En förbättrad metod för framställning av typ I kollagen från huden

Summary

Traditionella förfaranden för isolering av lösligt typ 1 kollagen (COL1) kräver ca 10 dagar från början till slut på grund av långa buffert inkubationer och mödosamma resuspensions av fibriller. Här beskriver vi ett sätt att rena COL1 från små dermala biopsier på mindre än tre timmar.

Abstract

Lösliga typ 1 kollagen (COL1) används i stor utsträckning som ett klister substrat för cellkulturer och som en cellulär klätterställning för regenerativa applikationer. Kliniskt är detta protein i stor utsträckning för kosmetisk kirurgi, dermal injektioner, ben ympning, och rekonstruktiv kirurgi. Källorna till COL1 för dessa förfaranden är vanligen icke-mänskliga, vilket ökar risken för inflammation och avvisande samt överföring xenobiotisk sjukdom. Mot bakgrund av detta, skulle en metod för att snabbt och effektivt rena COL1 från begränsade mängder autologously-härledda vävnader kringgå många av dessa frågor, men standardisoleringsprotokoll är långa och kräver ofta stora mängder av kollagena vävnader. Här visar vi en effektiv COL1 extraktionsmetod som minskar den tid som behövs för att isolera och rena detta protein från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim. Vi valde dermis som vår vävnadskälla på grund av sin tillgänglighet under många kirurgiska ingrepp. Thans metod använder traditionella utsugs buffertar i kombination med kraftfulla agitation och centrifugal-filtrering för att erhålla högt rent, lösligt COL1 från små mängder av läderhuden. I korthet är dermal biopsier tvättas noggrant i iskallt dH ₂ O efter att ta bort fett, bindväv, och hår. Hudproven strippas av noncollagenous proteiner och polysackarider med användning av 0,5 M natriumacetat och en hög hastighet bänkhomogenisator. Kollagen från kvarvarande fasta substanser extraheras därefter med en 0,075 M natriumcitrat-buffert med användning av homogenisator. Dessa extrakt renas med hjälp av 100.000 MW cut-off centrifugal filter som ger Kol1 beredningar av jämförbar eller bättre kvalitet till kommersiella produkter eller de som erhållits med hjälp av traditionella förfaranden. Vi räknar med den här metoden kommer att underlätta utnyttjandet av autologously härledd COL1 för en mängd forskning och kliniska tillämpningar.

Introduction

I decennier har forskare och kommersiella leverantörer isolerade upplöst COL1 från ett sortiment av vävnadskällor inklusive hud och senor med hjälp av någon variant av en enkel syraextraktion protokoll följt av neutralisering, vilket resulterar i en resuspension av en matris av organiserad Kol1 fibriller som kan användas för en mängd olika biomedicinska tillämpningar ^1-4. Det finns många exempel på kliniska tillämpningar för COL1, några av dessa sysselsätter autologously-härledda COL1 eftersom beredningen av detta protein kräver långa extraktioner ta dagar eller veckor att utföra ^5-7. Som ett resultat av forskning utredare och läkare använder i allmänhet dyra, kommersiella beredningar av COL1 som är beredda att använda ickemänskliga vävnader såsom råtta, nötkreatur eller svin corium eller med hjälp av hud bort från kadaver eller efter manlig omskärelse. För regenerativa applikationer, att många av dessa produkter uppvisar variabilitet med avseende på deras förmåga bildar fastmatriser eller vävnads konstruktioner som kan stödja cellbindning och tillväxt. Följaktligen finns det ett tydligt behov av en ny standardiserad metod utformad för att snabbt extrahera COL1 från tillgängliga och rikliga autologa vävnadskällor.

En sådan metod skulle spara både tid och pengar i forskning miljö där COL1 kunde extraheras från djurmodell av intresse och används för preklinisk testning av tekniska vävnader monterade på kollagenbaserade ställningar. Samtidigt, skulle ha möjlighet att använda ett snabbt-isolerad, autologously härledda COL1 på kliniken öka den totala säkerheten för patienter som annars skulle få allogena eller xenogena preparat. För patienter som får ett autogent preparat, skulle denna strömlinjeformade metoden kraftigt minska intervallet mellan biopsi insamling och kollagen ansökan. Därför sökte vi för att förbättra på en sedan länge etablerad COL1 isolering och reningsmetod med hjälp av höghastighets agitation och storlek-utanförskap centrifugering. Denna metod är enkel att utföra med användning av standardbuffertar och-utrustning som har hittats i många laboratorier. Genom att använda höghastighets agitation, minskar våra protokoll den tid som krävs för att isolera löslig, dermal COL1 från cirka 10 dagar till mindre än 3 tim ^8. Viktigt kan denna metod lätt utföras i klinisk miljö för att förbereda autologously-härledda COL1 till patienter under en enda uppsättning förfaranden.

Protocol

Här kommer vi att visa att isoleringen av COL1 från lammskinn. Som skrivet, kan detta protokoll också användas för att framgångsrikt isolera COL1 från kanin och mänsklig hud.

