Summary
Çözünebilen bir tip 1 kollajen (col1) izolasyonu için geleneksel işlemleri de, uzun inkubasyon tampon ve fibrillerin zahmetli resuspensions of baştan sona yaklaşık 10 gün gerektirmektedir. Burada, biz az 3 saat küçük dermal biyopsilerden Süt1 arındırmak için bir araç açıklar.
Abstract
Çözülebilir kolajen tip 1 (col1) hücre kültürleri için bir yapışkan tabaka olarak ve rejeneratif uygulamalar için hücresel bir yapı iskelesi olarak yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Klinik olarak, bu proteinin yaygın kozmetik cerrahi, dermal enjeksiyonlar, kemik grefti ve rekonstrüktif cerrahi için kullanılır. Bu işlemler için COL1 ve kaynakları inflamasyon ve ret potansiyeli yanı sıra ksenobiyotiksiz hastalık bulaşmasını arttırır, genellikle insan kaynaklı değildir. Bu görüş, verimli ve hızlı bir otolog-türevi dokuların sınırlı miktarlarda ikinci Süt1 saflaştırılması için bir yöntem olup, bu sorunların çoğu aşmak olur, ancak, standart ayırma protokoller uzun ve genellikle kollajen dokularının büyük miktarlarda gerektirir. Burada, en az 3 saat ila yaklaşık 10 gün arasında bu proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için gerekli olan zamanı azaltır etkili bir col1 çıkarma yöntemi göstermektedir. Biz birçok cerrahi işlemler sırasında, çünkü onun durumu bizim doku kaynağı olarak dermis seçti. Tonun yöntemi altderinin, az miktarda yüksek ölçüde saf, çözünebilir Süt1 elde etmek için güçlü çalkalama ve santrifüj filtre ile birlikte geleneksel ekstre etme tamponları kullanır. Kısaca, dermal biyopsiler yağ, bağ dokusu ve saç çıkardıktan sonra buz gibi soğuk dH 2 O iyice yıkanır. Deri örnekleri, 0.5 M sodyum asetat ve yüksek hızlı bir tezgah üstü homojenizörü kullanılarak nonkollagenöz protein ve polisakaritlerin kaldırılır. Artık katı maddelerden kollajen, daha sonra homojenleştirici kullanılarak bir 0.075 M sodyum sitrat tampon maddesi ile ekstre edilir. Bu ekstreler karşılaştırılabilir ya da üstün ticari ürünler için kalite ya da geleneksel prosedürler kullanılarak elde edilmiş olan col1 preparatları elde 100,000 MW kesme santrifüj filtresi kullanılarak saflaştırılır. Bu yöntem, araştırma ve klinik uygulamalarda çok sayıda için otolog kaynaklı COL1 kullanımını kolaylaştıracak tahmin.
Introduction
On yıllardır, araştırmacılar ve ticari satıcılar kullanılabilir düzenlenmiş col1 fibrillerin bir matrisin yeniden süspansiyon haline getirilmesi ile sonuçlanan nötralizasyonu ardından basit bir asit ekstraksiyon protokolü, bir varyasyonunu kullanılarak deri ve tendon dokusu da dahil olmak üzere bir çeşit kaynaklardan gelen çözündürülmüş Süt1 izole var biyomedikal uygulamalarda 1-4 çok sayıda için. COL1 için klinik uygulamalar birçok örnek olsa da, bu proteinin hazırlık 5-7 gerçekleştirmek için gün veya hafta alarak uzun ekstraksiyonlanm gerektirdiğinden, bu birkaç otolog kaynaklı col1 kullanır. Sonuç olarak, araştırmacılar, araştırma ve hekimler, genellikle, örneğin, sıçan, sığır, domuz veya insan olmayan altderinin gibi dokuları kullanılarak veya kadavra derisi kullanılarak kaldırılır veya sünnet izleyerek hazırlanır COL1 pahalı, ticari preparatları kullanın. Rejeneratif uygulamalar için, yetenekleri ile ilgili olarak bu ürünler, sergi değişkenlik çok katı oluşturulması içinmatrisler veya hücre eki ve büyümeyi destekleme yeteneğine doku yapıları. Sonuç olarak, hızlı erişilebilir ve bol otolog doku kaynaklarından Süt1 ayıklamak için tasarlanmış yeni bir standart yöntem için ayrı bir ihtiyaç vardır.
