Summary
נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות.
Abstract
סוג מסיס קולגן 1 (col1) נעשה שימוש נרחב כמצע דבק לתרביות תאים ופיגום סלולארי ליישומי רגנרטיבית. מבחינה קלינית, חלבון זה נמצא בשימוש נרחב עבור ניתוחים קוסמטיים, זריקות עורי, השתלת עצם, וניתוח שחזור. מקורות col1 לנהלים אלה הם בדרך כלל לא אנושיים, דבר המגדיל את הפוטנציאל לדלקת ודחייה, כמו גם העברת מחלות xenobiotic. לאור זאת, בשיטה יעילה ומהיר כדי לטהר col1 מכמויות מוגבלות של רקמות autologously נגזרות תעקוף רבות של בעיות אלה, עם זאת, פרוטוקולי בידוד סטנדרטיים הם ארוכים ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של collagenous רקמות. הנה, אנחנו מדגימים שיטת חילוץ col1 יעילה המפחיתה את הזמן הדרוש לבודד ולטהר חלבון זה בערך מ 10 ימים פחות מ 3 שעות. אנחנו בחרנו בדרמיס כמקור לרקמות שלנו בגלל זמינותו בהרבה ניתוחים. Tהשיטה שלו משתמשת במאגרי חילוץ מסורתיים בשילוב עם תסיסה חזקה וסינון צנטריפוגלי להשיג מאוד טהור col1, מסיס מכמויות קטנות של גלד. בקצרה, ביופסיות עורי נשטפות ביסודיות ב DH קר כקרח 2 O לאחר הסרת שומן, רקמת חיבור, ושיער. דגימות העור הופשטו מחלבונים והסוכרים noncollagenous באמצעות נתרן אצטט M 0.5 וhomogenizer ספסל העליון במהירות גבוהה. קולגן ממוצקי שיורי מופק לאחר מכן עם חיץ ציטרט הנתרן 0.075 M באמצעות homogenizer. תמציות אלה הם מטוהרים באמצעות 100,000 מסננים MW חתוכים הצנטריפוגלי שיניבו הכנות col1 באיכות דומה או עדיפה על מוצרים מסחריים או לאלה שהושגו באמצעות נהלים מסורתיים. אנו צופים בשיטה זו תאפשר הניצול של col1 autologously נגזר עבור מספר רב של מחקר ויישומים קליניים.
Introduction
במשך עשרות שנים, חוקרים וספקים מסחריים יש לבודד col1 solubilized ממגוון של מקורות, כולל רקמת עור וגידים באמצעות גרסה כלשהי של פרוטוקול פשוט הפקת חומצה ואחרי נטרול, שתוצאתה resuspension של מטריצה של סיבי col1 מאורגנים שניתן להשתמש בי עבור מספר רב של יישומים ביו 1-4. אמנם יש דוגמאות רבות של יישומים קליניים לcol1, כמה מהם להעסיק col1 autologously נגזר בגלל הכנה של חלבון זה דורשת עקירות ארוכות לוקחת ימים או שבועות כדי לבצע 5-7. כתוצאה מכך, חוקרי מחקר ורופאים בדרך כלל להשתמש בתכשירים יקרים, מסחריים של col1 שהוכנו באמצעות רקמות אנושיות כגון חולדה, שור, או גלד חזירי או באמצעות עור הוסר מן הגופות או בעקבות מילת גברים. עבור יישומי משובי, רבים של השתנות אלה תערוכת מוצרים ביחס ליכולת שלהם לצורה מוצקהמטריצות או מבני רקמות מסוגלים לתמוך מצורף תא וצמיחה. כתוצאה מכך, יש צורך מובהק לשיטה סטנדרטית חדשה שנועדה לחלץ במהירות col1 ממקורות רקמות עצמיים נגישים ושפע.