1. Förbered Dermal Prov

1. Jämvikta alla reagenser till 4 ° C före användning.
2. Skölj huden prov (25-50 g) i iskall dH ₂ O och ta bort all ull, päls eller hår med hårborttagningskräm.
3. Använd en enda kant rakblad för att skrapa provet fri från bindväv och fett.
4. Skölj provet i iskallt dH ₂ O.
5. Skiva hudprov i 1 cm x 1 cm bitar med en enda kant rakblad.

2. Avlägsna Noncollagenous solubiliserade materialet

1. Väg upp 5 g prov per 50 ml koniska rör och tillsätt 30 ml iskall 0,5 M natriumacetat.
2. Blanda rören under 1 minut vid m / sek inställningen 6 med hjälp av en 50 ml tub adaptern i bänkbaserade sator.
3. Kassera supernatant och upprepa för totalt 7 natriumacetat tvättcykler.
4. Skölj provet i iskall dH ₂ O och blanda en gång för att avlägsna rester av natriumacetat.
5. Använd en spatel för att komprimera provet mot sidan av röret för att avlägsna överskottsvätska och sedan överföra till ett nytt 50 ml koniskt rör.

3. Typ I kollagen Extraktion

1. Tvätta provet två gånger i 2 ml / g 0,075 M natriumcitrat-buffert under 1 min vid 6 m / sek i bänkhomogenisator komprimera provet och kasta supernatanten efter varje tvätt.
2. Lägg till en ny 2 ml / g alikvot av 0,075 M natriumcitrat-buffert till provet.
3. Utför 6 sekventiella 1 min, 6 m / s bänkhomogenisator mix cykler agitation utan att avlägsna buffert mellan varje cykel.
4. För över den tjocka, klara supernatanten till ett provrör.
5. Lägg till ytterligare 1 ml / g 0,075 M natriumcitrat buffert till provet och utföra en sista bänkhomogenisator Agitation cykeln.
6. Lägg till denna slutliga supernatanten till ett provrör.
7. Centrifugera uppsamlingsrör vid 3200 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
8. Överför supernatanten till den övre avdelningen av en 100.000 molekylvikt avskuren centrifugal filterenhet.
9. Centrifugera vid 3200 x g under 30 min vid 4 ° C.
10. Överför den renade COL1 från det övre utrymmet till ett rent koniskt rör och förvara vid 4 ° C.

Representative Results

Denna COL1 isolering protokollet kräver cirka 2 timmar och 15 minuter att slutföra. Figur 1 visar ett schematiskt diagram som sammanfattar de viktigaste stegen i detta förfarande. Preparering av provet och utföra de 7 cykler av höghastighets agitations och sköljer med natriumacetat tar ungefär 35 min (figurerna 1A-C). Utföra en agitation och skölj cykel med dH ₂ O tar ca 5 minuter (figur 1D och 1E). Lägga natriumcitrat och utsätta provet för en omröring-och sköljcykel följt av sex cykler av agitation tar ungefär 45 min (fig. 1F och 1G). Centrifugering av det kvarvarande fasta materialet från vätskan extrakt tar 15 min (fig 1 H). Slutligen överförs provet till en filteranordning och utför en annan centrifugeringssteg för att koncentrera det renade, solubiliserade COL1 och avlägsna små proteinertar 30 minuter (figur 1I och 1J). Den slutliga produkten är en koncentrerad, hög-rent preparat av löslig COL1 som kan ytterligare polymeriseras genom tillsats av Na ₂ HCO ₃ och inkubering vid 37 ° C. Faskontrastmikroskopi bilder av denna stelnade produkt avslöjar Kol1 fibriller som skulle kunna fungera som ett substrat för cellbindning till vävnadsodlingsplattor eller användas som en byggnadsställning för 3D-applikationer vävnadsteknik (fig. 2A och 2B).

Figur 1. Schematisk översikt av den förbättrade COL1 isoleringsmetoden. A) skivad dermis sättes till en 50 ml koniska rör. B) 0,5 M natriumacetat sättes till provet. C) IProvet utsattes för 7 cykler av omrörning med natriumacetatbuffert tillbaka efter varje cykel. D) dH ₂ O tillsätts till provet huden. E) Preparatet utsattes för en cykel av agitation och dH ₂ O hälls av. F) 0,075 M natriumcitrat sätts till provet. G) Provet utsattes för 6 cykler av omröring. H) provet centrifugeras för att avlägsna stora fasta ämnen. I) Supernatanten överfördes till en 100000 molekylvikt avskuren centrifugal filterenhet i en konisk tub. J) Denna enhet är centrifugeras och den viskösa vätskan som finns kvar i det övre facket uppsamlas.

