Summary
水溶性タイプ1コラーゲン（COL1）を単離するための伝統的な手続きが原因に長いバッファインキュベーションおよびフィブリルの面倒な再懸濁の開始から終了まで約10日を要する。ここでは、3時間未満の小さな皮膚生検からCOL1を精製するための手段を記載する。
Abstract
水溶性タイプ1コラーゲン（COL1）は、細胞培養用の接着基質として、再生アプリケーションのための携帯足場として広く使用されています。臨床的に、このタンパク質は、広く美容外科、皮膚注射、骨移植および再建手術のために使用される。これらの手順のcol1のソースは、炎症や拒絶反応の可能性だけでなく、生体異物疾病伝播を増加させる、一般的にヒト以外である。そこで、効率的かつ迅速に自家由来組織の限られた量からCOL1を精製する方法は、これらの問題の多くを回避するであろうが、標準の単離プロトコルが長いであり、多くの場合、コラーゲン様組織を大量に必要とする。ここでは、約10日から約3時間後に、このタンパク質を単離および精製するために必要な時間を短縮し、効率的なCOL1抽出方法を示す。我々は、多くの外科的処置の際に、その利用可能性の我々の組織源として真皮を選びました。 T彼の方法は、真皮、少量から高純度、溶解性のCOL1を得るための強力な撹拌及び遠心濾過と組み合わせた伝統的な抽出バッファを使用しています。簡潔には、皮膚生検、脂肪、結合組織、毛髪を除去した後、氷冷のdH 2 Oで十分に洗浄する。皮膚サンプルを0.5 M酢酸ナトリウムおよび高速ベンチトップホモジナイザーを用いて非コラーゲン性タンパク質及び多糖類から取り除かれる。残留固形物由来のコラーゲンは、その後、ホモジナイザーを用いて0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液で抽出する。これらの抽出物は、100,000 MWカットオフ市販品または従来の手順を用いて得られたものと同等以上の品質のCOL1製剤を得る遠心フィルタを使用して精製される。我々は、この方法では、研究と臨床応用の多数のための自家由来COL1の利用を容易にするであろうと予想している。
Introduction
何十年もの間、研究者や商業ベンダーが使用することができる組織化されたCOL1原線維のマトリックスの再懸濁、その結果中和し、単純な酸抽出プロトコルのいくつかのバリエーションを使用して皮膚や腱などの組織源の品揃えから可溶化COL1を単離した生物医学的応用1-4多数のため。 col1の臨床応用の多くの例がありますが、このタンパク質の調製は5-7を実行するために数日から数週間を取って長々抽出を必要とするので、これらのいくつかは自家由来COL1を採用しています。その結果、研究調査官や医師は、一般的には、ラット、ウシ、またはブタ真皮などの非ヒト組織を用いたか、死体から摘出皮膚を使用したり、男性の割礼に従って製造されたCOL1の高価な、市販製剤を使用しています。再生アプリケーション、固体形成する能力に関して、これらの製品の多くの展示可変性マトリックスまたは細胞の付着および成長を支持することが可能な組織構築物。そのため、すぐにアクセス可能で、豊富な自家組織源からCOL1を抽出するために設計された新しい標準化された方法のための明確な必要性がある。
そのような方法は、COL1は、関心のある動物モデルから抽出したコラーゲンベースの足場上で組み立て設計組織の前臨床試験を使用することができる研究環境で、時間とコストの両方を節約することになる。同時に、診療所で急速に分離された、自家由来COL1を使用するオプションを有する他の方法で同種または異種の準備を受け取ることになる患者のための全体的な安全性を増加させるであろう。自家調製を受けている患者の場合、この方法は非常に合理化された生検収集およびコラーゲンアプリケーションとの間の間隔を減少させるであろう。これらの理由から、我々は、高速AGを使用して、長い確立COL1の単離および精製方法を改善しようとしたitationおよびサイズ排除遠心分離。この方法は、多くの研究室で見られる標準バッファーと装置を使用して実行するのは簡単です。高速攪拌を用いることにより、我々のプロトコルは3未満〜8時間、約10日から可溶性、皮膚COL1を単離するために必要な時間を短縮する。重要なことに、この方法は、容易な手順の単一のセット中の患者に使用するための自家由来するCOL1を調製するために臨床設定で行うことができる。
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Protocol
ここでは、子羊の皮からCOL1の分離のデモンストレーションを行います。書かれたように、このプロトコルはまた、正常ウサギおよびヒトの皮膚からCOL1を単離するために使用することができる。
1。皮膚のサンプルを準備します
- 使用前に4℃にすべての試薬を平衡化させます。
- 氷のように冷たいのdH 2 O中で真皮サンプル（25〜g）をすすぎ、脱毛クリームを持つウール、毛皮、または髪を削除します。
