Summary
Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.
Abstract
Vacinas são tipicamente injectado subcutaneamente ou intramuscularmente para estimulação de respostas imunes. O sucesso desta requer drenagem eficiente da vacina para os nódulos linfáticos onde as células apresentadoras de antigénio pode interagir com os linfócitos para a geração das respostas imunitárias desejadas. A força e o tipo de respostas imunitárias induzidas também depender da densidade ou da frequência de interacções bem como o microambiente, especialmente o teor de citocinas. Como apenas uma fração mínima de vacinas perifericamente injetados atinge os gânglios linfáticos, a vacinação de camundongos e humanos foram realizados por injecção directa da vacina em linfonodos inguinais, ou seja, injeção intralinfática. No homem, o procedimento é guiada por ultra-sons. Nos ratos, uma pequena (5-10 mm) incisão é feita na região inguinal de animais anestesiados, o nó de linfa é localizada e imobilizada com uma pinça, e um volume de 10-20 mL da vacina é injectada sob controle visual.A incisão é fechada com um único ponto com suturas cirúrgicas. Os ratinhos foram vacinados com ADN de plasmídeo, ARN, péptidos, proteínas, partículas, e bactérias, bem como adjuvantes, e foi observada forte melhoria da resposta imune contra todos os tipos de vacinas. O método intralinfática da vacinação é especialmente adequada em situações onde a vacinação convencional produz imunidade insuficientes ou quando a quantidade de vacina disponível é limitado.
Introduction
As vacinas são tipicamente injectados por via subcutânea ou intramuscular para a estimulação de respostas imunitárias. O sucesso deste procedimento requer a drenagem eficiente da vacina para os nódulos linfáticos onde as células apresentadoras de antigénio pode interagir com os linfócitos para a geração de t-e as respostas de células-B. Além disso, a força e o tipo de respostas imunitárias induzidas também depender da densidade ou da frequência de tais interacções, bem como o próprio microambiente, especialmente o teor de citocinas. Como apenas uma pequena fração de uma vacina injetada em um tecido periférico atinge um gânglio linfático, a vacinação de camundongos e humanos por injeção direta de vacina para os gânglios linfáticos, o site foram gerados respostas imunes, foram realizados. No homem, o procedimento é guiada por ultra-sons, um procedimento também utilizados para a administração de agentes de imagem para visualização de diagnóstico e do sistema linfático. Em ratinhos, o procedimento é invasivo. Aqui, uma pequena (5-10 mm) incision é feita na região inguinal de animais anestesiados 1, o nó de linfa é localizada e imobilizada com uma pinça, e um volume de 10-20 mL da vacina é injectada sob controlo visual, 10 ul é usado para as primeiras injecções e em ratos jovens com linfonodos pequenos, enquanto que 20 l pode ser injetado em linfonodos do mais velho ou camundongos já vacinadas, que têm nódulos linfáticos maiores. A incisão pode ser fechada com um único ponto com suturas cirúrgicas. Por este método, os ratos foram vacinados com plasmídeo de DNA de 2,3, o RNA mensageiro 4, 1,3,5,6 péptido, proteína 7-10, as partículas 11, 12 bactérias, bem como adjuvantes de 7,13, e uma forte melhoria da imunitário respostas contra todos os tipos de vacinas têm sido observados. O método intralinfática da vacinação é especialmente adequada em situações onde a vacinação convencional produz imunidade insuficiente, ou quando a quantidade de vacina disponível é limitado ou very dispendioso. Em humanos, o método intralinfática de imunização foi aplicada a pacientes alérgicos 14,15 ou para pacientes com cancro 16-21. Embora a noção corrente de que o método é intralinfática é mais invasiva do que outros métodos de injectáveis, tais como injecções intramusculares e subcutâneas, a percepção da dor não é maior do que após a punção venosa de 15. Espera-se que a vacinação intralinfática vai se tornar uma alternativa ou complemento a outros métodos de vacinas profiláticas e terapêuticas, especialmente. Este artigo descreve em pormenor a forma como o processo de vacinação intralinfática é realizada em ratinhos. Todos os procedimentos descritos, foram aprovados pela Agência Veterinária Cantonal de Zurique e realizada de acordo com as diretrizes federais suíços e directivas relativas à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
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Protocol
1. Anestesia dos Ratos
- Prepare os anestésicos pela mistura de quetamina (anestésico dissociativo) e xilazina (sedativo e analgésico) em salina. As concentrações de cetamina e xilazina na solução final é de 12,5 e 2 mg / ml, respectivamente.
