Summary
Los procedimientos tradicionales para el aislamiento de tipo soluble 1 colágeno (COL1) requieren unos 10 días a partir de principio a fin, a causa de largas incubaciones de amortiguación y resuspensiones laboriosas de fibrillas. A continuación, describimos un medio para purificar COL1 de pequeñas biopsias dérmicas en menos de 3 horas.
Abstract
Tipo soluble 1 de colágeno (COL1) se utiliza ampliamente como un sustrato adhesivo para cultivos de células y como un andamiaje celular para aplicaciones regenerativas. Clínicamente, esta proteína es ampliamente utilizado para la cirugía estética, inyecciones dérmicas, injerto de hueso, y la cirugía reconstructiva. Las fuentes de COL1 para estos procedimientos son comúnmente no humano, lo que aumenta el potencial para la inflamación y el rechazo, así como la transmisión de enfermedades de xenobióticos. En vista de esto, un método para purificar de manera eficiente y rápidamente COL1 a partir de cantidades limitadas de tejidos derivados autóloga-sería eludir muchos de estos problemas, sin embargo, los protocolos estándar de aislamiento son largos y requieren a menudo grandes cantidades de tejidos de colágeno. Aquí, se demuestra un método de extracción COL1 eficiente que reduce el tiempo necesario para aislar y purificar esta proteína de aproximadamente 10 días a menos de 3 horas. Elegimos la dermis como nuestra fuente de tejido debido a su disponibilidad durante muchos procedimientos quirúrgicos. Tsu método utiliza buffers de extracción tradicionales combinados con agitación enérgica y filtración centrífuga para obtener alta pureza, COL1 soluble de pequeñas cantidades de corion. En pocas palabras, las biopsias dérmicas se lavan a fondo en DH helada 2 O después de la eliminación de grasa, tejido conectivo, y el cabello. Las muestras de piel se eliminan de las proteínas y los polisacáridos no colágenas utilizando 0,5 M de acetato de sodio y un homogenizador de alta velocidad de sobremesa. El colágeno de sólidos residuales se extrae posteriormente con un tampón de citrato de sodio 0,075 M usando el homogeneizador. Estos extractos se purificaron usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que producen preparaciones COL1 de calidad comparable o superior a los productos comerciales o los obtenidos utilizando procedimientos tradicionales. Anticipamos este método facilitará la utilización de derivados de forma autóloga-COL1 para una multitud de aplicaciones de investigación y clínicos.
Introduction
Durante décadas, los investigadores y los proveedores comerciales han aislado solubilizado COL1 de una variedad de fuentes de tejidos incluyendo la piel y tendón utilizando alguna variación de un protocolo de extracción de ácido sencillo seguido de neutralización, lo que resulta en una resuspensión de una matriz de fibrillas COL1 organizadas que se puede utilizar para una multitud de aplicaciones biomédicas 1-4. Si bien hay muchos ejemplos de aplicaciones clínicas para COL1, algunas de ellas emplean COL1 derivada autóloga, porque la preparación de esta proteína requiere largas extracciones de tomar días o semanas para llevar a cabo 5-7. Como resultado, los investigadores de investigación y médicos generalmente usan preparaciones comerciales caros, de COL1 que se preparan utilizando tejidos no humanos, tales como la rata, bovino, porcino o corion o usando eliminado a partir de cadáveres de la piel o después de la circuncisión masculina. Para aplicaciones regenerativas, muchos de estos productos exhiben variabilidad con respecto a su capacidad para formar sólidamatrices o construcciones de tejido capaces de apoyar la unión de células y el crecimiento. En consecuencia, existe una clara necesidad de un nuevo método estandarizado diseñado para extraer rápidamente COL1 partir de fuentes de tejido autólogo accesibles y abundantes.