Bu tür bir yöntem col1 ilgi hayvan modeli çıkarılır ve kollajen bazlı iskeleler üzerine monte tasarlanmış dokuların klinik öncesi test edilmesi için kullanılabilecek bir araştırma ortamında zaman ve paradan tasarruf sağlayacaktır. Aynı zamanda, klinikte bir hızla izole, otolog kaynaklı Süt1 kullanma seçeneğine sahip aksi allojenik veya ksenogeneik hazırlıkları alacak hastalar için genel güvenliği artıracak. Bir autogeneic hazırlık alan hastalar için, bu akıcı yöntem büyük ölçüde biyopsi toplama ve kolajen uygulama arasındaki süreyi azaltacaktır. Bu nedenlerden dolayı, yüksek hızlı ag kullanarak köklü bir col1 izolasyon ve saflaştırma yöntemi geliştirmek için arananrehabilitasyonu amaçlayan ve boyut dışlama santrifüj. Bu yöntem birçok laboratuvarlarda bulunan standart tamponlar ve ekipman kullanarak gerçekleştirmek için basit. Yüksek hızda çalkalama kullanılarak, protokolümüz az 3 saat 8 için yaklaşık 10 gün arasında çözülebilir, dermal Süt1 izole etmek için gerekli olan zamanı azaltır. Önemli olarak, bu metod prosedürleri tek bir kümesi esnasında hastalar için otolog türetilmiş Süt1 hazırlamak için klinik ortamda gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada kuzu derisinden COL1 ve izolasyonu gösterecektir. Yazılmış olduğu gibi, bu protokol de başarıyla tavşan ve insan cilt Süt1 izole etmek için kullanılabilir.
1.. Dermal örnek hazırlayın
- Kullanımdan önce 4 ° C'ye bütün reaktifler dengelenmesi.
- Buz dH 2 O dermal örneği (25-50 g) durulayın ve tüy dökücü krem ile herhangi yün, kürk, ya da tüylerden.
- Bağ dokusu ve yağ numune tozunu kazımak için bir tek kenar jilet kullanın.
- Buz dH 2 O'da örnek durulayın
- Tek bir kenar jilet ile 1 cm x 1 cm parçalar halinde deri örneği dilimleyin.
2. Nonkollagenöz Çözündürülmüş Malzeme kaldır
- Numune, 50 ml konik tüp başına 5 g tartılır ve buz soğukluğundaki 0,5 M sodyum asetat, 30 ml.
- Tezgah üstü homojenizatör içinde bir 50 ml tüp adaptörü ile 6 m / saniye ayarında 1 dakika boyunca tüpleri karıştırın.
- Sup atın7 sodyum asetat yıkama döngüleri toplam ernatant ve tekrarlayın.
- Buz soğukluğunda dH 2 O örnek yıkayın ve kalıntı sodyum asetat giderilmiş, bir kez karıştırın.
- Fazla sıvının çıkması ve daha sonra yeni bir 50 mL konik tüp aktarmak için tüpün kenarına karşı örnek sıkıştırmak için bir spatula kullanın.
3. Kollajen Ekstraksiyon yazın
- Örnek sıkıştırma ve her bir yıkamadan sonra süpernatant atarak tezgah üstü homojenleştirici içinde 6 m / sn 'de 1 dakika boyunca ml / g 2 iki kez örnek yıkayın 0.075 M sodyum sitrat tampon maddesi.
- Numuneye 0.075 M sodyum sitrat tamponu taze bir 2 ml / g bir kısım ekleyin.
- Her çevrim arasındaki tampon çıkarmadan 6 sıralı 1 dk, ajitasyon 6 m / sn tezgah üstü homojenleştirici mix çevrimi gerçekleştirin.
- Bir toplama tüpüne kalın, berrak süpernatant aktarın.