- Injectar os anestésicos para a ratinhos por via intraperitoneal usando uma seringa com uma agulha G 25-30. Use 0,1 ml/10 g de peso corporal.
- Aplique uma pomada oftálmica para os olhos dos ratos, a fim de evitar que resseque das córneas.
- Assegurar que o mouse é suficientemente anestesiados por beliscar o seu pé ou dedo do pé com a pinça. Se o rato não reage com reflexos para o aperto, proceder à cirurgia. Se o rato reage ao beliscão com reflexos ou contrações musculares, espere 1-2 minutos e repita o teste de pressão. Se o mouse ainda reage, substituir o mouse com um novo animal e repita os procedimentos a partir do passo 1.2 em diante.
2. Eu Surgicalncision da região inguinal do Rato
- Posicione o mouse sobre as suas costas.
- Molhar uma região inguinal com etanol desinfecção (70%). Para proporcionar uma melhor desinfecção, a região inguinal podem ser raspada para remover pele desinfecção prévia com etanol.
- Pegue a perna e dobrar a articulação do quadril para produzir um ângulo de aproximadamente 90 ° da articulação do quadril.
- Usando um fórceps curvos microdissecting, tirar a pele do rato na área inguinal, onde a articulação do quadril é dobrado e puxe a pele molhada ligeiramente.
- Enquanto mantém a pele com a pinça, corte uma pequena incisão (<5 mm) através da pele utilizando uma tesoura cirúrgica.
- Coloque a ponta da tesoura fechados na incisão e abrir ainda mais a incisão, abrindo a tesoura, mantendo-o dentro da incisão. Isto fará com que a pele se rasgar e deve produzir um diâmetro de menos de 10 mm. Nota: A fonte de luz fria, com guias de luz são flexíveis e podem ser utilizados para melhorar a visibilidade. Em mais velhosratinhos, especialmente do sexo masculino, a identificação do nó de linfa pode ser difícil devido à muito tecido adiposo na região inguinal.
3. Injeção intralinfática
- Prepara-se uma seringa (0,5 ml ou menos) com uma agulha hipodérmica de 28-30 G; bisel curto pode ser preferível a um bisel longo. Aspirar 10 mL da vacina a ser injectado e garantir que a seringa é livre de ar.
- Localizar o nó de linfa inguinal com a ajuda da pinça curvos e a ponta da tesoura fechada. O linfonodo aparecerá acinzentado dentro do tecido adiposo mais esbranquiçada e pode ser ainda identificados através de aferentes e eferentes capilares que entram e saem do linfonodo.
- Imobilizar o linfonodo, segurando-o entre os ramos das pinças curvas.
- Pegue na seringa e insira a agulha no nódulo linfático com o bisel virado para cima, certificando-se de todo o bisel entra no linfonodo.
- Injectar a vacina (10 ul). Se o aceno linfae é o inchaço (explodir), a injecção pode ser assumida de sucesso. Se a agulha não está colocada a uma profundidade suficiente para o linfonodo, alguns ou toda a vacina pode sair e não entrar no linfonodo. Se a agulha é inserida muito profundo, a vacina injetada será lançado via subcutânea abaixo do nó de linfa. Em caso deste último, repetir a injecção ou substituir o rato com uma nova rato não tratado.
4. Fechando a incisão com sutura
- Abrir um pacote de sutura cirúrgica estéril.
- Segure a agulha de sutura com um suporte de agulha na porção distal do corpo da agulha. Apertar o suporte de agulha, apertando-o até que as primeiras capturas de roquete.