Tal método podría ahorrar tiempo y dinero en el marco de la investigación donde COL1 podría extraerse del modelo animal de interés y se utiliza para los ensayos preclínicos de la ingeniería de tejidos montados en andamios a base de colágeno. Al mismo tiempo, tener la opción de utilizar un-aislado rápidamente, COL1 derivada autóloga-en la clínica aumentaría la seguridad general para los pacientes que de otro modo recibir alogénicas o xenogénicas preparaciones. Para los pacientes que reciben una preparación autógeno, este método simplificado reduciría enormemente el intervalo entre la toma de biopsias y la aplicación de colágeno. Por estas razones, hemos tratado de mejorar en un aislamiento y purificación método COL1 de larga data con ag de alta velocidadbilitación y la centrifugación de exclusión por tamaño. Este método es fácil de realizar utilizando tampones estándar y los equipos que se encuentran en muchos laboratorios. Mediante el empleo de la agitación de alta velocidad, nuestro protocolo reduce el tiempo necesario para aislar solubles, dérmica COL1 de aproximadamente 10 días a menos de 3 horas 8. Es importante destacar que este método se puede realizar fácilmente en el entorno clínico a fin de preparar COL1 derivada autóloga para su uso en pacientes durante un único conjunto de procedimientos.
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Protocol
Aquí vamos a demostrar el aislamiento de COL1 de la piel de cordero. Como está escrito, este protocolo también se puede utilizar para aislar con éxito COL1 de conejo y de la piel humana.
1. Preparar la muestra dérmica
- Que todos los reactivos a 4 ° C antes de su uso.
- Enjuagar la muestra dérmica (25-50 g) en DH helada 2 O y eliminar cualquier lana, piel o cabello con crema depilatoria.
- Utilice una hoja de afeitar de un solo filo para raspar la limpieza de la muestra de tejido conectivo y grasa.
- Enjuagar la muestra en helada dH 2 O.
- Cortar la muestra de piel en 1 cm x 1 cm pedazos con una cuchilla de afeitar de un solo filo.
2. Retire colagenosas solubilizado material
- Pesar 5 g de tubo cónico de la muestra por 50 ml y añadir 30 ml de acetato de sodio helado 0,5 M.
- Mezclar los tubos durante 1 min a la configuración de 6 m / seg usando un adaptador de tubo de 50 ml en el homogeneizador de sobremesa.
- Deseche supernatant y repita para un total de 7 ciclos de lavado de sodio acetato.
- Enjuagar la muestra en dH helada 2 O y mezclar una vez para eliminar el acetato de sodio residual.
- Utilice una espátula para comprimir la muestra contra el lado del tubo para eliminar el exceso de líquido y luego se transfieren a un tubo cónico de 50 ml fresco.
3. Colágeno tipo I Extracción
- Lavar la muestra dos veces en 2 ml / g 0,075 M de tampón de citrato de sodio durante 1 min a 6 m / seg en el homogeneizador de sobremesa compresión de la muestra y de desechar el sobrenadante después de cada lavado.
- Añadir un nuevo 2 ml / g de parte alícuota de tampón de citrato de sodio 0,075 M a la muestra.
- Realizar 6 secuencial 1 min, 6 m / seg ciclos de sobremesa mezcla homogeneizador de agitación sin quitar el tapón entre cada ciclo.
- Transferir el grueso, claro sobrenadante a un tubo de colección.
- Añadir un tampón citrato adicional de 1 ml / g de sodio 0,075 M a la muestra y realizar un homogeneizador última agitación de sobremesaciclo ción.
- Añadir este último sobrenadante a un tubo de recogida.
- Centrifugar el tubo de recogida a 3200 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a el compartimiento de la parte superior de un peso molecular 100.000 cortar dispositivo de filtro centrífugo.
- Se centrifuga a 3.200 g durante 30 min a 4 ° C.
- Transferir el purificada COL1 del compartimiento superior a un tubo cónico limpia y se almacenan a 4 ° C.
