Summary
Traditionelle Verfahren zur Isolierung von löslichen Typ-1-Kollagen (COL1) benötigen etwa 10 Tage von Anfang an wegen der langwierigen und mühsamen Puffer Inkubationen Resuspensionen von Fibrillen zu beenden. Hier beschreiben wir ein Mittel, um COL1 von kleinen Hautbiopsien in weniger als 3 Stunden zu reinigen.
Abstract
Lösliche Typ-1-Kollagen (COL1) wird weitgehend als Klebstoff Substrat für Zellkulturen sowie als Zellgerüst für regenerative Anwendungen verwendet. Klinisch wird dieses Protein häufig für kosmetische Chirurgie, Hautinjektionen, Knochentransplantation, und rekonstruktive Chirurgie. Die Quellen der COL1 für diese Verfahren sind allgemein nicht-menschlichen, welche das Potential für eine Entzündung und Ablehnung sowie xenobiotischen Krankheitsübertragung erhöht. Im Hinblick darauf wäre ein Verfahren, um schnell und effizient zu reinigen COL1 von begrenzten Mengen von autolog abgeleiteten Gewebe umgehen viele dieser Probleme, jedoch sind Standardisolierungsprotokolle langwierig und erfordern große Mengen an kollagenem Gewebe oft. Hier zeigen wir ein effizientes COL1 Extraktionsmethode, die die benötigte Zeit, um von ungefähr 10 Tage zu isolieren und zu reinigen, dieses Protein auf weniger als 3 h reduziert. Wir wählten die Dermis als unsere Gewebequelle wegen seiner Verfügbarkeit in vielen chirurgischen Verfahren. Tseine Methode verwendet traditionelle Extraktionspuffer kombiniert mit kraftvollen Bewegung und Zentrifugalfiltration zu hochreinem, lösliche COL1 von kleinen Mengen von Lederhaut erhalten. Kurz gesagt, Hautbiopsien werden gründlich in eiskaltem dH 2 O nach Entfernen von Fett, Bindegewebe und Haare gewaschen. Die Hautproben werden von nicht-kollagenen Proteinen und Polysacchariden unter Verwendung von 0,5 M Natriumacetat und eine Hochgeschwindigkeitslabortisch-Homogenisators abgestreift. Kollagen von restlichen Feststoffen wird anschließend mit einer 0,075 M Natriumcitrat-Puffer unter Verwendung eines Homogenisators extrahiert. Diese Extrakte werden mit 100.000 MW Cut-off-Filter, die Kreisel COL1 Zubereitungen der vergleichbare oder überlegene Qualität, kommerzielle Produkte oder solche mit herkömmlichen Verfahren gereinigt, erhalten. Wir erwarten, dieses Verfahren die Verwendung von autologen abgeleiteten COL1 für eine Vielzahl von Forschungs-und klinischen Anwendungen zu erleichtern.
Introduction
Seit Jahrzehnten haben Wissenschaftler und kommerzielle Anbieter solubilisierten COL1 aus einem Sortiment von Gewebequellen, einschließlich Haut und Sehnen mit irgendeiner Variation eines einfachen Säure-Extraktionsprotokolls, gefolgt von Neutralisation, die in einer Resuspendierung aus einer Matrix organisiert COL1 Fibrillen führt, die verwendet werden können, isoliert für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen 1-4. Zwar gibt es viele Beispiele für klinische Anwendungen für COL1, einige von diesen beschäftigen autolog stamm COL1 weil Herstellung dieses Proteins erfordert langwierige Extraktionen unter Tage oder Wochen auf 5-7 durchzuführen. Als Ergebnis der Forschung Forscher und Ärzte verwenden in der Regel teuer, Handelspräparate, die unter Verwendung von COL1 nicht-menschlichen Geweben wie Ratten, Rinder-, Schweine-oder Lederhaut oder über die Haut von Leichen entfernt oder nach der Beschneidung von Männern zubereitet werden. Für regenerative Anwendungen sind viele dieser Produkte zeigen Variabilität in Bezug auf ihre Fähigkeit, feste bildenMatrices oder Gewebe-Konstrukte in der Lage ist die Zellhaftung und Wachstum. Folglich gibt es einen deutlichen Bedarf für eine neue standardisierte Methode entwickelt, um schnell zu extrahieren COL1 aus zugänglich und reichlich autologen Gewebequellen.