שיטה כזו תחסוך זמן וכסף במסגרת המחקר שבו col1 אפשר להפיק ממודל החיה של עניין ומשמש לבדיקה קליני של רקמות מהונדסות התאספו על פיגומים מבוססי קולגן. במקביל, יש את האפשרות של שימוש במהירות col1 מבודד, autologously נגזר במרפאת יגדיל את הבטיחות הכוללת של חולים שאמורים היה לקבל אלוגנאית או תכשירי xenogeneic. לחולים שקבלו הכנת autogeneic, שיטה יעילה זה תהיה לצמצם במידה ניכרת את המרווח בין אוסף ביופסיה ויישום קולגן. מסיבות אלה, בקשנו לשפר את שיטת בידוד וטיהור col1 הוקמה ארוך באמצעות AG במהירות גבוההitation וצנטריפוגה בגודל הדרה. שיטה זו היא פשוטה לביצוע באמצעות מאגרים סטנדרטיים וציוד שנמצאו במעבדות רבות. על ידי העסקת תסיסה במהירות גבוהה, הפרוטוקול שלנו מקטין את הזמן הדרוש כדי לבודד מסיס col1, עורי מכ 10 ימים פחות מ 3 שעות 8. חשוב מכך, בשיטה זו ניתן לבצע בקלות בסביבה הקלינית על מנת להכין col1 autologously נגזר לשימוש בחולים בקבוצה אחת של נהלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להלן נדגים את בידודה של col1 מעור כבש. כפי שנכתב, פרוטוקול זה יכול לשמש גם לבודד בהצלחה col1 מארנב ועור אנושי.
1. היכונו לדוגמא Dermal
- לאזן את כל חומרים כימיים כדי 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- יש לשטוף את עורי מדגם (25-50 גר ') ב DH קר כקרח 2 O והסר את כל צמר, פרווה, או שיער עם קרם מקריח.
- השתמש בסכין גילוח חד קצה לגרד נקי הדגימה של רקמת שומן וחיבור.
- יש לשטוף את המדגם בקר כקרח DH 2 O.
- פורסים את דגימת העור ל1 סנטימטר x חתיכות 1 סנטימטר בסכין גילוח חד קצה.
2. הסר Noncollagenous solubilized חומר
- לשקול את 5 גרם של מדגם בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של 0.5 נתרן אצטט M קר כקרח.
- מערבבים צינורות 1 דקות ב6 ההגדרה מ '/ השנייה באמצעות מתאם 50 צינור מיליליטר בhomogenizer ספסל העליון.
- בטל supernatant וחזור על פעולה עבור סכום כולל של 7 מחזורים לשטוף נתרן אצטט.
- יש לשטוף את המדגם ב DH קר כקרח 2 O ולערבב פעם אחת כדי להסיר נתרן אצטט שיורית.
- השתמש במרית כדי לדחוס את המדגם על הצד של הצינור כדי להסיר נוזל עודף ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר טרי.
3. הקלד אני קולגן הפקה
- לשטוף את המדגם פעמיים ב 2 מיליליטר / גרם 0.075 M חיץ ציטרט הנתרן 1 דקות ב6 מ '/ השני בhomogenizer ספסל העליון דחיסת המדגם ושלכת supernatant לאחר כל שטיפה.
- הוספת aliquot 2 מיליליטר / גרם טרי של 0.075 חיץ ציטרט M נתרן לדוגמה.
- בצע 6 דקות 1 רציפה, 6 מחזורי תמהיל homogenizer ספסל העליון מ '/ שנייה של תסיסה מבלי להסיר את החיץ בין כל מחזור.
- מעביר את supernatant העבה, ברור לצינור איסוף.
- הוספת חיץ ציטרט נוסף 1 מיליליטר / גרם 0.075 M נתרן למדגם ולבצע agita homogenizer אחד סופי ספסל העליוןמחזור tion.
- הוספת supernatant זה סופי לצינור איסוף.
- צנטריפוגה צינור האיסוף ב3,200 XG 10 דקות ב 4 ° C.
- מעביר את supernatant לתא העליון של משקל מולקולרי 100,000 נותק מכשיר מסנן צנטריפוגלי.