- Segure a pele de um dos lados da incisão com a pinça (dependendo da preferência do cirurgião, dentada ou un-dentes fórceps ou ganchos na pele pode ser usado). Inserir a agulha de ca. 2-3 mm a partir da borda da incisão, que entra a partir do lado de fora da pele.
- Loosen preensão da pele com a pinça e agarrar o lado contrário ao da incisão com a pinça. Inserir a agulha de ca. 2-3 mm a partir da borda da incisão, que entra a partir do interior da pele.
- Soltar o suporte de agulha e agarrar a ponta da agulha com a pinça. Puxe a agulha com o piso através da pele, deixando um comprimento conveniente da banda de rodagem do lado de fora do primeiro ponto de agulha de inserção (se vários ratos estão a ser tratados, deixe uma extremidade mais curta; 5-10 camundongos pode ser operado com uma agulha de sutura / pisar).
- Fazer o nó preferido de acordo com protocolos padrão cirurgião. Um ponto é suficiente se a incisão não é maior do que 10 mm. Para incisões maiores, fazer um segundo ponto.
5. Tratamento Pós-operacional
- Posicione o mouse na gaiola e cubra com tecidos para manter aquecido. Ao tratar vários mouses, coloque-os próximos uns dos outros para se manter aquecido. Alternativamente, coloque os ratos em uma almofada quente até que tenham acordadopara cima.
- Observe os ratos até que eles acordam.
- Observe os ratos diariamente com relação à cicatrização de feridas, bem como outros sintomas clínicos, tais como infecções de feridas. A ferida é geralmente suficientemente fechado dentro de dois dias e curado dentro de sete dias do procedimento.
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Representative Results
O procedimento de injeções intralinfática em ratos, apesar da natureza cirúrgica, é direto e relativamente rápido. Uma pessoa treinada pode realizar o procedimento em 3-4 min. A incisão que é fechada com um ponto de cura normalmente dentro de dois dias (Figura 1)
Intralinfática vacinação ou imunização foi realizada com o ARNm, ADN plasmídeo, peptídeos, proteínas, vírus e bactérias. Figura 2 ilustra a produção de anticorpos após a imunização com a proteína a fosfolipase A2 (PLA2), o principal alergénio de veneno de abelha. Ratinhos CBA foram imunizados nos dias 0, 14, e 28 com 0,01, 0,1, ou 10 ug PLA2 adsorvido em hidróxido de alumínio por via subcutânea (sc) ou intralinfática (ILN) injecções. Os anticorpos específicos para a PLA2 (IgG2a) foram medidos no sangue após 8 semanas, e os resultados mostraram que o 0,01 ug PLA2 foi suficiente para estimular fortes respostas de anticorpos, enquanto que 10 ug de PLA2 foi necessária quando ucantar a via subcutânea 9.
Vacinação intralinfática também tem sido utilizado para estimular respostas de células T citotóxicas, por exemplo, o péptido gp33 (KAVYNFATM) da glicoproteína de LCMV, que se ligam a MHC-classe I, no contexto de H-2Db para a estimulação das células T CD8. Embora uma única injecção subcutânea de ratinhos com gp33 TCR318 desencadeada citotóxicos CD8 respostas de células T, o efeito era aprox. seis ordens de magnitude mais forte após a injecção intralinfática (Figura 3A); os ratinhos transgénicos TCR318 são para o receptor de células T CD8 específicas para gp33 1.
Funções de células T CD4 foram também testados num ensaio de desafio do tumor. Novamente ratinhos C57BL / 6 foram imunizados subcutaneamente ou intralymphatically com o péptido NP52 (SDLRGYVYQGLKSG) da nucleoproteína do VSV, que se ligam a MHC-classe II para a estimulação das células T CD4 +, e o péptido foi misturado com ODN de CpG 1826. Quando os ratos foram desafiados intravenosamente com NP52-expressando células tumorais EL4 singeneicas, os ratinhos desenvolveram linfoma sistémica (Figura 3B). Os ratos que foram imunizados pela via intralinfática mostraram tempos de sobrevivência mais longos (> 75 dias) do que os ratinhos imunizados por via subcutânea (<22 dias).