Ein derartiges Verfahren würde Zeit und Geld in die Forschung, in dem COL1 konnte aus dem Tiermodell von Interesse extrahiert und für die präklinische Prüfung von technischen Geweben auf Kollagenbasis Gerüste montiert werden zu speichern. Gleichzeitig würde mit der Möglichkeit, eine schnell isoliert, autolog stamm COL1 in der Klinik die allgemeine Sicherheit für die Patienten, die sonst erhalten würde allogenen oder xenogenen Vorbereitungen zu erhöhen. Bei Patienten, die eine autogenen Vorbereitung, würde dies die vereinfachte Verfahren stark das Intervall zwischen Biopsie-Sammlung und Kollagen-Anwendung zu reduzieren. Aus diesen Gründen haben wir versucht, auf eine lange etablierte COL1 Isolierung und Reinigung Verfahren unter Verwendung von High-Speed-ag verbessernitation und Größenausschluss-Zentrifugation. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen unter Verwendung von Standardpuffern und in vielen Labors gefunden. Durch den Einsatz von High-Speed-Agitation, reduziert unsere Protokoll die notwendige Zeit, um lösliche, Haut COL1 von etwa 10 Tagen auf weniger als 3 Stunden 8 zu isolieren. Wichtig ist, dass diese Methode kann leicht in der Klinik, um autolog stamm COL1 zur Anwendung bei Patienten während einer einzigen Reihe von Verfahren durchgeführt werden, vorzubereiten.
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Protocol
Hier werden wir die Isolierung von COL1 aus Lammfell zu demonstrieren. Wie geschrieben, kann dieses Protokoll auch verwendet, um erfolgreich von Kaninchen und die menschliche Haut zu isolieren COL1 werden.
1. Bereiten Dermal Beispiel
- Ins Gleichgewicht alle Reagenzien auf 4 ° C vor der Verwendung.
- Spülen Hautprobe (25-50 g) in eiskaltem dH 2 O und entfernen Sie alle Wolle, Fell oder Haare mit Enthaarungscreme.
- Verwenden Sie einen einzelnen Rasierklinge, um die Probe frei von Bindegewebe und Fett zu kratzen.
- Die Probe in eiskaltem dH 2 O spülen
- Schneiden Sie die Hautprobe in 1 cm x 1 cm große Stücke mit einer einzigen Rasierklinge.
2. Entfernen kollagenen Solubilized Werkstoff
- Wiegen Sie 5 g der Probe pro 50 ml konischen Röhrchen und 30 ml eiskaltem 0,5 M Natriumacetat.
- Mix Röhrchen für 1 min bei 6 m / sec Einstellung mit einem 50-ml-Tube-Adapter in der Tisch-Homogenisator.
- Entsorgen supernatant und wiederholen Sie für insgesamt 7 Natriumacetat Waschzyklen.
- Spülen Sie die Probe in eiskaltem dH 2 O und mischen Sie einmal, um Rest Natriumacetat zu entfernen.
- Verwenden Sie einen Spachtel, um die Probe gegen die Seite des Rohres zu komprimieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann übertragen auf ein frisches 50 ml konischen Röhrchen.
3. Typ-I-Kollagen-Extraktion
- Die Probe zweimal Waschen in 2 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer für 1 min bei 6 m / sec in der Tisch-Homogenisator Komprimieren der Probe und Verwerfen des Überstandes nach jeder Wäsche.
- Hinzufügen eines neues 2 ml / g Aliquot von 0,075 M Natriumcitrat-Puffer zu der Probe.
- Führen sequentielle 6 1 min, 6 m / sec Tisch Homogenisator Mix Zyklen der Agitation, ohne den Puffer zwischen jedem Zyklus.
- Übertragen Sie die dicke, klare Überstand in ein Sammelrohr.
- Fügen Sie eine weitere 1 ml / g 0,075 M Natriumcitrat-Puffer auf die Probe und führen einen letzten Tisch-Homogenisator agitation Zyklus.
- In diese letzte Überstand in ein Sammelrohr.
- Das Sammelröhrchen zentrifugiert bei 3200 g für 10 min bei 4 ° C.
- Den Überstand in der oberen Kammer eines Molekulargewicht von 100.000 abgeschnitten Kreiselfiltereinrichtung.