- צנטריפוגה ב 3,200 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- העבר col1 מטוהר מהתא העליון לצינור נקי חרוטי ולאחסן ב 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול בידוד col1 זה דורש כ 2 שעות ו15 דקות כדי להשלים. איור 1 מציג תרשים סכמטי המתאר את השלבים העיקריים בהליך זה. הכנת הדגימה וביצוע 7 המחזורים של הסתה במהירות גבוהה ושטיפות עם נתרן אצטט לוקחת כ 35 דקות (איורים 1 א-C). ביצוע תסיסה אחד ולשטוף מחזור עם DH 2 O לוקח כ 5 דקות (1D דמויות ו1E). הוספת ציטרט הנתרן והכפפת המדגם לתסיסה אחד ולשטוף מחזור ואחרי 6 מחזורים של תסיסה לוקח כ 45 דקות (1F דמויות ו1G). צנטריפוגה המוצקים שנותרו מהתמצית נוזלית לוקחת 15 דקות (איור 1H). לבסוף, העברת הדגימה למכשיר סינון וביצוע שלב צנטריפוגה אחרת להתרכז col1 המטוהרים, solubilized ולהסיר חלבונים קטניםלוקח 30 דקות (איורים 1I ו1J). המוצר הסופי הוא תכשיר מרוכז, מאוד טהור של col1 מסיס שניתן polymerized נוסף על ידי הוספת Na 2 HCO 3 ודוגרים על 37 ° C. תמונות מיקרוסקופ לעומת שלב זה התגבשו מוצר לחשוף סיבי col1 שיכול לשמש כמצע לתא מצורף לצלחות תרבית רקמה או לשמש כפיגום עבור יישומי הנדסת רקמות 3-D (2A דמויות ו2B).
איור 1. סקירה סכמטי של שיטת בידוד col1 המשופרת. א) הדרמיס פרוס מתווסף 50 מיליליטר צינור חרוטי. B) 0.5 נתרן אצטט M מתווסף למדגם. C)מדגם הוא נתון 7 המחזורים של תסיסה עם חיץ נתרן אצטט מוחלפים אחרי כל מחזור. ד) DH 2 O מתווסף מדגם העור. ה) ההכנה היא נתון המחזור של תסיסה וDH 2 O 1 הוא שפך את. F) 0.075 ציטראט M נתרן מתווסף למדגם. G) מדגם נתונה 6 מחזורים של תסיסה. H) המדגם centrifuged להסיר מוצקים גדולים. אני) supernatant מועבר למשקל מולקולרי 100,000 מנותק יחידת מסנן צנטריפוגלי ב צינור חרוטי. J) יחידה זו centrifuged והנוזל צמיג שנשאר בתא העליון נאסף.
איור 2. בידוד מהיר הלוך ושובהדרמיס מ 'להניב col1 polymerized לתוך סיבים. col1 מסיס נוטרל על ידי הוספת Na 2 HCO 3 ואז טופח על 37 ° C. תמונה בניגוד שלב () ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (המציג את D-banding השתמרות) (B) של סיבי col1 שנוצרו באמצעות שיטת הבידוד המהירה שלנו. ברים סולם = 10 מיקרומטר ו500 ננומטר (בהתאמה). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מרכיב חיוני בשיטה זו הוא יעילה הדחיסה החוזרת של דגימת עורי להסיר את הנוזל עודף. זה קריטי כדי להסיר כמה שיותר נתרן אצטט ככל האפשר בשלב 2.5 ידי דחיסת המדגם. אנו משתמשים במרית כדי לדחוס את העור מפני הצד של הצינור, אך יכולה לשמש גם גזה, אם כי זה יחייב ההסרה של המדגם מהצינור ולהגדיל את הזמן הנדרש לביצוע פעולות אלה. כמו כן, חשוב כדי לדחוס את המדגם בשלב 3.1 כך שהנפח של ציטרט הנתרן הוא מדויק בצעדי חילוץ שלאחר מכן. אי להסיר כראוי נוזל מהמדגם בכל אחד מהשלבים הבאים תהיה השפעה מזיקה על תשואת col1 הסופית. מרכיב מרכזי נוסף לפרוטוקול זה הוא לשמור על כל ריאגנטים ב 4 ° C. זה מבטיח את המיצוי יעיל של col1 solubilized חומצה ומונע גיבוש של קולגן. בנוסף, ההליך יכול להתבצע באמצעות כלריאגנטים סטרילי בסביבת סטרילית. זה יהיה חשוב במיוחד לכל מי שרוצה להעסיק בשיטה זו כדי לבודד col1 לשימוש בבני אדם. מקורות מסחריים רבים של col1 כבר מעוקרים ביעילות על ידי גמא הקרנה. למרבה הצער, בפועל זה מקטין באופן משמעותי את יכולתו בצורת ג'לים בשל פיצול חלבון ו9,10 denaturation.