O método de imunização intralinfática também tem sido realizada no homem, especialmente para o tratamento de alergias, tais como a febre dos fenos. O método é conhecido atualmente como ILIT (Intra Linfática Immune Therapy). Em um estudo em 165 pacientes com febre do feno, 3 sessões Ilit mais de 2 meses com alérgenos de pólen de gramíneas foi igualmente eficiente como terapia convencional com 54 injeções subcutâneas de 3 anos 15. Além disso, a dose pode ser reduzida em mais de 1000 vezes. Da mesma forma, em um estudo em 20 pacientes com alergia a gatos pele, 3 sessões com administrados intralymphatically pele alérgenos de gatos foi suficiente para causar melhor tolerância à exposição alérgeno mais tarde 14.
jove_content "> Uma explicação da melhoria da eficácia da imunização intralinfática, em comparação com a imunização por via subcutânea pode ser ilustrada no homem. Usando uma proteína marcada com 99mTc radioactivos e como ilustrado na Figura 4, as injecções subcutâneas foram observados para drenar mal para os gânglios linfáticos, enquanto naturalmente fornecimento da injecção directa intralinfática todo o conteúdo da vacina para o sistema linfático, por isso, tornando-o disponível para as células do sistema imunológico e para a estimulação da resposta imune 22. Foram obtidos resultados semelhantes em ratinhos injectados com proteínas radioactivas 9.
Figura 1. Cura da ferida cirúrgica após a injeção intralinfática. Camundongos fêmeas BALB / c foram imunizados pela injeção intralinfática. O incis íon foi fechada com um único ponto de sutura. Dois dias mais tarde, no local da cirurgia e a injecção foram fotografados para a gestão da cicatrização de feridas.
Imunização Figura 2. Intralinfática com proteína para as respostas de anticorpos a estimulação. Ratinhos fêmea CBA foram imunizados nos dias 0, 14, e 28, com a dose indicada de proteína fosfolipase A2 adsorvido em hidróxido de alumínio. A vacina foi administrada por via subcutânea (sc) por injeção de 50 mL no cangote ou 10 ml em um linfonodo inguinal: o linfonodo esquerda nos dias 0 e 28 e do nó de linfa direito no dia 14.
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Imunização Figura 3. Intralinfática com péptido para a estimulação citotóxicos CD8 respostas de células-T. (A) ratinhos fêmea TCR318 foram injectados com o péptido gp33 no nódulo linfático inguinal (iln) ou subcutaneamente (SC) na pata traseira. Após 24 horas, os linfonodos de drenagem foram colhidas e analisadas para gp33 específicas atividade CTL em um (E / T) Relação célula effector/target- de 30:1. (B) Fêmea C57BL / 6 foram imunizados nos dias 0, 2 e 4, com 10 ug NP52 por via subcutânea (sc) ou intralinfática (iln) vias de administração. Os ratinhos foram então desafiados com uma célula de linfoma singeneico (EL-4) que expressa VSVnp52, e a sobrevivência dos ratinhos foi ilustrado com as curvas de Kaplan-Meyer.