- Zentrifugieren bei 3200 × g für 30 min bei 4 ° C
- Übertragen Sie die gereinigten COL1 aus dem oberen Fach zu einer sauberen konischen Rohr und bei 4 ° C
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Representative Results
Diese COL1 Isolation Protokoll benötigt etwa 2 Stunden und 15 Minuten in Anspruch. Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm, das die Hauptschritte in diesem Verfahren. Herstellung der Probe und Durchführen der 7 Zyklen von Hochgeschwindigkeits-Agitation und spült mit Natriumacetat dauert etwa 35 min (Fig. 1A-C). Durchführen einer Agitation und spülen Zyklus mit dH 2 O dauert ca. 5 min (1D und 1E). Hinzufügen von Natriumcitrat und Unterwerfen der Probe einem Rühr-und Spülzyklus, gefolgt von 6 Zyklen von Rühren dauert etwa 45 min (Fig. 1F und 1G). Zentrifugieren der verbleibenden Feststoffe aus dem flüssigen Extrakt dauert 15 min (1H). Schließlich Übertragung der Probe auf eine Filtervorrichtung und Ausführen einer weiteren Zentrifugationsschritt, um das gereinigte, solubilisierte COL1 zu konzentrieren und zu entfernen kleine Proteinedauert 30 min (Abb. 1I und 1J). Das Endprodukt ist eine konzentrierte, hochreine Zubereitung von löslichem COL1, die durch Zugabe von Na 2 HCO 3 und Inkubation bei 37 ° C polymerisiert werden können, Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von dieser verfestigte Produkt offenbaren COL1 Fibrillen, die als Substrat für die Zellbindung an Gewebekulturplatten oder als Gerüst für die 3-D-Gewebe-Engineering-Anwendungen (2A und 2B) verwendet werden, dienen könnte.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der verbesserten COL1 Isolationsmethode. A) Geschnittene Dermis ist mit einem 50 ml konischen Röhrchen. Zugesetztem B) 0,5 M Natriumacetat wird zu der Probe gegeben. C) DieProbe 7 Zyklen von Rühren mit Natriumacetat-Puffer nach jedem Zyklus ersetzt unterworfen. D) dH 2 O auf der Hautprobe zugegeben. E) Die Zubereitung wird 1 Zyklus von Agitation und dH 2 O unterzogen wird abgegossen. F) 0,075 M Natriumcitrat wird auf die Probe. G) Die Probe wird auf 6 Zyklen der Agitation. H) Die Probe wird zentrifugiert, um große Feststoffe zu entfernen aufgenommen. I) Der Überstand wird zu einem Molekulargewicht von 100.000 aus Zentrifugen-Filtereinheit in schnitten übertragen eine konische Röhre. J) Diese Einheit wird zentrifugiert und die viskose Flüssigkeit, die im oberen Fach bleibt gesammelt.
Abbildung 2. Schnelle Isolierung herm Dermis COL1 zu Fibrillen polymerisiert ergeben. Lösliche COL1 wurde durch Zugabe von Na 2 HCO 3 neutralisiert und dann bei 37 ° C inkubiert Eine Phase Kontrast Bild (A) und TEM-Aufnahme (Anzeige der erhaltenen d-Banding) (B) von COL1 Fibrillen, die unter Verwendung unserer schnellen Isolationsmethode. Maßstabsbalken = 10 um und 500 nm (bzw.). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Ein wesentlicher Bestandteil dieses Verfahrens ist die wiederholte effiziente Kompression der Hautprobe, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Es ist wichtig, so viel wie möglich Natriumacetat in Schritt 2.5 durch Komprimieren der Probe zu entfernen. Wir verwenden einen Spatel, um die Haut gegen die Seite der Röhre zu verdichten, jedoch könnte Gaze verwendet werden, obwohl dies die Entfernung der Probe aus dem Rohr erforderlich und erhöht die erforderliche Zeit, um diese Schritte durchzuführen. Ebenso ist es wichtig, um die Probe in Schritt 3.1 zu komprimieren, so dass das Volumen Natriumcitrat korrekt in den nachfolgenden Extraktionsschritte. Nicht ausreichend Flüssigkeit aus der Probe in einem dieser Schritte zu entfernen wird eine nachteilige Wirkung auf die endgültige COL1 Ausbeute. Eine weitere wichtige Komponente dieses Protokolls ist es, alle Reagenzien bei 4 º C zu halten, Dies gewährleistet die effiziente Extraktion von säuresolubilisiertem COL1 und verhindert die Verfestigung des Kollagens. Zusätzlich könnte das Verfahren durchgeführt werden unter Verwendung allersterile Reagenzien in einer sterilen Umgebung. Dies wäre für diejenigen, die diese Methode, um COL1 für den Einsatz beim Menschen isolieren beschäftigen besonderer Bedeutung sein. Zahlreiche kommerzielle Quellen für COL1 wurden effektiv durch Gamma-Bestrahlung sterilisiert. Leider ist diese Praxis stark reduziert seine Fähigkeit, Gele durch Protein-Fragmentierung und Denaturierung 9,10 zu bilden.