- 結合組織および脂肪のサンプルクリーンをこすりするために単一のエッジかみそりの刃を使用してください。
- 氷のように冷たいのdH 2 Oのサンプルをすすぐ
- シングルエッジかみそりの刃で1センチメートル×1センチの部分に皮膚サンプルをスライス。
2。非コラーゲン可溶化物質を除去
- サンプル50ミリリットルあたりのコニカルチューブの5グラムを秤量し、氷冷した0.5 M酢酸ナトリウム30ミリリットルを追加します。
- ベンチトップホモジナイザー中で50mlのチューブアダプタを使用して6m /秒の設定で1分間チューブを混合する。
- SUPを破棄7酢酸ナトリウムの洗浄サイクルの合計ernatant繰り返し。
- 氷のように冷たいのdH 2 Oの中に試料をすすぎ、残留酢酸ナトリウムを除去するために、一度ミックス。
- 過剰な液体を除去した後、新しい50mlコニカルチューブに転送するためにチューブの側面に対してサンプルを圧縮するヘラを使用しています。
3。私コラーゲンの抽出を入力
- 試料を圧縮し、各洗浄後に上清を捨てベンチトップホモジナイザーで6m /秒で1分間ミリリットル/ gの2倍のサンプルを洗浄0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液。
- サンプルに0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液の新鮮な2ミリリットル/ gのアリコートを追加します。
- 各サイクルの間にバッファを削除せずに6連続した1分、攪拌の6メートル/秒のベンチトップホモジナイザーミックスサイクルを実行します。
- コレクションチューブに厚く、透明な上澄みを転送します。
- サンプルにミリリットル/ g、さらに1 0.075 Mクエン酸ナトリウム緩衝液を加え、1の最終ベンチトップホモジナイザー胸焼けを行うクル。
- コレクションチューブにこの最終上清を追加します。
- 遠心機で4℃で10分間、3,200×gで回収チューブ
- 分子量100,000の最上部のコンパートメントに上清を移し、遠心フィルター装置を遮断。
- 4℃で30分間3200×gで遠心分離
- 4℃のクリーンコニカルチューブおよび格納するために上部コンパートメントから精製されたCOL1を転送
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Representative Results
このCOL1単離プロトコールは、完了するのに約2時間と15分が必要です。図1は、この手順の主なステップを概説する概略図を示す。試料を調製し、高速攪拌回転の7サイクルを実行し、酢酸ナトリウムでリンスすると、約35分（図1A-C）をとる。 1の攪拌を実施するとDH 2 Oですすぎサイクルは約5分（図1Dおよび1E）を取ります。クエン酸ナトリウムを加えて、攪拌の6サイクル行った1攪拌とすすぎサイクルにサンプルを供して、約45分（図1F及び1G）を取ります。液体抽出物から残った固形物を遠心分離すると、15分（図1H）を取ります。最後に、フィルタ装置にサンプルを移送し、精製、可溶化COL1を濃縮し、小さなタンパク質を除去するために、別の遠心分離工程を行う30分かかります（図1Iおよび1J）。最終生成物は、更にをNa 2 HCO 3を添加し、37℃でインキュベートすることによって重合させることができる可溶性COL1の濃縮、高純度の調製物であるこの位相差顕微鏡画像は、生成物が細胞組織培養プレートへの結合又は3-Dの組織工学用途（図2Aおよび2B）のための足場として使用するための基質として役立つことができるCOL1フィブリルを明らかに固化した。
図1改良COL1単離法の概要図。 A）スライス真皮を50mlコニカルチューブに添加する。B）を0.5 M酢酸ナトリウムをサンプルに添加する。C）試料は、各サイクル後に取り替え酢酸ナトリウム緩衝液で攪拌7サイクルに供される。D）のdH 2 O、皮膚試料に添加される。E）調製物を撹拌およびのdH 2 Oの1サイクルに供されているがオフに注ぐ。F） 0.075 Mクエン酸ナトリウムを試料に添加される。G）試料を攪拌6サイクルに供される。H）サンプルは、大きな固形物を除去するために遠心分離される。I）上清を遠心フィルターユニットをカットオフ分子量100,000に転送されるコニカルチューブ、J）このユニットを遠心分離し、トップのコンパートメントに残って粘性のある液体を回収する。
図2。迅速な単離ゆらゆら原線維に重合COL1を得たm個の真皮。可溶性COL1をNa 2 HCO 3を加えて中和し、次いで37℃でインキュベートした。位相差画像（A）及び我々の迅速な単離法を用いて生成COL1フィブリルの透過型電子顕微鏡写真（保存のd-バンディングを示す）（B）。スケールバー=10μmで500 nmの（それぞれが）。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