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A administração da vacina Figura 4. Intralinfática em humanos. Administração da vacina intralinfática em humanos é feito através da atribuição de nódulos linfáticos subcutâneos com o auxílio de ultra-sons. A agulha hipodérmica é inserido no cortex do nódulo linfático, e a injecção pode ser controlada por meio de observação do linfonodo inchaço imediato na imagem de ultra-som. (A) A injeção intralinfática é guiada por ultra-som. (B) imagem de ultra-som mostrando agulha (linha reta esbranquiçada) inserido no cortex do linfonodo. (C) Biodistribution após a injeção de proteína marcada radioactivamente em um nó de linfa inguinal ("Injekt im LK"; anterior direita) e subcutânea ("Injekt subkutan"; anterior esquerda). No homem Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Imunização intralinfática e imunoterapia demonstraram ser apropriados para a estimulação de ambas as respostas de anticorpos e respostas de células-T. Como demonstrado neste vídeo-artigo, o procedimento de vacinação é intralinfática um método rápido e fácil para estimular fortes respostas imunitárias em ratinhos. Um cirurgião treinado pode realizar o procedimento durante 3-4 min. A sessão também pode ser compartilhada entre dois cirurgiões onde normalmente é fazer a anestesia ea sutura eo segundo cirurgião está fazendo a incisão ea injeção. A eficiência do processo é mais dependente do operador do que outro método de imunização, especialmente, se o cirurgião não é ainda bem treinado. No entanto, um operador experiente é capaz de reproduzir os resultados experimentais também quantitativamente como monitorizado por análise de imuno-resposta. Uma modificação do método é para injectar a vacina para o 1,2 baço. A preparação é semelhante ao da injecção intralinfática, mas the tamanho da incisão é geralmente maior e dois pontos são feitos para a fechar. As principais vantagens de tal imunização interna do baço são de que o baço é mais fácil de encontrar e de acertar do que um nó de linfa, maiores volumes de injeções e injeções mais freqüentes podem ser aplicados, e enquanto todos os danos de um linfonodo causada pela inserção de agulhas ou injeção envolveria uma grande área de nó de linfa, o dano do baço envolveria relativamente menos do órgão e ser mais de natureza local.
O procedimento de imunização intralinfática em ratinhos pode ser repetido (por exemplo, injecções de vacina de reforço) após um tempo de recuperação de 3-4 semanas antes da segunda injecção no mesmo nó de linfa é feito. Se as injecções mais frequentes são planeados, ambos os nódulos linfáticos inguinais, esquerda e direita deverá ser usado. Pelo menos duas injeções por linfonodo pode ser feita, mas são necessários mais estudos para definir essa limitação potencial de forma mais precisa. Futuras injecções pode ser difícil due a formação de cicatrizes, tanto no nódulo linfático e na pele, bem como a potencial formação de granulomas causada por adjuvantes. Por outro lado, a imunização irá causar inflamação transitória linfonodo, eo aumento do tamanho do linfonodo irá simplificar a localização e injeções subseqüente. Com efeito, a localização do nó de linfa é uma limitação importante do método. Enquanto ratos jovens (menos de 5 semanas) pode ter os gânglios linfáticos muito pequenas, mais velho e, especialmente, camundongos machos mais velhos podem ter tanta gordura subcutânea, que a localização é difícil. Condições ideais são obtidos com camundongos fêmeas de 6-12 semanas. Com efeito, uma das etapas mais críticas do processo consiste na injecção no próprio nó de linfa. Uma injeção para a área adjacente do nó será equivalente a uma injecção subcutânea, com muito mais fraco desencadeamento de respostas imunes do que após a injecção directa intralinfática. A razão é que a cápsula bastante sólido que rodeia o nó não é permeável a moléculas grandes.Para um antígeno para entrar em um nó de linfa, tem que drenar a linfa. Este percurso normalmente começa nos vasos linfáticos iniciais na pele, continua nas condutas maiores na camada mais profunda da pele, que drenam a linfa para a recolha de vasos no tecido subcutâneo, a partir de onde a linfa é accionado pelos movimentos peristálticos para o lado de drenagem linfonodos 23,24. O mais a jusante um antígeno é depositado ao longo deste caminho, a menos de que vai ter acesso ao linfa aferente.