- Numuneye bir ml / g 1 ek 0.075 M sodyum sitrat tamponu ilave edin ve bir final tezgah üstü homojenleştirici agita yerinetion çevrimi.
- Bir toplama tüpüne bu son süpernatant ekleyin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 3,200 x g de santrifüj toplama tüpü
- 100.000 molekül ağırlığına sahip üst bölmesine süpernatant aktarın santrifügal filtre cihazı kesti.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 3200 x g'de santrifüje
- 4 ° C 'de bir temiz konik tüp ve saklamak için, üst bölmeden saflaştırılmış Süt1 aktarın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu col1 izolasyon protokol tamamlanması için yaklaşık 2 saat 15 dakika gerektirir. Şekil 1, bu prosedürdeki önemli adımlar şematik bir diyagramını göstermektedir. Örnek hazırlama ve yüksek hızlı ajitasyon 7 döngülerini gerçekleştirmek ve sodyum asetat ile durulama ürünleri, yaklaşık 35 dakika (Şekil 1A-C) alır. Bir ajitasyon Sahne ve dH 2 O ile durulama yaklaşık 5 dk (Şekil 1D ve 1E) alır. Sodyum sitrat eklemek ve bir çalkalama için örnek tabi tutulması ve ajitasyon 6 döngü izledi döngüsü, yaklaşık 45 dakika (Şekil 1F ve 1G) alır yıkayın. Sıvı ekstreden, geri kalan katı maddeler santrifüj 15 dakika (Şekil 1 H) alır. Son olarak, filtre cihazı için örnek aktarma ve arıtılmış, çözünebilir konsantre Süt1 ve küçük proteinleri uzaklaştırmak için bir santrifüj adımı gerçekleştirmek30 dakika sürer (Şekil 1i ve 1J). Nihai ürün ayrıca Na HCO3 2 eklenerek ve 37 ° C'de inkübe edilerek polimerize edilebilir COL1 çözünür bir konsantre, yüksek derecede saf preparatıdır Bu faz kontrast mikroskopisi ve görüntüler ürün hücre doku kültürü plakalarına bağlanması ya da 3-D doku mühendisliği uygulamaları için bir iskele (Şekil 2A ve 2B) olarak kullanılmak için bir alt-tabaka olarak hizmet verebilir col1 lifler ortaya katılaştı.
Şekil 1. Geliştirilmiş col1 izolasyon yönteminin şematik bakış. A) Dilimlenmiş dermis), 50 ml konik bir tüp. B ilave edilir, 0.5 M sodyum asetat, numuneye ilave edilir. ° C)Numune her döngü sonra değiştirilmesi sodyum asetat tamponu ile çalkalama 7 döngüsüne tabi tutulur. D) dH 2 O cilt numunesine eklenir. E) hazırlanması çalkalama ve dH 2 O ile 1 döngü tabi kapalı dökülür. F) 0.075 M sodyum sitrat Numune ajitasyon. H) 6 döngüsü örnek büyük, katıların çıkması için santrifüje tabi tutulur tabi tutulur numune. G) ilave edilir. I) 'in yüzey maddesi santrifüje filtre ünitesi, kesilmiş bir 100.000 moleküler ağırlığa aktarılır konik bir tüp. J) Bu birim santrifüj edilir ve üst bölme kalır viskoz sıvı toplanır.
