Summary
对于可溶性Ⅰ型胶原（COL1）隔离的传统程序需要从开始10天左右，由于长时间的缓冲液孵育和纤丝费力再悬浮完成。在这里，我们描述了从真皮小活检净化COL1，在不到3小时的方法。
Abstract
可溶性Ⅰ型胶原（COL1）被广泛地用作用于细胞培养的粘合剂基体和作为再生的应用程序的蜂窝式脚手架。临床上，这种蛋白是广泛用于美容手术，经皮注射，骨移植术，和重建手术。 COL1对这些程序的来源通常是非人，这增加了炎症和排斥反应的可能性，以及外源性疾病的传播。鉴于此，一种方法能够有效地和快速地从数量autologously衍生组织有限净化COL1会规避很多这样的问题，但是，标准隔离协议是漫长的，往往需要大量的胶原组织。这里，我们表明一个有效的COL1的提取方法，可降低从约10天分离并纯化该蛋白为小于3小时的时间。我们在许多外科手术的选择，因为它的可用性真皮作为我们的组织来源。 Ŧ他的方法是使用传统的提取缓冲液结合有力的搅拌和离心过滤从少量真皮的获得高纯度的可溶性COL1。简单地说，皮肤活检进行彻底的冰冷的DH 2 O去除脂肪，结缔组织，和头发后清洗。将皮肤样品剥离用0.5M的乙酸钠和一个高速台式匀浆非胶原蛋白质和多糖的。从残余的固体胶原随后与使用匀浆机以0.075M的柠檬酸钠缓冲液提取。这些提取物是使用100,000兆瓦截止离心过滤器能产生可比较的或优质的商业产品或那些使用传统方法得到的COL1制剂纯化。我们预计这种方法将有助于autologously衍生COL1的为众多的研究和临床应用的利用率。
Introduction
几十年来，研究人员和商业厂商已经分离出溶解的COL1从组织来源，包括皮肤和腱使用简单的酸提取协议接着进行中和，这导致组织COL1原纤维基质的重悬浮，可用于某些变异的分类为多种生物医学应用1-4。虽然有对COL1临床应用的例子很多，少数这些采用autologously衍生COL1因为准备这种蛋白质的需要冗长的提取需要几天或几周进行5-7。因此，研究调查员和医师通常使用COL1的正在使用非人组织如鼠，牛或猪的真皮或皮肤用从尸体取出或以下包皮环切制备昂贵，商业制剂。对于再生应用，这些产品很多变化表现出对于自己的能力，形成固体矩阵或能够支持细胞粘附和生长的组织结构。因此，存在一个明显的需要，它能够快速从方便和丰富的自体组织源中提取COL1一个新的标准化方法。
这种方法可以节省时间和金钱在研究环境，让COL1可以从感兴趣的动物模型中提取并用于组装的胶原蛋白为基础的脚手架工程化组织的临床前试验。与此同时，具有在临床使用迅速隔离，autologously衍生COL1的选项会增加，否则将接收同种异体或异种制剂的患者的整体安全性。用于接收自体制剂的患者，这个简化的方法可大大减少活检收集和胶原蛋白应用程序之间的时间间隔。基于这些原因，我们试图通过使用高速AG改善后一个历史悠久的COL1分离和提纯方法itation和尺寸排阻离心。这种方法简单执行使用标准缓冲液和设备在许多实验室中找到。通过采用高速搅拌，我们的协议减少所需的时间来分离可溶性的，真皮COL1从约10天到小于3小时8。重要的是，这种方法可以容易地执行在临床上以制备autologously衍生COL1用于在一组程序中的患者使用。
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Protocol
在这里，我们将展示COL1从羔羊皮隔离。作为写入，该协议也可以用来成功地从兔和人的皮肤隔离COL1。
1。准备皮肤样本
- 将所有溶液平衡至4℃后才能使用。
- 冲洗皮肤样本（25-50克）在冰冷的DH 2 O和删除任何羊毛，毛皮，或头发脱毛膏。
- 使用单刃刀片刮结缔组织和脂肪的样品净化。
