Summary
Procedure tradizionali per l'isolamento di tipo solubile 1 del collagene (COL1) richiedono circa 10 giorni dall'inizio alla fine a causa di incubazione tampone lunghe e laboriose resuspensions di fibrille. Qui, descriviamo un mezzo per purificare COL1 da piccole biopsie dermici in meno di 3 ore.
Abstract
Tipo solubile 1 del collagene (COL1) è ampiamente utilizzato come substrato adesivo per colture cellulari e come impalcatura cellulare per applicazioni rigenerative. Clinicamente, questa proteina è ampiamente utilizzato per la chirurgia estetica, iniezioni dermiche, innesto osseo, e chirurgia ricostruttiva. Le fonti di COL1 per queste procedure sono comunemente non umano, che aumenta il potenziale di infiammazione e rigetto nonché trasmissione di malattie xenobiotico. In considerazione di ciò, un metodo per purificare in modo efficiente e rapido da COL1 quantità limitate di tessuti autologously derivati elusione molti di questi problemi, tuttavia, protocolli di isolamento standard sono lunghe e spesso richiedono grandi quantità di tessuti di collagene. Qui, dimostriamo un metodo di estrazione COL1 efficiente che riduce il tempo necessario per isolare e purificare questa proteina da circa 10 giorni a meno di 3 ore. Abbiamo scelto il derma come fonte tessuto a causa della sua disponibilità durante molte procedure chirurgiche. Til suo metodo utilizza i buffer di estrazione tradizionali combinati con agitazione vigorosa e filtrazione centrifuga per ottenere altamente puro, COL1 solubile da piccole quantità di corium. In breve, biopsie dermici sono lavati accuratamente in DH ghiacciata 2 O dopo la rimozione di grasso, tessuto connettivo, e capelli. I campioni di pelle sono spogliati di proteine non collagene e polisaccaridi con 0,5 M di acetato di sodio e un banco omogeneizzatore ad alta velocità. Collagene da residui solidi viene successivamente estratta con un tampone sodio citrato 0,075 M usando l'omogeneizzatore. Questi estratti sono purificati con 100.000 MW di cut-off filtri centrifughi che producono preparazioni col1 di qualità comparabile o superiore ai prodotti commerciali o di quelli ottenuti utilizzando le procedure tradizionali. Prevediamo che questo metodo faciliterà l'utilizzazione di autologously derivato COL1 per una moltitudine di ricerca e applicazioni cliniche.
Introduction
Per decenni, i ricercatori e venditori commerciali hanno isolato solubilizzato COL1 da un assortimento di fonti tissutali incluse pelle e tendine con qualche variazione di un protocollo di estrazione acida semplice seguito da neutralizzazione, che si traduce in una risospensione di una matrice di fibrille col1 organizzati utilizzabile per una moltitudine di applicazioni biomediche 1-4. Mentre ci sono molti esempi di applicazioni cliniche per COL1, alcuni di questi impiegano COL1 autologously-derivato per la preparazione di questa proteina richiede estrazioni lunghi prendere giorni o settimane per effettuare 5-7. Come risultato, gli investigatori ricerca e medici usano generalmente costosi, preparazioni commerciali di COL1 che vengono preparati utilizzando tessuti non umani come ratto, bovino, o derma suino o utilizzando pelle rimosso da cadaveri o dopo la circoncisione maschile. Per applicazioni rigenerative, molti di questi prodotti mostrano variabilità rispetto alla loro capacità di formare solidimatrici o costrutti di tessuto in grado di supportare attaccamento e la crescita cellulare. Di conseguenza, vi è la necessità distinto per un nuovo metodo standardizzato progettato per estrarre rapidamente COL1 da fonti tissutali autologhi accessibili e abbondanti.