この方法の重要な要素は、過剰な液体を除去し、皮膚のサンプルを繰り返し効率的な圧縮です。これは、試料を圧縮することによって、ステップ2.5においてできるだけ酢酸ナトリウムを除去することが重要である。我々は、チューブの側面に対して皮膚を圧縮するためにスパチュラを使用しているが、チーズクロスを使用することもできる、これがチューブからのサンプルの除去を必要とし、これらのステップを実行するために必要な時間を増加させるだろうが。同様に、クエン酸ナトリウムの体積は、その後の抽出工程において正確であるように、ステップ3.1でサンプルを圧縮することが重要である。適切にこれらのステップのいずれかで試料から液体を除去しないと、最終的なCOL1収率に有害な影響を有するであろう。この議定書のもう一つの重要な要素は、4℃で、すべての試薬を維持することであるこれは、酸可溶化COL1の効率的な抽出を保証し、コラーゲンの凝固を防ぐことができます。さらに、プロシージャは、すべて使用して実施することができる無菌環境下で無菌の試薬。これは、ヒトにおける使用のためCOL1を単離するために、このメソッドを使用することを望む人のために特に重要であろう。 COL1の多くの商業的供給源を効果的にガンマ線照射により滅菌されています。残念ながら、この方法は非常にタンパク質断片化および変性9,10に起因するゲルを形成する能力を低下させる。
この手順では、ボリュームをバッファリングする皮膚試料の理想的な比率を確立するために行う多くの実験から決定されるようCOL1抽出のための最適な条件を表す。研究者は、より大きな皮膚サンプルごとにこの手順を採用したい場合の管の追加が提案されている。我々の経験に基づいて、各チューブのために示されているよりも多くのサンプルまたはバッファを追加することはお勧めできません。これは、シリカ、セラミック、ガーネット、酸化アルミニウム、炭化ケイ素、又は酸化ジルコニウムからなるビーズは、一般にBと組み合わせて使用されることもまた注目に値するenchトップホモジナイザーは、私たちの手順を省略している。ステップ3.3で説明した6シーケンシャル1分攪拌サイクルは、私たちの攪拌装置による制限するために必要である。私たちは機械が停止を必要とした後、一度に60秒の合計のためのサンプルを攪拌することができます。一つは直6分間に設定することができる機器がある場合は、おそらく一6分間のサイクルに切り替えるには、微細であろう。しかし、我々は説明した試料の重量とバッファ容量の厳守を示唆ん。
我々は、この調製方法は効率的にラム肉、ウサギ、およびヒトの皮膚試料8から可溶性COL1を分離見出した。一方、このプロトコルは、ブタの皮膚サンプルからCOL1を精製に成功しませんでした。でも、この方法に大幅な変更を加えて、ブタ真皮が原因非効率的なCOL1抽出結果の残留脂質や脂肪の泡の法外な量を生産した。逆に、COL1は全体のラットの尾から精製することができる又は溶解マトリックスビーズを含むわずかに修正された調製物を用いてラットの尾の腱を単離した。これは、以前に詳細8に記載されている。
研究者は、この方法を用いて得られた最終の酸可溶化COL1産物の潜在的な使用は、a）細胞の付着および増殖を支持するために培養プレート用接着基質を提供する、2面のb）の微細加工 - または3 - 次元（2 - 又は3-D）細胞培養、およびc）組織工学用途のための3-D足場の作成。ロット間の変動性の一部少量の任意の精製方法から予想されるが、我々は、これらの液体COL1製剤は一貫して、種々の細胞集団と混合し、型に注入されることが可能であることを見出した。 pHと温暖化を中和した後、結果が固化した改変された組織は、マトリックス全体に均等に分布し、空間的に指向の細胞を用いて構築される。の形状に応じて金型は、これらの構築物は、実質的に任意の形状およびサイズ3,4,11-14で作製することができる。
要約すると、この方法を利用する最も説得力のある理由は、それが劇的にこのような小さな皮膚生検のような自家組織源から高純度の、可溶性COL1を単離するために必要な時間と労力を低減することであることを我々の意見である。この方法は、長期確立された手順に基づいており、COL1純度および安定な3-D組織を形成する能力に対して高価な市販製剤の品質を満たすかまたは超える生成物を生成する。同時に、この単純化された方法で安全な臨床用途の多くのために使用することができる自家由来COL1の効率的かつ迅速な単離を可能にする。
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Disclosures
著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（DBCにHL068915）、（CAP）のスラッシャー研究基金からの新しい研究者賞、補助金、米国心臓協会（DBCへ12GRNT11910008）からの研究助成金によってサポートされていました（DBC）は、ボストン小児病院の心臓伝導基金、ライアンファミリー基金への寄付、そしてデビッド·プルマンによる子供の心臓財団からの研究助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
