Summary
Procedimentos tradicionais para o isolamento do tipo solúvel 1 colágeno (col1) requerem cerca de 10 dias do início ao fim por causa de incubações tampão longas e trabalhosas resuspensions de fibrilas. Aqui, nós descrevemos um meio para purificar a partir de pequenas biópsias COL1 dérmicos em menos de 3 horas.
Abstract
Tipo 1 Solúvel colagénio (COL1) é amplamente utilizado como um substrato adesivo para culturas de células e como um andaime para aplicações de regeneração celular. Clinicamente, esta proteína é amplamente utilizado para a cirurgia estética, injeções dérmicas, enxerto ósseo e cirurgia reconstrutiva. As fontes de COL1 para estes processos são geralmente não-humanos, o que aumenta o potencial para a inflamação e a rejeição, bem como a transmissão da doença de xenobióticos. Em vista disto, um método eficiente e rápido para purificar COL1 de quantidades limitadas de tecidos autologously derivados iria contornar muitos destes problemas, no entanto, os protocolos de isolamento convencionais são demorados e muitas vezes necessitam de grandes quantidades de tecidos colagenosos. Aqui, demonstramos um método de extracção COL1 eficiente que reduz o tempo necessário para isolar e purificar a proteína a partir de cerca de 10 dias para menos de 3 horas. Escolhemos a derme como a fonte de tecido devido à sua disponibilidade durante muitos procedimentos cirúrgicos. Tseu método usa buffers de extração tradicionais combinados com agitação vigorosa e filtração centrífuga para obter altamente pura, COL1 solúvel de pequenas quantidades de cório. Resumidamente, as biópsias da derme são lavados em gelada dH2O após a remoção de gordura, tecido conectivo, e cabelo. As amostras de pele são retirados de proteínas e polissacarídeos noncollagenous usando 0,5 M de acetato de sódio e uma alta velocidade de bancada homogeneizador. O colagénio de sólidos residuais é subsequentemente extraído com um tampão de citrato de sódio 0,075 M com o homogeneizador. Estes extractos são purificados usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que produzem preparações COL1 de qualidade comparável ou superior aos produtos comerciais ou aquelas obtidas através de procedimentos tradicionais. Prevemos que este método vai proporcionar a utilização dos derivados de autologously COL1 para uma multiplicidade de pesquisa e aplicações clínicas.
Introduction
Durante décadas, os investigadores e os fornecedores comerciais isolaram COL1 solubilizado a partir de uma variedade de fontes de tecidos, incluindo a pele e tendões usando uma variação de um protocolo de extracção de ácido simples, seguido de neutralização, o que resulta numa libertação de uma matriz de fibrilas COL1 organizados que podem ser utilizados para uma infinidade de aplicações biomédicas 1-4. Embora existam muitos exemplos de aplicações clínicas para COL1, alguns deles empregam COL1 autologously derivados porque a preparação desta proteína requer longas extrações levando dias ou semanas para realizar 5-7. Como resultado, os investigadores e médicos investigação utilizam geralmente caros, preparações comerciais de COL1 que são preparados usando os tecidos não-humanas, tais como rato, bovino, porcino ou cório ou usando pele retiradas de cadáveres ou depois da circuncisão masculina. Para aplicações regenerativas, muitos destes produtos apresentam variabilidade no que diz respeito à sua capacidade para formar sólidomatrizes ou construções de tecidos capazes de suportar a ligação de células e o crescimento. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de um novo método normalizado concebido para extrair rapidamente COL1 a partir de fontes de tecidos autólogos acessíveis e abundantes.
Tal método poderia economizar tempo e dinheiro no ambiente de pesquisa, onde COL1 poderia ser extraído do modelo animal de interesse e utilizado para testes pré-clínicos de tecidos artificiais montados em andaimes à base de colágeno. Ao mesmo tempo, ter a opção de usar um rapidamente isolada, COL1 autologously derivado na clínica seria aumentar a segurança geral dos pacientes que, de outra forma recebem alogénicas ou xenogénicas preparações. Para os pacientes que receberam uma preparação autogeneic, este método simplificado seria reduzir bastante o intervalo entre a coleta de biópsia e aplicação de colágeno. Por estas razões, buscamos aperfeiçoar um método de isolamento e purificação COL1 estabelecido há muito tempo usando ag de alta velocidadeacreditação e de exclusão de tamanho de centrifugação. Este método é simples de executar, usando soluções padrão e equipamentos encontrados em muitos laboratórios. Ao empregar a agitação de alta velocidade, o nosso protocolo reduz o tempo necessário para isolar solúvel, dérmica COL1 de aproximadamente 10 dias para menos de 3 horas 8. Importante, este método pode ser facilmente realizada no cenário clínico, a fim de preparar COL1 autologously-derivado para utilização em doentes durante um único conjunto de procedimentos.
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Protocol
Aqui vamos demonstrar o isolamento de COL1 de pele de cordeiro. Como escrito, este protocolo pode também ser utilizado com êxito para isolar COL1 de coelho e pele humana.
1. Prepare dérmica Amostra
- Equilibrar todos os reagentes a 4 ° C antes de usar.