Tale metodo permetterebbe di risparmiare tempo e denaro nel contesto di ricerca in cui COL1 potrebbe essere estratto dal modello animale di interesse e utilizzato per la sperimentazione preclinica dei tessuti ingegnerizzati montati su scaffold a base di collagene. Allo stesso tempo, avendo la possibilità di utilizzare una rapida isolato, COL1 autologously derivata nella clinica aumenterebbe la sicurezza complessiva per i pazienti che altrimenti ricevere allogeniche o xenogeniche preparazioni. Per i pazienti che ricevono una preparazione autogeneic, questo metodo semplificato potrebbe ridurre notevolmente l'intervallo tra raccolta biopsia e l'applicazione di collagene. Per queste ragioni, abbiamo cercato di migliorare un isolamento e la purificazione metodo COL1 lunga tradizione utilizzando ad alta velocità agitazione e le dimensioni esclusione centrifugazione. Questo metodo è semplice da eseguire utilizzando tamponi standard e le attrezzature presenti in molti laboratori. Con l'ausilio di agitazione ad alta velocità, il nostro protocollo riduce il tempo necessario per isolare solubile, dermica COL1 da circa 10 giorni a meno di 3 ore 8. È importante sottolineare che questo metodo può essere facilmente eseguito in ambito clinico per preparare COL1 autologously-derivato per l'uso in pazienti durante un'unica serie di procedure.
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Protocol
Qui ci dimostrare l'isolamento di COL1 dalla pelle di agnello. Come scritto, questo protocollo può anche essere utilizzata per isolare con successo COL1 da coniglio e pelle umana.
1. Preparare Dermal campione
- Equilibrare tutti i reagenti a 4 ° C prima dell'uso.
- Risciacquare campione cutanea (25-50 g) in DH ghiacciata 2 O e rimuovere eventuali lana, pelliccia o capelli con crema depilatoria.
- Utilizzare una lama di rasoio singolo bordo per raschiare il pulito campione di tessuto connettivo e grasso.
- Lavare il campione in ghiaccio-freddo dH 2 O.
- Tagliate il campione di pelle in 1 cm x 1 centimetri pezzi con una lama di rasoio singolo bordo.
2. Rimuovere noncollagenous solubilizzata Materiale
- Pesare 5 g di campione per tubo da 50 ml e aggiungere 30 ml di ghiacciata 0.5 M acetato di sodio.
- Mescolare provette per 1 min alla regolazione di 6 m / sec utilizzando un adattatore tubo da 50 ml in omogeneizzatore da banco.
- Scartare supernatant e ripetere per un totale di 7 sodio acetato cicli di lavaggio.
- Lavare il campione in DH ghiacciata 2 O e mescolare una volta per rimuovere acetato di sodio residuo.
- Utilizzare una spatola per comprimere il campione contro il lato del tubo per rimuovere il liquido in eccesso e poi trasferire in una provetta conica da 50 ml fresco.
3. Collagene di tipo I Estrazione
- Lavare il campione due volte in 2 ml / g 0,075 M tampone sodio citrato per 1 min a 6 m / sec nella omogeneizzatore banco comprimendo il campione e scartando il supernatante dopo ogni lavaggio.
- Aggiungere un fresco 2 ml / g aliquota di 0,075 M tampone sodio citrato al campione.
- Eseguire 6 sequenziale 1 min, 6 cicli banco mix omogeneizzatore m / sec di agitazione senza rimuovere il cuscinetto tra ogni ciclo.
- Trasferire la spessa, chiara surnatante in un tubo di raccolta.
- Aggiungere un ulteriore 1 ml / g 0,075 M di sodio tampone citrato al campione ed effettuare un ultimo banco omogeneizzatore agitazioneCiclo zione.
- Aggiungere questo surnatante finale a un tubo di raccolta.
- Centrifugare la provetta di raccolta a 3.200 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante al vano superiore di un peso molecolare 100.000 tagliare dispositivo di filtro centrifugo.
- Centrifugare a 3200 xg per 30 min a 4 ° C.
- Trasferire il purificato COL1 dal vano superiore in una provetta pulita e conservare a 4 ° C.