- 冲洗在冰冷的DH 2 O样品
- 切片皮肤样品切成1厘米×1厘米的块用单刃刀片。
2。除去溶解的中非胶原材料
- 称出5克每50ml样品的锥形管中，并加入30毫升冰冷的0.5M的乙酸钠。
- 混合管1分钟，使用50毫升管适配器在台式均质6米/秒的设置。
- 丢弃SUPernatant和重复，共7醋酸钠洗涤周期。
- 冲洗样品在冰冷DH 2 O和混合一次，以除去残余的乙酸钠。
- 用刮刀压靠管的一侧的样品以除去过量的液体，然后转移到一个新的50ml锥形管中。
3。 I型胶原蛋白的提取
- 在第2次清洗样本毫升/克，0.075M柠檬酸钠缓冲液为6米/秒的台式匀浆器压缩所述样品和每次洗涤后弃去上清1分钟。
- 加的，0.075M柠檬酸钠缓冲液中的淡水2毫升/克的等分试样的样品。
- 执行6个连续1分钟，6米/秒台式均质混合搅拌周期不删除每个周期之间的缓冲器。
- 转移厚，上层清液的收集管。
- 增加一个额外的1毫升/克，0.075M柠檬酸钠缓冲液的样品并进行最后一个台式匀浆器激越化周期。
- 将此最终上清收集管。
- 离心收集管在3200×g离心10分钟，在4℃下
- 将上清转移至100,000分子量的车厢顶部切断离心过滤装置。
- 离心机在3,200 xg离心30分钟，在4°C。
- 从上部隔室转移纯化COL1到一个干净的锥形管中并储存于4℃。
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Representative Results
这COL1隔离协议需要大约2小时，15分钟即可完成。图1示出的示意图，概述在此过程中的主要步骤。制备样品并进行高速鼓动的7个循环和漂洗用乙酸钠约需35分钟（图1A-C）。执行一个搅拌和冲洗周期与DH 2 O大约需要5分钟（图1D和1E）。添加柠檬酸钠和试样施加1搅拌和冲洗循环后搅拌6个周期需要大约45分钟（图1F和1G）。从提取液离心分离剩余的固体需要15分钟（图1H）。最后，转移样品到过滤装置，并执行其他步骤离心浓缩纯化，溶解COL1和去除小分子蛋白只需30分钟（图1I和1J）。最终产物是可溶的COL1的浓缩，高纯度的制备，可以通过加入Na 2 HCO 3和孵育在37℃下进一步聚合本相衬显微镜图像固化产物揭示COL1纤维可以作为底物的细胞附着到组织培养板或用作支架的三维组织工程的应用（图2A和2B）。
图1。改进COL1隔离法的总体示意图。 A）刨切真皮加入到50毫升锥形管中。 乙 ）的0.5M乙酸钠加入到样品中。C）上样品进行搅拌用乙酸钠缓冲液中7个循环，每个循环后更换。D）DH 2 O被添加到该皮肤样品E）的制备方法进行搅拌和Dh 2 O为1周期被倒出。F）的 0.075柠檬酸钠加入到样品G）的样品进行搅动H）第6周期将样品离心以去除大的固体。Ⅰ）的上清液转移到切断在离心过滤单元100,000分子量一个锥形管J）这个零件是离心和粘性液体残留在车厢顶部被收集。
图2。快速分离来回米真皮，得到COL1聚合成原纤维可溶性COL1被中和，加入的Na 2 HCO 3，然后置于37℃。相位对比图像（A）和使用我们的快速分离方法产生的COL1纤维的透射电子显微镜照片（显示保存的d带）（B）。比例尺= 10微米和500纳米（分别）。 点击这里查看大图。
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Discussion