Şekil 2,. Rapid izolasyon frofibriller içinde, polimerize Süt1 elde etmek üzere m dermis. çözünür col1 2 Na HCO3 eklenerek nötralize edildi ve daha sonra 37 ° C de inkübe edildi Bir faz kontrast görüntü (A) ve bizim hızlı izolasyon yöntemi kullanılarak oluşturulan col1 fibrillerin (korunmuş D-bantlama gösteren) transmisyon elektron mikroskobu (B). Ölçek bar = 10 mikron ve 500 nm (sırasıyla). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin önemli bir öğesi, fazla sıvının çıkması için dermal numunenin tekrar etkili sıkıştırma. Bu örnek sıkıştırılmasıyla aşamasında 2,5 mümkün olduğu kadar, sodyum asetatın ayrılması için çok önemlidir. Bu tüpün yanına karşı cildi sıkıştırmak için bir ıspatula ile birlikte, bir tülbent de kullanılabilir, bu tüpten numune çıkarılmasını gerektirir ve bu adımları gerçekleştirmek için gereken süreyi uzatır olsa da. Benzer şekilde, sodyum sitrat hacmi daha sonraki ekstre etme adımda doğru olduğunu, aşama 3.1 'de örnek sıkıştırmak için önemlidir. Yeterince bu adımların herhangi birinde numuneden sıvının çıkması için başarısızlık nihai col1 verim üzerinde zararlı bir etkiye sahip olacaktır. Bu protokol için bir başka önemli bileşeni, 4 ° C 'de, tüm tepkin maddeleri korumaktır Bu asit çözündürülmüş COL1 etkin çıkarma sağlar ve kollajen katılaşmasını önler. Buna ek olarak, her işlem kullanılarak yapılabildisteril bir ortamda steril reaktifler. Bu, insanlarda kullanım için bir Süt1 izole etmek için bu yöntemi kullanmak isteyen kişiler için özel bir öneme sahip olacaktır. COL1 çoğu ticari kaynaklarının etkili gama ışıması ile sterilize edilmiştir. Ne yazık ki, bu uygulama çok protein parçalanması ve denatürasyon 9,10 nedeniyle jeller oluşturmak için kabiliyetini azaltır.
Bu prosedür, hacim tampon dermal numunenin doğru oranını belirlemek için yapılan pek çok deneyden elde belirlenen col1 çıkarılması için en uygun şartları temsil eder. Araştırmacı büyük deri örnekleri için bu yordamı istihdam istediğinde daha tüplerin eklenmesi önerilmektedir. Bizim deneyime dayalı, daha fazla örnek eklemek veya her tüp için belirtilenden daha tampon tavsiye edilmez. Ayrıca belirtmek gerekir ki yaygın b ile bağlantılı olarak kullanılan silika, seramik, garnet, alüminyum oksit, silisyum karbür, zirkonyum oksit ya da, oluşan tanelerench-top homogenızers, bizim prosedür çıkarılmıştır. Aşama 3.3 'de tanımlanan 6 ardışık 1 dakika çalkalama çevrimi nedeniyle bizim çalkalama ekipmanı tarafından uygulanan bir sınırlama için gereklidir. Sadece makine bir stop gerektiren sonra, her seferinde 60 sn 'lik bir toplam için örnek tahrik edebilir. Bir 6 dk düz için ayarlanabilir ekipman varsa, büyük olasılıkla bir, altı dakikalık döngüsü geçmek için iyi olurdu. Biz, ancak, açıklanan numune ağırlığı ve tampon hacimleri sıkı bağlılık önerirsiniz.
Bu hazırlama yöntemi verimli bir şekilde kuzu, tavşan ve insan dermal örnekler 8 çözünür Süt1 izole bulduk. Öte yandan, bu protokol, domuz derisi örneklerinin Süt1 saflaştırılması başarılı değildi. Hatta edilen yönteme yapılan modifikasyonlar ile, domuz dermis için verimsiz col1 çıkarma ile sonuçlanan lipid ve kalıntı yağ bir köpük aşırı miktarda üretilir. Tersine, col1 bütün sıçan kuyruğu saflaştırılabilirya da yokedici matris boncuk içeren biraz değiştirilmiş bir hazırlık kullanarak sıçan kuyruğu tendonları izole. Bu, daha önce detaylı bir 8'de tarif edilmiştir.