Figur 2. Rapid isolation from dermis, vilket gav upphov COL1 polymeriseras till fibriller. Lösligt COL1 neutraliserades genom tillsats av Na ₂ HCO ₃ och inkuberades därefter vid 37 ° C. En fas-kontrastbilden (A) och transmissionselektronmikrofotografi (visar den bevarade d-banding) (B) av Kol1 fibriller som genereras med användning av vår snabba isoleringsförfarandet. Skala barer = 10 nm och 500 nm (respektive). Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

En avgörande komponent för att denna metod är den upprepade effektiv komprimering av den dermala provet för att avlägsna överskott av vätska. Det är viktigt att avlägsna så mycket natriumacetat som möjligt i steg 2,5 genom att komprimera provet. Vi använder en spatel för att kompaktera hud mot sidan av röret, men kunde ostduk också användas, även om detta skulle kräva avlägsnande av provet från röret och öka den tid som krävs för att utföra dessa steg. Likaså är det viktigt att komprimera provet i steg 3,1, så att volymen av natriumcitrat är korrekt i de påföljande extraktionssteg. Underlåtenhet att på lämpligt sätt ta bort vätska från provet i någon av dessa åtgärder kommer att ha en skadlig effekt på den slutliga COL1 avkastning. En annan viktig komponent i detta protokoll är att upprätthålla alla reagenser vid 4 ° C. Detta säkerställer en effektiv utvinning av syra upplöst COL1 och förhindrar stelning av kollagen. Dessutom kan förfarandet utföras genom användning av allasterila reagens i en steril miljö. Detta skulle vara av särskild betydelse för den som vill använda den här metoden för att isolera COL1 för användning på människa. Många kommersiella källor av COL1 har effektivt steriliseras genom gammabestrålning. Tyvärr har denna metod i hög grad reducerar dess förmåga att bilda geler på grund av proteinfragmentering och denaturering ^9,10.

Detta förfarande innebär optimala förutsättningar för COL1 extraktion som bestäms av många experiment som utförs för att fastställa den idealiska andelen dermal prov att buffra volym. Tillsättningen av flera rör föreslås när utredaren önskar tillämpa detta förfarande för större hudprover. Baserat på vår erfarenhet, är det inte tillrådligt att lägga till fler prov eller buffert än vad som anges för varje rör. Det är också värt att notera att kulor bestående av kvarts, keramik, granat, aluminiumoxid, kiselkarbid, eller zirkoniumoxid, som vanligtvis används tillsammans med bench-top homogenisatorer, utelämnas från vårt förfarande. De 6 sekventiella 1 min agitation cykel som beskrivs i steg 3,3 är nödvändiga på grund av en begränsning som infördes genom vår agitation utrustning. Vi kan endast agitera provet under totalt 60 sekunder åt gången, varefter maskinen kräver ett stopp. Om man har utrustning som kan ställas in för 6 min raka, skulle det förmodligen vara bra att byta till en sex-minuters cykel. Vi har dock föreslå strikt följsamhet till prov vikt och buffertvolymer som beskrivs.

Vi har funnit denna beredning metod isolerar effektivt löslig COL1 från lamm, kanin och humana dermala prov ^8. Å andra sidan var detta protokoll inte framgångsrika på att rena COL1 från svin hudprover. Även med omfattande modifieringar av metoden, svin dermis producerade en orimlig mängd fradga på grund av kvarvarande lipider och fett resulterar i ineffektiv COL1 extraktion. Omvänt kan COL1 renas från hela skolästfiskareller isolerade råtta svans senor med hjälp av en något modifierad preparat som innehåller lysermatris pärlor. Detta har tidigare beskrivits i detalj ^8.

För forskare, de potentiella användningsområdena för den slutliga syra upplöst COL1 produkt som erhålls med denna metod är: a) att tillhandahålla en vidhäftande substrat för odlingsplattor för att stödja cellbindning och spridning, b) mikro mönstring av ytor för 2 - eller 3 - dimensionell (2 - eller 3-D) cellodling, och c) skapande av 3D-ställningar för vävnadstekniska tillämpningar. Medan vissa mindre mängd massa-till-lot variation är att vänta från någon reningsmetod, har vi funnit att dessa flytande Col1 förberedelser är genomgående kan kombineras med olika cellpopulationer och gjuts i formar. Efter neutralisering av pH och värme, är resultatet en stelnad engineered vävnad konstruera med spatialt orienterade celler, jämnt fördelade i hela grundmassan. Beroende på formen hos denmögel, kan dessa konstruktioner göras i praktiskt taget vilken form och storlek ^3,4,11-14.

Sammanfattningsvis anser vi att det mest övertygande skäl för att använda denna metod är att det minskar dramatiskt den tid och ansträngning som krävs för att isolera högt rent, lösligt COL1 från en autolog vävnad källa såsom små hudbiopsier. Metoden bygger på sedan länge etablerade rutiner och producerar en produkt som uppfyller eller överträffar kvaliteten på dyra kommersiella preparat med avseende på COL1 renhet och förmåga att bilda stabila 3-D vävnad. Samtidigt ger denna förenklade metod för effektiv och snabb isolering av autologously-härledda COL1 som säkert kan användas för en mängd olika kliniska applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FastPrep-24 System	MP Biomedicals	116004500
Centrifuge	Beckman	J6-MI	Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g.