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Representative Results
Questo protocollo isolamento COL1 richiede circa 2 ore e 15 minuti per completare. La Figura 1 mostra un diagramma schematico che illustra le fasi principali di questa procedura. Preparazione del campione ed eseguendo i 7 cicli di agitazioni alta velocità e risciacqui con acetato di sodio richiede circa 35 min (Figure 1A-C). L'esecuzione di una agitazione e risciacquo con dH 2 O richiede circa 5 min (Figure 1D e 1E). Aggiunta di citrato di sodio e sottoponendo il campione ad una agitazione e risciacquo seguita da 6 cicli di agitazione richiede circa 45 min (figure 1F ed 1G). Centrifugazione restanti solidi dal liquido estratto vogliono 15 min (Figura 1H). Infine, il trasferimento del campione ad un dispositivo di filtro e di eseguire un'altra fase di centrifugazione per concentrare il purificata, COL1 solubilizzato e rimuovere piccole proteineprende 30 min (Figure 1I e 1J). Il prodotto finale è una, altamente pura preparazione concentrata di COL1 solubile che può essere ulteriormente polimerizzato con l'aggiunta di Na 2 HCO 3 e incubando a 37 ° C. Fase contrasto immagini di microscopia di questo prodotto solidificato rivelano fibrille coL1 che potrebbero servire come substrato per l'adesione delle cellule a piastre di coltura tissutale o essere utilizzata come impalcatura per 3-D applicazioni di ingegneria tissutale (Figure 2A e 2B).
Figura 1. Schema della migliore metodo di isolamento COL1. A) derma fette viene aggiunto ad un tubo da 50 ml. B) 0,5 M di acetato di sodio viene aggiunto al campione. C) L'campione è sottoposto a 7 cicli di agitazione con tampone sodio acetato sostituite dopo ogni ciclo. D) dH 2 O viene aggiunta al campione di pelle. E) La preparazione viene sottoposta ad 1 ciclo di agitazione e dH 2 O viene travasato. F) 0,075 M citrato di sodio viene aggiunto al campione. G) Il campione viene sottoposto a 6 cicli di agitazione. H) Il campione viene centrifugato per rimuovere i solidi di grandi dimensioni. I) Il supernatante viene trasferito ad un peso molecolare di 100.000 tagliato unità filtro centrifugo in un tubo conico. J) Questa unità viene centrifugato e il liquido viscoso che rimane nel vano superiore viene raccolto.
Figura 2. Isolamento Rapid from derma a produrre COL1 polimerizzato in fibrille. Solubile COL1 stato neutralizzato con Na 2 HCO 3 e poi incubata a 37 ° C. Una immagine a contrasto di fase (A) e microfotografia elettronica a trasmissione (mostra la d-bande conservati) (B) di fibrille col1 generati utilizzando il nostro metodo di isolamento rapido. Barre di scala = 10 micron e 500 nm (rispettivamente). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Un componente fondamentale di questo metodo è la compressione efficiente ripetuta del campione dermica per rimuovere il liquido in eccesso. E 'fondamentale per rimuovere acetato di sodio quanto possibile al punto 2.5 comprimendo il campione. Usiamo una spatola per compattare la pelle contro il lato del tubo, tuttavia, garza potrebbe anche essere utilizzato, anche se ciò richiederebbe la rimozione del campione dalla provetta e aumentare il tempo necessario per eseguire questi passaggi. Allo stesso modo, è importante per comprimere il campione nel passaggio 3.1 in modo che il volume di citrato di sodio è accurato nelle successive fasi di estrazione. La mancata rimozione adeguatamente il liquido dal campione in uno di questi passaggi avrà un effetto negativo sul rendimento COL1 finale. Un altro componente chiave di questo protocollo è quello di mantenere tutti i reagenti a 4 ° C. Questo assicura l'estrazione efficiente di acido COL1 solubilizzata e impedisce solidificazione del collagene. Inoltre, la procedura può essere eseguita utilizzando tuttireagenti sterili in un ambiente sterile. Questo sarebbe di particolare importanza per coloro che desiderano utilizzare questo metodo per isolare COL1 per l'uso nell'uomo. Molte fonti commerciali di COL1 sono stati effettivamente sterilizzato con raggi gamma. Purtroppo, questa pratica riduce notevolmente la sua capacità di formare gel causa della frammentazione proteine e denaturazione 9,10.