这种方法的一个关键组成部分是真皮样品的反复有效的压缩，去除多余的液体。关键是通过压缩样本以除去尽可能多的醋酸钠尽可能在步骤2.5。我们用一个抹刀压实对管侧的皮肤，但是，也可以采用粗棉布，虽然这将须除去样品从管中，并增加来执行这些步骤所需的时间。同样地，以压缩的样本，在步骤3.1，使柠檬酸钠的量是在随后的提取步骤准确是重要的。未能充分从在上述任何步骤除去样品中的液体将不会对最终COL1产量有不利影响。另一个关键组成部分这一协议是维护所有试剂在4℃这确保酸溶解COL1的高效提取，并且防止胶原蛋白凝固。另外，可以使用所有要执行的程序无菌试剂在无菌环境中。这将是为那些希望采用这种方法来隔离COL1用于人体特别重要的意义。 COL1的许多商业来源已经由γ-辐射被有效消毒。不幸的是，这种做法大大降低了其形成是由于蛋白质碎片和变性9,10凝胶的能力。
这个过程指从执行建立真皮样品的理想比例，缓冲体积中的许多实验确定为COL1提取的最佳条件。增加更多的管建议时，研究者希望采用这种方法对于较大的皮肤样本。根据我们的经验，这是不可取的，以增加更多的样品或缓冲液比表示为每根管子。还值得一提的是，有孔玻璃珠硅石，陶瓷，石榴石，氧化铝，碳化硅，氧化锆，这是在用b结合常用的组成恩奇顶均质机，是从我们的程序省略。在步骤3.3中所述的6个连续1分钟搅拌周期是必要的，因为我们的搅拌设备强加的限制。我们只能在一个时间搅动样品，总共60秒，在这之后的机器需要停止。如果你有设备，可以为6分钟直线设置，它可能会被罚款切换到一，六分钟的循环。我们这样做，不过，建议严格遵守所描述的样品重量和缓冲卷。
我们发现这种制备方法有效地分离可溶性COL1从羊肉，兔肉，以及人类皮肤样本8。在另一方面，该协议并不成功从猪皮肤样品纯化COL1。即使有大量的修改的方法，猪真皮产生因残留的脂质和脂肪导致低效COL1提取的泡沫的量过高。相反，COL1可以从整个鼠尾巴被净化或使用稍加修改的准备，包括裂解矩阵珠分离的鼠尾肌腱。此进行了详细8以前已经描述。
对于研究的科学家，用该方法得到的最终酸溶解COL1产品的潜在用途包括：a）提供对培养板的粘接衬底，以支持细胞粘附和增殖，B）的微图案化表面的为2 - 或3 - 二维（2 - 或3-D）细胞培养，以及c）建立组织工程应用的三维支架。虽然一些少量的批与批之间的变化是从任何纯化方法预期，我们已经发现，这些液体COL1准备工作始终能够结合不同的细胞群，并浇铸到模具中。中和的pH值和加热后，其结果是固化的工程化组织构建与整个基体均匀地分布在空间上面向细胞。根据不同的形状模具，这些结构可以在几乎任何形状和尺寸3,4,11-14制成。
总之，这是我们认为最有说服力的理由，才能使用这个方法的是，它极大地减少了从自体组织来源，如小皮肤活检分离出高纯度的可溶性COL1所需的时间和精力。该方法是基于长期建立的程序，并产生满足或超过的昂贵商品制剂相对于COL1纯度和形成稳定的三维组织的能力的质量的产品。同时，这种简化方法允许autologously衍生COL1，可安全地用于多种临床应用中的有效和快速的隔离。
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Disclosures
作者没有竞争经济利益披露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（HL068915到DBC），从长尾研究基金（以CAP）新研究员奖的研究经费，格兰特在急救来自美国心脏协会（12GRNT11910008到DBC）的支持从儿童心脏基金会（以DBC），并捐赠给波士顿儿童医院心脏传导基金，瑞恩家庭养老和由大卫普尔曼的研究经费。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
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