce protocole peut également être utilisé pour isoler avec succès COL1 de lapin et de la peau humaine.
Une. Préparer cutanée échantillon
- Tous les réactifs s'équilibrer à 4 ° C avant utilisation.
- Rincer échantillon cutanée (25-50 g) dans de la glace-froid dH 2 O et retirez tout laine, fourrure, ou les cheveux avec de la crème dépilatoire.
- Utilisez une lame de rasoir unique de pointe pour gratter l'échantillon de tissu propre et la graisse.
- Rincer l'échantillon dans de la glace-froid dH 2 O.
- Couper l'échantillon de peau de 1 cm x 1 cm morceaux avec une lame de rasoir unique de bord.
2. Retirer collagènes solubilisés Matériel
- Peser 5 g d'échantillon de 50 ml par tube conique et ajouter 30 ml de 0,5 M d'acétate de sodium par de la glace.
- Mélanger les tubes pendant 1 min à la mise en m / s ou 6 à l'aide d'un adaptateur de tube de 50 ml dans l'homogénéisateur de paillasse.
- Jeter supernatant et répéter pour un total de 7 acétate de sodium cycles de lavage.
- Rincer l'échantillon dans de la glace-froid dH 2 O et mélanger une fois pour éliminer l'acétate de sodium résiduel.
- Utilisez une spatule pour comprimer l'échantillon contre le côté du tube pour enlever l'excès de liquide, puis les transférer à un 50 ml nouveau tube conique.
3. Collagène de type I Extraction
- Laver deux fois dans l'échantillon de 2 ml / g 0,075 M de tampon citrate de sodium pendant 1 min à 6 m / sec dans la paillasse homogénéisateur comprimant l'échantillon et élimination du surnageant après chaque lavage.
- Ajouter une 2 ml / g de portion aliquote fraîche du tampon citrate 0,075 M de sodium à l'échantillon.
- Effectuez 6 séquentielle 1 min, 6 m / s paillasse homogénéisateur mélange cycles d'agitation sans enlever le tampon entre chaque cycle.
- Transférer l'épaisse surnageant clair à un tube de collecte.
- Ajouter un tampon de citrate de sodium 0,075 M supplémentaire de 1 ml / g de l'échantillon et effectuer une dernière paillasse homogénéisateur agitationcycle tion.
- Ajouter cette surnageant final à un tube de collecte.
- Centrifuger le tube de prélèvement à 3200 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Transférer le surnageant dans le compartiment supérieur d'un poids moléculaire de 100.000 couper dispositif de filtre centrifuge.
- Centrifuger à 3200 g pendant 30 min à 4 ° C.
- Transférer la COL1 purifié à partir du compartiment supérieur à un tube conique et conserver à 4 ° C.
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Representative Results
Ce protocole d'isolement COL1 nécessite environ 2 heures et 15 minutes à compléter. La figure 1 montre un schéma décrivant les principales étapes de cette procédure. Préparation de l'échantillon et d'effectuer les 7 cycles de agitations à grande vitesse et se rince avec de l'acétate de sodium prend environ 35 min (figures 1A-C). Effectuer une agitation et le cycle de rinçage avec dH 2 O prend environ 5 min (figures 1D et 1E). Ajoutant du citrate de sodium et à soumettre l'échantillon à une agitation et rinçage du cycle suivi par six cycles d'agitation dure environ 45 min (figures 1F et 1G). Centrifugation des solides restants de l'extrait liquide prend 15 min (figure 1H). Enfin, le transfert de l'échantillon vers un dispositif de filtre et d'effectuer une autre étape de centrifugation pour concentrer l', COL1 solubilisée purifiée et éliminer les petites protéinesprend 30 min (figures 1I et 1J). Le produit final est une préparation concentrée et hautement pure de COL1 soluble qui peut encore être polymérisé par addition de Na 2 HCO 3 et en incubant à 37 ° C. Contraste de phase des images de microscopie de ce produit solidifié révéler COL1 fibrilles qui pourraient servir de substrat pour la fixation des cellules sur des plaques de culture de tissu ou être utilisé comme un échafaudage pour 3-D des applications de génie tissulaire (Figures 2A et 2B).
Figure 1. Vue d'ensemble schématique de la méthode d'isolement COL1 améliorée. A) derme en tranches, on ajoute 50 ml d'un tube conique. B) de l'acétate de sodium 0,5 M est ajouté à l'échantillon. C) L'l'échantillon est soumis à sept cycles d'agitation avec un tampon d'acétate de sodium remplacés après chaque cycle. D) dH 2 O est ajouté à l'échantillon de peau. E) La préparation est soumise à une cycle de l'agitation et de dH 2 O est versé hors tension. F) 0,075 citrate de sodium M est ajouté à l'échantillon. G) L'échantillon est soumis à 6 cycles d'agitation. H) L'échantillon est centrifugé pour éliminer les gros solides. I) Le surnageant est transféré à un poids moléculaire de 100.000 couper unité de filtre centrifuge un tube conique. J) Cette unité est centrifugée et le liquide visqueux qui reste dans le compartiment supérieur est recueillie.