Questa procedura rappresenta le condizioni ottimali per l'estrazione COL1 come determinato da molti esperimenti eseguiti per stabilire la proporzione ideale di campione dermica buffer volume. L'aggiunta di più tubi è suggerito quando il ricercatore vuole utilizzare questa procedura per campioni di pelle più grandi. Sulla base della nostra esperienza, non è consigliabile aggiungere altro campione o tampone quanto indicato per ciascun tubo. E 'anche importante notare che le microsfere composte da silice, ceramica, granato, ossido di alluminio, carburo di silicio o ossido di zirconio, che sono comunemente utilizzati in combinazione con bEnch-top omogeneizzatori, sono omessi dalla nostra procedura. I 6 cicli di 1 min agitazione sequenziali descritte al punto 3.3 sono necessari a causa di una limitazione imposta dalle nostre apparecchiature agitazione. Possiamo agitare soltanto il campione per un totale di 60 sec alla volta, dopo che la macchina richiede una sosta. Se si ha un'attrezzatura che può essere impostato per 6 min dritto, sarebbe probabilmente bene per passare ad uno, ciclo di sei minuti. Noi, tuttavia, consigliamo di stretta aderenza al peso e tampone volumi di campione descritte.
Abbiamo trovato questo metodo di preparazione di isolare efficacemente COL1 solubile di agnello, coniglio, e campioni cutanei umani 8. D'altra parte, questo protocollo non è riuscita a purificare COL1 da campioni di pelle suina. Anche con profonde modifiche al metodo, derma suino prodotto una quantità esorbitante di schiuma a causa dei lipidi residui e grassi con conseguente estrazione COL1 inefficiente. Al contrario, COL1 può essere purificato da tutto il pesce sorcioo isolati tendini coda di ratto con una preparazione leggermente modificato che comprende lisi perline matrice. Questo è stato precedentemente descritto in dettaglio 8.
Per i ricercatori, i possibili usi del prodotto acido-solubilizzato finale COL1 ottenuti con questo metodo sono: a) fornire un supporto adesivo per piastre di coltura per sostenere l'attaccamento e la proliferazione cellulare, b) micro-patterning di superfici per 2 - o 3 - dimensionale (2 - o 3-D) coltura cellulare, e c) realizzazione di scaffold 3D per applicazioni di ingegneria tissutale. Mentre alcuni piccola quantità di variabilità da lotto a lotto è da aspettarsi da qualsiasi metodo di purificazione, abbiamo trovato che questi preparati liquidi coL1 sono costantemente in grado di essere abbinato a diverse popolazioni cellulari e gettato in stampi. Dopo aver neutralizzato il pH e il riscaldamento, il risultato è un tessuto multistrato solidificato costruire con celle spazialmente orientati distribuiti uniformemente in tutta la matrice. A seconda della forma delstampo, questi costrutti può essere fatta in qualsiasi forma e dimensione 3,4,11-14.
In sintesi, è nostra opinione che la ragione più convincente per utilizzare questo metodo è che riduce drasticamente il tempo e gli sforzi necessari per isolare altamente puro, COL1 solubile da una fonte tessuto autologo come le piccole biopsie cutanee. Il metodo si basa su procedure secolare e produce un prodotto che soddisfa o supera la qualità delle preparazioni commerciali costosi in termini di purezza COL1 e la capacità di formare tessuti stabili 3-D. Allo stesso tempo, questa semplificazione permette l'isolamento efficiente e rapida COL1 autologously derivato che può essere utilizzato in modo sicuro per una moltitudine di applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un assegno di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915 di DBC), un nuovo Researcher Award del Fondo di ricerca Thrasher (al PAC), un Grant-in-Aid dalla American Heart Association (12GRNT11910008 a DBC) , un assegno di ricerca da Heart Foundation dei Bambini (da DBC), e le donazioni a Hospital di conduzione cardiaca Fondo dei Bambini di Boston, la Ryan Famiglia Endowment, e da David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
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