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Representative Results
Este protocolo de aislamiento COL1 requiere alrededor de 2 horas y 15 minutos en completarse. La figura 1 muestra un diagrama esquemático delineando los principales pasos de este procedimiento. Preparación de la muestra y la realización de los 7 ciclos de agitaciones de alta velocidad y se enjuaga con acetato de sodio tarda aproximadamente 35 minutos (las figuras 1A-C). Realización de una agitación y enjuague ciclo con dH 2 O toma aproximadamente 5 minutos (figuras 1D y 1E). La adición de citrato de sodio y someter la muestra a una agitación y enjuague ciclo seguido por 6 ciclos de agitación tarda aproximadamente 45 min (Figuras 1F y 1G). La centrifugación de los sólidos restantes del extracto líquido tarda 15 min (Figura 1H). Finalmente, la transferencia de la muestra a un dispositivo de filtro y de realizar otra etapa de centrifugación para concentrar el, COL1 solubilizada purificada y eliminar las proteínas pequeñastarda 30 min (Figuras 1I y 1J). El producto final es una preparación concentrada, de alta pureza de COL1 soluble que se puede polimerizar aún más mediante la adición de Na 2 HCO 3 e incubando a 37 ° C. Fase imágenes de microscopía de contraste de esta solidificaron producto revela fibrillas COL1 que podrían servir como un sustrato para la fijación de las células a placas de cultivo de tejidos o ser utilizado como un andamio para aplicaciones de ingeniería de tejidos 3-D (Figuras 2A y 2B).
Figura 1. Esquema general del método de aislamiento COL1 mejorado. A) la dermis en rodajas se añade a un tubo cónico de 50 ml. B) de acetato de sodio 0,5 M se añadió a la muestra. C) Lamuestra se somete a 7 ciclos de agitación con tampón de acetato de sodio reemplazados después de cada ciclo. D) dH2O se añade a la muestra de piel. E) La preparación se somete a 1 ciclo de agitación y dH2O se vierte fuera. F) 0,075 M de citrato de sodio se añade a la muestra. G) La muestra se somete a 6 ciclos de agitación. H) La muestra se centrifuga para eliminar los sólidos grandes. I) El sobrenadante se transfiere a un peso molecular 100.000 cortar unidad de filtro centrífugo en un tubo cónico. J) Esta unidad se centrifugó y el líquido viscoso que permanece en el compartimento superior se recoge.
Figura 2. Aislamiento rápido de aquí para allám dermis para producir COL1 polimeriza en fibrillas. Soluble COL1 se neutralizó añadiendo Na 2 HCO 3 y después se incubó a 37 ° C. Una imagen de contraste de fase (A) y la micrografía electrónica de transmisión (que muestra el d-banding conservado) (B) de las fibrillas COL1 generados usando nuestro método de aislamiento rápido. Las barras de escala = 10 micras y 500 nm (respectivamente). Haz click aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Un componente crucial de este método es la compresión eficiente repetida de la muestra dérmica para eliminar el exceso de líquido. Es crítico para eliminar el acetato de sodio tanto como sea posible en el paso 2.5 mediante la compresión de la muestra. Utilizamos una espátula para compactar la piel contra el lado del tubo, sin embargo, estopilla también podría ser utilizado, aunque esto requeriría la eliminación de la muestra desde el tubo y aumentar el tiempo necesario para llevar a cabo estos pasos. Asimismo, es importante para comprimir la muestra en el paso 3.1 de modo que el volumen de citrato de sodio es precisa en las etapas de extracción subsiguientes. Si no se retira adecuadamente el líquido de la muestra en cualquiera de estos pasos tendrá un efecto perjudicial sobre el rendimiento COL1 final. Otro componente clave de este protocolo es la de mantener todos los reactivos a 4 ° C. Esto garantiza la extracción eficaz de ácido COL1 solubilizado y evita la solidificación del colágeno. Además, el procedimiento podría llevarse a cabo utilizando todosreactivos estériles en un ambiente estéril. Esto sería de especial importancia para aquellos que deseen emplear este método para aislar COL1 para su uso en seres humanos. Muchas fuentes comerciales de COL1 se han esterilizado por irradiación gamma. Desafortunadamente, esta práctica reduce en gran medida su capacidad para formar geles debido a la fragmentación de proteínas y 9,10 desnaturalización.