הליך זה מייצג את התנאים אופטימליים למיצוי col1 כפי שנקבע מניסויים רבים שבוצעו כדי לקבוע את השיעור האידיאלי של דגימת עורי לחיץ עוצמת קול. התוספת של יותר צינורות הוא הציע כאשר החוקר מבקש להפעיל על הליך זה עבור דגימות עור גדולות יותר. בהתבסס על הניסיון שלנו, זה לא מומלץ להוסיף יותר מדגם או חיץ יותר ממצוין לצינור אחד. כמו כן, ראוי לציין כי חרוזים מורכבים מסיליקה, גארנט, תחמוצת אלומיניום, סיליקון קרביד, או תחמוצת קרמיקה, זירקוניום, אשר משמשות בדרך כלל בשיתוף עם בhomogenizers ench העליון, הושמט מההליך שלנו. 6 מחזורי התסיסה 1 דקות רציפים מתוארים בשלב 3.3 נחוצים בשל הגבלה שהוטלה על ידי ציוד התסיסה שלנו. אנחנו יכולים רק להתסיס את המדגם עבור סכום כולל של 60 שניות בכל פעם, לאחר שהמכונה דורשת להפסיק. אם יש ציוד שניתן להגדיר עבור 6 דקות ישר, זה היה צפוי להיות בסדר כדי לעבור לאחד, מחזור של שש דקות. אנחנו, לעומת זאת, מצביעים על הקפדה על הכרכים במשקל וחיץ מדגם מתוארים.
מצאנו שיטת הכנה זו ביעילות מבודדת col1 מסיס מכבש, ארנב, ודגימות עור אנושיות 8. מצד השני, בפרוטוקול זה לא היה מוצלח בטיהור col1 מדגימות עור חזיריות. אפילו עם שינויים נרחבים בשיטה, הדרמיס חזירי מיוצר סכום מופקע של קצף בגלל שומני שייר ושומן וכתוצאה ממיצוי col1 לא יעיל. לעומת זאת, יכול להיות מטוהר col1 מזנבות עכברים שלמיםאו מבודד גידי זנב חולדה באמצעות הכנה שונה מעט, הכוללת חרוזים מטריצת lysing. זו תוארה בעבר בפירוט 8.
עבור מדעני מחקר, השימושים האפשריים של המוצר הסופי col1 חומצת solubilized שהושג באמצעות שיטה זו כוללים: א) מתן מצע דבק לצלחות תרבות לתמוך מצורף תא ושגשוגם, ב) מיקרו דפוסים של משטחים - 2 או 3 - ממדי (2 - או 3-D) תרבית תאים, וג) יצירת פיגומי 3-D עבור יישומי הנדסת רקמות. בעוד שחלק מכמות קטנה של שונות הרבה להרבה שניתן לצפות מכל שיטת טיהור, מצאנו כי הכנות col1 נוזל אלה הן באופן עקבי יכולים להיות משולב עם אוכלוסיות תאים שונות ונוצק לתוך תבניות. בנטרול החומציות וההתחממות, התוצאה היא רקמה מהונדסת הקרושה לבנות עם תאי מרחבית אוריינטציה מופצים באופן שווה לאורך כל המטריצה. בהתאם לצורה שלעובש, יכול להתבצע המבנים הללו כמעט בכל צורה וגודל 3,4,11-14.
לסיכום, להערכתנו הסיבה משכנעת ביותר לנצל בשיטה זו היא שהיא מפחיתה באופן משמעותי את הזמן ומאמץ הדרוש כדי לבודד מאוד טהור col1, מסיס ממקור רקמות עצמי כגון ביופסיות עור קטנות. השיטה מבוססת על נהלים ותיקים ומייצרת מוצר שעומד בדרישות באיכות של תכשירים מסחריים יקרים ביחס לטוהר col1 והיכולת ליצור רקמות 3-D יציבים. במקביל, שיטה פשוטה זו מאפשרת בידוד יעיל ומהיר של col1 autologously נגזר, שניתן להשתמש בבטחה למספר רב של יישומים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר ממכון הבריאות הלאומי (HL068915 לDBC), פרס חוקר חדש מקרן מחקר Thrasher (לCAP), גרנט-in-Aid מאיגוד הלב האמריקאי (12GRNT11910008 לDBC) , מענק מחקר מהקרן לילדים לב (לDBC), ותרומות לבית החולים לב ההולכה הקרן לילדים בבוסטון, קרן ריאן המשפחתית, ועל ידי דוד פולמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