Figure 2. D'isolement rapide vientm derme pour donner COL1 polymérisé en fibrilles. Soluble COL1 a été neutralisé par addition de Na 2 HCO 3 et ensuite incubé à 37 ° C. Une image en contraste de phase (A) et au microscope électronique à transmission (affichant le d-banding conservé) (B) de fibrilles COL1 générées à l'aide de notre procédé d'isolement rapide. Barres d'échelle = 10 um et 500 nm (respectivement). Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Un élément essentiel de cette méthode est la compression efficace répétée de l'échantillon cutané pour éliminer l'excès de liquide. Il est essentiel d'éliminer l'acétate de sodium, autant que possible à l'étape 2.5 en comprimant l'échantillon. On utilise une spatule pour compacter la peau contre le côté du tube, mais étamine pourrait également être utilisé, bien que cela nécessiterait le retrait de l'échantillon à partir du tube et augmenter le temps nécessaire pour effectuer ces étapes. De même, il est important pour comprimer l'échantillon dans l'étape 3.1 de telle sorte que le volume de citrate de sodium est précis dans les étapes ultérieures d'extraction. Ne pas retirer suffisamment de liquide de l'échantillon dans une de ces étapes aura un effet néfaste sur le rendement COL1 finale. Un autre élément clé de ce protocole est de maintenir tous les réactifs à 4 ° C. Cela garantit l'extraction efficace de COL1 solubilisé acide et empêche la solidification du collagène. En outre, la procédure peut être réalisée en utilisant touteréactifs stériles dans un environnement stérile. Ce serait d'une importance particulière pour ceux qui souhaitent utiliser cette méthode pour isoler COL1 pour une utilisation chez l'homme. Beaucoup de sources commerciales de COL1 ont été effectivement stérilisée par irradiation gamma. Malheureusement, cette méthode réduit considérablement son aptitude à former des gels en raison de la fragmentation et dénaturation des protéines 9,10.
Cette procédure représente les conditions optimales pour l'extraction COL1 déterminés à partir de nombreuses expériences réalisées pour établir la proportion idéale de l'échantillon cutané pour tamponner volume. L'ajout de plusieurs tubes est suggéré lorsque l'enquêteur souhaite employer cette procédure pour les grands échantillons de peau. Basé sur notre expérience, il n'est pas conseillé d'ajouter un échantillon plus ou tampon que celui indiqué pour chaque tube. Il est également intéressant de noter que les perles constituées de silice, la céramique, le grenat, l'oxyde d'aluminium, carbure de silicium, ou d'oxyde de zirconium, qui sont couramment utilisés en association avec bench-haut homogénéisateurs, sont omis de notre procédure. Les 6 cycles séquentiels 1 min d'agitation décrites dans l'étape 3.3 sont nécessaires en raison d'une limitation imposée par notre équipement d'agitation. Nous ne pouvons agiter l'échantillon pour un total de 60 secondes à la fois, après quoi la machine nécessite un arrêt. Si on a l'équipement qui peut être réglé pour 6 min droite, il serait probablement bien passer à l'une, cycle de six minutes. Nous ne proposons cependant le strict respect des volumes de poids et de tampons échantillons décrits.
Nous avons trouvé cette méthode de préparation isole efficacement COL1 soluble de l'agneau, lapin, et des échantillons dermiques humains 8. D'autre part, ce protocole n'a pas réussi à purifier COL1 à partir d'échantillons de peau de porc. Même avec d'importantes modifications à la méthode, le derme de porc produites un montant exorbitant de mousse en raison de lipides résiduels et de la graisse résultant de l'extraction COL1 inefficace. Inversement, COL1 peut être purifié à partir de queues de rat entiersou tendons de queue de rat isolé à l'aide d'une préparation légèrement modifié qui comprend des billes de matrice de lyse. Ceci a été décrit précédemment en détail 8.
Pour les chercheurs, les utilisations potentielles du produit COL1 finale acide solubilisé obtenu en utilisant cette méthode: a) fournir un substrat adhésif pour plaques de culture pour soutenir l'attachement et la prolifération cellulaire, b) micro-structuration de surfaces pour 2 - ou 3 - dimensions (2 - ou 3-D) culture de cellules, et c) la création d'échafaudages en 3-D pour des applications d'ingénierie tissulaire. Alors que certains petite quantité de variabilité de lot à lot est à prévoir à partir de n'importe quel procédé de purification, nous avons constaté que ces préparations liquides COL1 sont toujours capables de se combiner avec diverses populations de cellules et coulé dans des moules. Après neutralisation, le pH et le réchauffement, le résultat est une construction d'ingénierie tissulaire solidifié avec des cellules orientées spatialement distribuées uniformément dans toute la matrice. En fonction de la forme de l'moule, ces constructions peut être fait dans n'importe quelle forme et la taille 3,4,11-14.
En résumé, il est de notre avis que la raison la plus convaincante d'utiliser cette méthode est qu'elle réduit considérablement le temps et les efforts nécessaires pour isoler très pur, COL1 soluble à partir d'une source de tissu autologue tels que des biopsies de la peau. La méthode est basée sur les procédures établies de longue date et donne un produit qui respecte ou dépasse la qualité des préparations commerciales coûteuses par rapport à la pureté COL1 et la capacité à former des tissus stables 3-D. Dans le même temps, cette méthode simplifiée permet l'isolement efficace et rapide des COL1 autologue dérivé qui peut être utilisé en toute sécurité pour une multitude d'applications cliniques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche des Instituts nationaux de la santé (HL068915 DBC), une nouvelle bourse de nouveau chercheur du Fonds de recherche Thrasher (pour PAC), un Grant-in-Aid de l'American Heart Association (12GRNT11910008 à DBC) , une subvention de la Fondation des enfants de coeur (DBC), et les dons à l'hôpital conduction cardiaque Fonds pour enfants de Boston, la Fondation de famille de Ryan, et par David Pullman recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
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