- Lavar amostra dérmica (25-50 g) em gelada dH 2 O e remover qualquer lã, pele, cabelo ou com creme depilatório.
- Use uma lâmina de barbear de ponta única para raspar a limpo amostra de tecido conjuntivo e de gordura.
- Lavar a amostra em gelada dH 2 O.
- Corte a amostra de pele em 1 cm x 1 centímetro pedaços com uma lâmina de barbear de ponta única.
2. Remover noncollagenous solubilizado de materiais
- Pesar 5 g de amostra por tubo de 50 ml e adicionar 30 ml de 0,5 M de acetato de sódio gelada.
- Misturar os tubos durante 1 minuto na configuração 6 m / seg utilizando uma placa de tubo de 50 ml no homogeneizador de bancada.
- Descarte supernatant e repita para um total de 7 ciclos de lavagem de acetato de sódio.
- Lavar a amostra em gelada dH 2 O e misture uma vez para remover o acetato de sódio residual.
- Usar uma espátula para comprimir a amostra de encontro ao lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, transferir para um tubo de 50 ml fresco.
3. Colágeno tipo I Extração
- Tampão citrato de lavar a amostra duas vezes em 2 ml / g de sódio 0,075 M, durante 1 min a 6 m / s na bancada homogeneizador comprimindo a amostra e descartando o sobrenadante depois de cada lavagem.
- Adicionar a 2 ml / g nova porção de tampão de citrato de sódio 0,075 M à amostra.
- Realizar 6 seqüencial 1 min, 6 m / s ciclos de bancada mix homogeneizador de agitação, sem retirar o tampão entre cada ciclo.
- Transfira a espessura, o sobrenadante claro para um tubo de coleta.
- Adicionar um tampão de citrato de sódio 0,075 M adicional de 1 ml / g para a amostra e realizar uma última bancada homogeneizador agitaciclo ção.
- Adicionar este sobrenadante final para um tubo de recolha.
- Centrifuga-se o tubo de colheita de 3.200 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para o topo do compartimento de um peso molecular de 100.000 cortado dispositivo de filtração centrífuga.
- Centrifugar a 3.200 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Transferir a COL1 purificada a partir do compartimento superior para um tubo cónico limpo e armazenar a 4 ° C.
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Representative Results
Este protocolo de isolamento COL1 requer cerca de 2 horas e 15 minutos para ser concluído. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa as principais etapas deste processo. Preparação da amostra e realizando os 7 ciclos de agitações de alta velocidade e lavagens com acetato de sódio leva cerca de 35 minutos (Figuras 1A-C). Realizando uma agitação e enxágüe ciclo com dH2O demora cerca de 5 min (Figuras 1D e 1E). A adição de citrato de sódio e submeter a amostra a uma agitação e enxaguar ciclo seguido por seis ciclos de agitação leva cerca de 45 minutos (Figuras 1F e 1G). A centrifugação os sólidos remanescentes a partir do extracto líquido leva 15 minutos (Figura 1H). Finalmente, a transferência da amostra para um dispositivo de filtro e realizando mais um passo de centrifugação para concentrar a purificada, COL1 solubilizado e remover pequenas proteínasleva 30 min (Figuras 1I e 1J). O produto final é uma preparação concentrada, altamente pura de COL1 solúvel que pode ser ainda polimerizado pela adição de Na 2 HCO 3 e incubando a 37 ° C. As imagens de microscopia de contraste de fase deste produto solidificado revelar COL1 fibrilas que podem servir como um substrato para a ligação de células a placas de cultura de tecidos ou ser utilizada como um andaime para aplicações de engenharia de tecidos de 3-D (Figuras 2A e 2B).
Figura 1. Esquema do método de isolamento COL1 melhorada. A) derme fatiados é adicionado a um tubo de 50 ml. B) de 0,5 M de acetato de sódio é adicionado à amostra. C) Aamostra é submetida a 7 ciclos de agitação com tampão de acetato de sódio substituídos após cada ciclo. D) dH2O é adicionado à amostra de pele. E) A preparação é submetida a um ciclo de agitação e dH2O é decantado. F) citrato de sódio 0,075 M é adicionado à amostra. G) A amostra é sujeita a 6 ciclos de agitação. H) A amostra é centrifugada para remover os sólidos grandes. I) O sobrenadante é transferido para um peso molecular de 100.000 cortado unidade de filtro centrífugo um tubo cónico. J) Esta unidade é centrifugada e o líquido viscoso que permanece no compartimento de topo é recolhido.