Este procedimiento representa las condiciones óptimas para la extracción COL1 determinadas a partir de muchos experimentos llevados a cabo para establecer la proporción ideal de la muestra dérmica para amortiguar volumen. Se sugiere la adición de más tubos cuando el investigador desea emplear este procedimiento para las muestras de piel más grandes. Basándonos en nuestra experiencia, no es recomendable agregar más muestra o tampón de lo indicado para cada tubo. Es también digno de mención que las perlas compuestas de sílice,, granate, óxido de aluminio, carburo de silicio, óxido de circonio o de cerámica, que se utilizan comúnmente en conjunción con bench-top homogeneizadores, se omiten de nuestro procedimiento. Los 6 ciclos secuenciales 1 min de agitación se describen en el paso 3.3 son necesarios debido a una limitación impuesta por nuestro equipo de agitación. Sólo podemos agitar la muestra durante un total de 60 segundos a la vez, después de lo cual la máquina requiere una parada. Si uno tiene un equipo que se puede establecer para 6 min recta, probablemente sería bien de cambiar a uno, ciclo de seis minutos. Nosotros, sin embargo, sugerimos el cumplimiento estricto de los volúmenes de peso y de amortiguamiento de ejemplo descritas.
Hemos encontrado que este método de preparación aísla eficazmente COL1 soluble de cordero, conejo, y las muestras dérmicas humanas 8. Por otro lado, este protocolo no tuvo éxito en la purificación de COL1 a partir de muestras de piel porcina. Incluso con extensas modificaciones en el método, dermis porcina produjeron una cantidad exorbitante de espuma debido a los lípidos y grasas residuales resultantes de la extracción COL1 ineficiente. Por el contrario, COL1 puede purificarse a partir de colas de rata enteroso aislado de rata tendones de cola usando una preparación ligeramente modificada que incluye lisis perlas de matriz. Esto ha sido descrito anteriormente en detalle 8.
Para los científicos de investigación, los usos potenciales del producto COL1-ácido solubilizado final obtenido con este método son: a) proporcionar un sustrato adhesivo para placas de cultivo para apoyar la unión celular y la proliferación, b) micro-modelado de superficies para el 2 - o 3 - dimensiones (2 - o 3-D) de cultivo de células, y c) la creación de andamios 3-D para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Si bien una pequeña cantidad de la variabilidad de lote a lote es de esperar de cualquier método de purificación, se ha encontrado que estas preparaciones COL1 líquidos son consistentemente capaz de combinarse con diversos poblaciones de células y se moldea en moldes. Después de neutralizar el pH y el calentamiento, el resultado es una construcción de ingeniería tisular solidificado con células orientadas espacialmente distribuidos uniformemente por toda la matriz. Dependiendo de la forma de lamolde, estas construcciones se puede hacer en prácticamente cualquier forma y tamaño 3,4,11-14.
En resumen, es nuestra opinión que la razón más convincente para utilizar este método es que reduce drásticamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para aislar altamente puro, COL1 soluble de una fuente de tejido autólogo, como pequeñas biopsias de piel. El método se basa en procedimientos establecidos desde hace tiempo y produce un producto que cumple o excede la calidad de las preparaciones comerciales caros con respecto a la pureza COL1 y la capacidad para formar tejidos 3-D estables. Al mismo tiempo, este método simplificado permite el aislamiento eficaz y rápida de COL1 derivada autóloga-que puede ser utilizado con seguridad para una multitud de aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia a revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915 de DBC), un nuevo Premio Investigador del Fondo de Investigación Thrasher (NAC), una subvención-en-Ayudas a la American Heart Association (12GRNT11910008 a DBC) , una beca de investigación de la Fundación del Niño del corazón (a DBC), y las donaciones al Hospital de Fondo de Niños de Boston cardíaco de conducción, la Fundación Ryan Familia, y por David Pullman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FastPrep-24 System | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Centrifuge | Beckman | J6-MI | Swing bucket rotor to accommodate 50 ml conical tubes at 3,200 x g. |
References
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