Dieses Verfahren stellt die optimalen Bedingungen für COL1 Extraktion aus vielen Experimenten durchgeführt, um den idealen Anteil des dermalen Probe herzustellen Volumen Puffer bestimmt. Die Zugabe von mehr Rohren wird empfohlen, wenn der Prüfer wünscht, dieses Verfahren für größere Hautproben zu verwenden. Basierend auf unserer Erfahrung, es ist nicht ratsam, mehr Beispiel-Add-oder Puffer als für jedes Rohr angedeutet. Es ist auch erwähnenswert, dass Kügelchen aus Kieselsäure, Keramik, Granat, Aluminiumoxid, Siliziumcarbid oder Zirkoniumoxid, die üblicherweise in Verbindung mit b verwendet werden zusammenench-Top-Homogenisatoren, von unserem Verfahren verzichtet. Die in Schritt 3.3 beschrieben sequentielle 6 1 min Agitation Zyklen aufgrund einer Begrenzung durch unsere Agitation Ausrüstung verhängt erforderlich. Wir können nur die Probe zu rühren für insgesamt 60 Sekunden zu einer Zeit, nach der das Gerät erfordert einen Anschlag. Wenn man Geräte, die für 6 min gerade eingestellt werden kann, hat, würde es wahrscheinlich in Ordnung, zu einem, sechs-Minuten-Takt wechseln. Wir legen jedoch nahe, die strikte Einhaltung der beschriebenen Probengewicht und Puffervolumina.
Wir haben gefunden, diese Herstellungsverfahren effizient isoliert löslich COL1 von Lamm, Kaninchen und menschlichen Hautproben 8. Auf der anderen Seite war das Protokoll nicht in die Reinigung COL1 aus Schweinehautproben erfolgreich. Selbst mit umfangreichen Modifikationen der Methode produzierte Schweine Dermis eine exorbitante Menge Schaum, weil der Restfette und Fett was zu einer ineffizienten COL1 Extraktion. Umgekehrt kann COL1 aus ganzen Rattenschwänzen gereinigt werdenoder isolierten Rattenschwanzsehnen mit einem leicht veränderten Vorbereitung, die Lysismatrix Perlen enthält. Dies wurde zuvor detailliert 8 beschrieben.
Für Forscher, die Einsatzmöglichkeiten der endgültigen Säure solubilisierten COL1 Produkt unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten werden, umfassen: a) Bereitstellen eines Klebesubstrats für Kulturplatten Zellhaftung und-proliferation zu unterstützen, b) die Mikrostrukturierung von Oberflächen für 2 - oder 3 - dimensionalen (2 - oder 3-D)-Zellkultur, c) Erstellung von 3D-Gerüst für das Tissue Engineering-Anwendungen. Während eine kleine Menge Lot-zu-Lot-Schwankungen ist, von jedem Reinigungsverfahren erwartet werden kann, haben wir festgestellt, dass diese Flüssigkeit COL1 Zubereitungen sind durchweg in der Lage, mit verschiedenen Zellpopulationen kombiniert und in Formen gegossen werden. Nach Neutralisation des pH-Werts und Erwärmen, so ergibt sich ein verfestigter Werkgewebekonstrukt mit raumbezogenen Zellen über die gesamte Matrix gleichmäßig verteilt sind. Je nach der Form derForm, können diese Konstrukte in nahezu jeder Form und Größe 3,4,11-14 werden.
Zusammenfassend ist es unsere Auffassung, dass der wichtigste Grund, diese Methode zu nutzen, ist, dass es reduziert die Zeit und Aufwand erforderlich, um hochreine, lösliche COL1 von einer autologen Gewebequelle wie kleine Hautbiopsien zu isolieren. Die Methode basiert auf langjährigen Verfahren auf der Grundlage und erzeugt ein Produkt, erfüllt oder übertrifft die Qualität der teuren kommerziellen Vorbereitungen in Bezug auf COL1 Reinheit und die Fähigkeit, stabile 3-D-Gewebe zu bilden. Zugleich ermöglicht dieses vereinfachte Verfahren das effiziente und schnelle Isolierung von autolog abgeleiteten COL1, die sicher für eine Vielzahl von klinischen Anwendungen verwendet werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium von den National Institutes of Health (HL068915 zu DBC), einem New Researcher Award von der Thrasher Research Fund (CAP), ein Grant-in-Aid von der American Heart Association (12GRNT11910008 zu DBC) unterstützt ein Forschungsstipendium von der Kinderherzstiftung (DBC) und Spenden an die Kinderklinik Boston Erregungsleitungsfonds, der Ryan Familiengröße, und von David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
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