Figura 2. Isolamento rápido from derme para produzir COL1 polimerizado em fibrilas. Solúvel COL1 foi neutralizada pela adição de Na 2 HCO 3 e, em seguida, incubadas a 37 ° C. Uma imagem de contraste de fase (A) e micrografia eletrônica de transmissão (mostrando o d-bandas preservado) (B) de fibrilas COL1 gerados usando o nosso método de isolamento rápido. Barras de escala = 10 m e 500 nm (respectivamente). Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Um componente importante do presente método é a compressão eficaz repetida da amostra cutânea para remover o excesso de líquido. É essencial para remover tanto quanto possível, de acetato de sódio no passo de 2,5 por compressão da amostra. Usamos uma espátula para compactar a pele contra o lado do tubo, no entanto, gaze também pode ser usado, embora isto exigir a remoção da amostra do tubo e aumentar o tempo necessário para realizar estes passos. Da mesma forma, é importante para comprimir a amostra no passo 3.1, de modo que o volume de citrato de sódio é preciso nas etapas de extracção subsequentes. A não remoção de líquido adequadamente a partir da amostra em qualquer um destes passos tenha um efeito negativo sobre o rendimento final COL1. Outro componente chave para este protocolo é manter todos os reagentes a 4 ° C. Isto assegura a extracção eficiente do ácido COL1 solubilizado e impede a solidificação do colagénio. Além disso, o processo pode ser realizado utilizando todosreagentes estéreis num ambiente estéril. Isto seria particularmente importante para aqueles que desejam utilizar este método para isolar COL1 para utilização em seres humanos. Muitas fontes comerciais de COL1 foram eficazmente esterilizado por irradiação gama. Infelizmente, esta prática reduz enormemente sua capacidade de formar géis, devido à fragmentação da proteína e desnaturação 9,10.
Este procedimento representa as condições ideais para extração COL1 conforme determinado a partir de muitos experimentos realizados para estabelecer a proporção ideal de amostra dérmica para buffer volume. A adição de mais tubos é sugerido quando o investigador pretende utilizar este procedimento para as amostras de pele maiores. Com base em nossa experiência, não é aconselhável adicionar mais de amostra ou tampão do que o indicado para cada tubo. É também interessante notar que os grânulos constituídos por sílica, cerâmica, granada, óxido de alumínio, carboneto de silício ou óxido de zircónio, os quais são vulgarmente utilizados em conjunto com bench-top homogeneizadores, são omitidos do nosso procedimento. Os 6 ciclos sequenciais 1 min de agitação descritos no passo 3.3 são necessárias devido a uma limitação imposta por nosso equipamento de agitação. Podemos apenas agitar a amostra para um total de 60 seg de cada vez, após o que a máquina requer uma paragem. Se alguém tem o equipamento que pode ser definido por 6 min em linha reta, ele provavelmente seria bom para mudar para um, ciclo de seis minutos. Temos, no entanto, sugerem observância rigorosa dos volumes de peso e tampão de amostra descritos.
Temos achado que este método de preparação isola eficientemente COL1 solúvel de cordeiro, coelho e amostras dérmicos humanos 8. Por outro lado, este protocolo não foi bem sucedida em purificando COL1 de amostras de pele de suíno. Mesmo com extensas modificações no método, derme porcina produzido uma quantidade exorbitante de espuma por causa de lipídios residuais e gordura, resultando em extração COL1 ineficiente. Inversamente, COL1 pode ser purificada a partir de caudas de ratos inteirosou isolado tendões da cauda de ratos usando uma preparação ligeiramente modificado que inclui lise pérolas da matriz. Isto foi anteriormente descrito em detalhe 8.
Para os cientistas de pesquisa, os usos potenciais do produto COL1 solubilizado com ácido final obtida utilizando este método incluem: a) proporcionar um substrato adesivo para placas de cultura para suportar a ligação e a proliferação celular, b) de micro-modelação de superfícies de 2 - ou 3 - dimensional (2 - ou 3-D) de cultura de células, e c) criação de andaimes em 3-D para aplicações de engenharia de tecidos. Embora uma pequena quantidade de variabilidade de lote para lote é de se esperar a partir de qualquer método de purificação, descobrimos que estas preparações COL1 líquidos são consistentemente capaz de ser combinada com várias populações de células e fundido em moldes. Após a neutralização, o pH e o aquecimento, o resultado é um tecido de engenharia solidificada construir com células orientados espacialmente distribuídos uniformemente por toda a matriz. Dependendo da forma domolde, essas construções podem ser feitas em praticamente qualquer forma e tamanho 3,4,11-14.
Em resumo, é nossa opinião que a razão mais atraente para utilizar este método é que ele reduz drasticamente o tempo eo esforço necessários para isolar altamente pura, COL1 solúvel a partir de uma fonte de tecido autólogo, como pequenas biópsias de pele. O método baseia-se em procedimentos de longa data e produz um produto que cumpre ou excede a qualidade das preparações comerciais caros no que diz respeito à pureza COL1 e a capacidade de formar tecidos estáveis em 3-D. Ao mesmo tempo, este método simplificado permite o isolamento rápido e eficiente de COL1 autologously derivados que pode ser usado com segurança para uma variedade de aplicações clínicas.
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Disclosures
Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de investigação dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915 para DBC), uma nova Researcher Award do Fundo de Investigação Thrasher (a PAC), um Grant-in-Aid da American Heart Association (12GRNT11910008 para DBC) , uma bolsa de investigação da Fundação das Crianças do Coração (para DBC) e doações para Hospital Cardiológico Fundo das Crianças de Boston Condução, a família de Ryan Endowment, e por David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
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