Bilim adamları için bir araştırma, bu yöntem kullanılarak elde edilen son asit-çözündürülmüş col1 ürünün potansiyel kullanım alanları şunlardır: a) hücre eki ve çoğalmasını desteklemek için kültür plakaları bir yapışkan alt tabaka sağlamak için 2, yüzeylerin b) mikro-yapıya model verme - ya da 3 - boyutlu (2 - veya 3-D) hücre kültürü, ve c) doku mühendisliği uygulamaları için 3-D iskelelerinin oluşturulması. Çok partiye değişkenlik bazı küçük miktarda herhangi bir saflaştırma yönteminden beklenen birlikte, bu sıvı col1 preparasyonlar sürekli olarak çeşitli hücre popülasyonları ile bir araya getirilmiş ve kalıplar içine dökülebilir mümkün olduğunu bulduk. PH ve ısınma nötralize sonra, sonuç katılaştırılmış mühendislik doku matrisi boyunca eşit olarak dağıtılmış mekansal odaklı hücreleri ile yapıdır. Şekline bağlı olarak,kalıp, bu yapılar, hemen hemen herhangi bir şekil ve boyutta 3,4,11-14 yapılabilir.
Özetle, bu yöntemi kullanmak için en zorlayıcı nedeni ölçüde bu küçük cilt biyopsisi gibi bir otolog doku kaynağından yüksek saf, çözünür Süt1 izole etmek için gereken zaman ve çabayı azaltır olduğunu kanaatindeyiz. Bu yöntem uzun yerleşik prosedürlere göre ve col1 saflık açısından ve stabil 3-D dokuları oluşturmak üzere yeteneği ile pahalı ticari preparasyonlar kalite karşılayan ya da aşan bir ürün üretmektedir. Aynı zamanda, bu basitleştirilmiş yöntem güvenli bir şekilde, klinik uygulamalar için çok sayıda kullanılabilir otolog türevi COL1 en etkin ve hızlı bir izolasyon sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DBC için HL068915), (CAP) Thrasher Araştırma Fonundan Yeni Araştırmacı Ödülü bir araştırma bursuyla, bir Grant-in-Aid (DBC için 12GRNT11910008) Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen , Çocuk Kalp Vakfı (DBC için), ve Boston Çocuk Hastanesi Kalp İletim Fonu, Ryan Aile Endowment ve David Pullman tarafından yapılan bağışlardan bir araştırma hibe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
- Nageotte, J. Coagulation fibrillaire in vitro du collagène dissous dans un acide dilué. CR hebd. séances Acad. Sei. 184, 115 (1927).
- Schmitt, F. O., Hall, C. E., Jakus, M. A. Electron microscope investigation of the structure of collagen. J. Cell Comp. Physiol. 20, 11-33 (1942).
- Choi, Y. H., et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am. J. Pathol. 169, 72-85 (2006).
- Pacak, C. A., Cowan, D. B. Fabrication of myogenic engineered tissue constructs. J. Vis. Exp. (27), (2009).
- Cliche, S., Amiot, J., Avezard, C., Gariepy, C. Extraction and characterization of collagen with or without telopeptides from chicken skin. Poultry Sci. 82, 503-509 (2003).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
- Seifter, S., Gallop, P. Preparation and properties of soluble collagens. Methods in Enzymology. Colowick, S., Kaplan, N. , Academic Press. NY. (1963).
- Pacak, C. A., Powers, J. M., Cowan, D. B. Ultrarapid purification of collagen type I for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 879-885 (2011).
- Ohan, M. P., Dunn, M. G. Glucose stabilizes collagen sterilized with gamma irradiation. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1188-1195 (2003).
- Tyan, Y. C., Liao, J. D., Lin, S. P., Chen, C. C. The study of the sterilization effect of gamma ray irradiation of immobilized collagen polypropylene nonwoven fabric surfaces. J. Biomed. Mater. Res. A. 67, 1033-1043 (2003).
- Ber, S., Torun Kose, G., Hasirci, V. Bone tissue engineering on patterned collagen films: an in vitro study. Biomaterials. 26, 1977-1986 (2005).
- Liu, Y., Sun, S., Singha, S., Cho, M. R., Gordon, R. J. 3-D femtosecond laser patterning of collagen for directed cell attachment. Biomaterials. 26, 4597-4605 (2005).
- Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning. Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 883-890 (2003).
- Leighton, J., Justh, G., Esper, M., Kronenthal, R. L. Collagen-coated cellulose sponge: three dimensional matrix for tissue culture of Walker tumor 256. Science. 155, 1259-1261 (1967).