O método de imunização intralinfática é particularmente interessante para a administração de antigénios que são fracamente imunogénicos quando administrados por métodos convencionais, tais como a via intramuscular ou subcutânea. Intralinfática vacinação foi realizada com o ARNm, ADN plasmídeo, peptídeos, proteínas, vírus e bactérias 22,25-27. Enquanto peptídeos e proteínas não têm adjuvantes em-construção, mRNA plasmídeo vírus e bactérias DNA exercer intrínseca effe adjuvantects, fornecendo sinais de perigo (replicando vírus e bactérias) ou por estimulação dos receptores Toll-like (TLRs), que podem sentir patógenos associados padrões moleculares (PAMPs), como RNA de fita simples (TLR7 e TLR8), RNA fita dupla (TLR3), citosina metilada e não-guanina oligonucleotídicos clusters (TLR9), flaggelin bacteriana (TLR5), lipopolissacarídeo (TLR2 e 4) moléculas, bem como outros virais e bacterianas 28. Assim, especialmente do peptídeo e vacinas baseadas em proteínas beneficiaria da potenciação imunológica de injectar a vacina directamente no nódulo linfático. Com efeito, foi demonstrado que as respostas de células T e B-são aumentados depois intralinfática péptido e proteína de vacinação em ratinhos 1,8,9. Além disso, as vacinas genéticas, especialmente vacinas baseadas em mRNA, são muito instáveis razão pela qual eles certamente lucrar com um método de administração que permitiu tempos de passagem curtos em tecidos extracelulares. Com efeito, a vacinação com o antigénio intralinfática-brARN de codificação potente induziu imunidade profilática e terapêutica em modelos de tumor de rato 4. De igual modo, a administração de intralinfática adjuvantes tais como CpG permitiu uma redução da toxicidade devido à dose mais baixa necessária, e um aumento do efeito adjuvante foi observado, devido ao efeito directo e não diluída sobre as células do sistema imunológico 13. Além disso, o desempenho de outros adjuvantes ou os sistemas de entrega de antigénio, tais como polímeros nano-e micropartículas, bem como os lipossomas pode ser melhorada pela administração intralinfática 11. Outra grande vantagem de intralinfática sobre vias de vacinação convencionais é que doses muito mais baixas são normalmente necessários. Para as proteínas e para a estimulação de respostas de anticorpos, a dose pode ser reduzida de 100-1.000 vezes 9, enquanto que a dose de ADN para a estimulação de citotóxicos CD8 respostas de células T pode ser reduzido com aprox. 10.000 vezes 2.
Em contraste com antígenos subunidade ou vacinas mortas, vir vivernormalmente não são esperados al e vacinas bacterianas para beneficiar as administrações intralinfática. A razão para isso é, em parte, que vivem normalmente micróbios escorrer bem para os gânglios linfáticos, sem qualquer adjuvante ajuda. Além disso, os micróbios infecciosos podem lidar com os efeitos de diluição antígeno em tecidos periféricos pela replicação. Assim, a dose de antigénio atingindo o sistema linfático secundário será normalmente suficiente para gerar imunidade. No entanto, quando as vacinas vivas existentes estão a produzir imunidade insuficiente, a administração intralinfática poderia fornecer a necessária correcção para fazer a vacina eficaz. Recentemente, foi demonstrado que a imunidade após a vacinação com a vacina contra a tuberculose atualmente disponível apenas M. bovis BCG poderia ser melhorada significativamente pela injecção directa da BCG nos nódulos linfáticos inguinais de ratos 12. Administração intralinfática também permitiu uma redução da quantidade inoculada de BCG por 100-1.000 vezes em comparação a administração subcutâneatração. Isto representa uma vantagem da segurança da vacina intralinfática, especialmente em pessoas imunocomprometidos.
Imunização intralinfática e imunoterapia em humanos até agora tem sido aplicada a pacientes com câncer e pacientes alérgicos. O método em humanos é não-invasivo, mas os melhores resultados e controle de qualidade é obtido usando o ultra-som para guiar a injeção, o que pode limitar a aplicação aos hospitais ou unidades de cuidados maiores. Em estudos de câncer, a vacinação prime-boost com DNA plasmídeo e peptídeo para o tratamento do melanoma metastático revelou imunogenicidade e evidência de controle da doença em uma população de pacientes definidos 29. Também vacinação autólogo intralinfática com células dendríticas foi realizado em pacientes com câncer. Enquanto alguns ensaios reforçada respostas imunes 30,31, outros estudos não conseguiram demonstrar o benefício das administrações intralinfática 32,33. O procedimento de administração intralinfática provou ser especialmente beneficamente na imunoterapia de pacientes com alergia. Ao mudar para o método intralinfática, o número de injeções de imunoterapia completa e bem sucedida poderia ser reduzido em cerca de 50 injeções subcutâneas mais de 3 anos para apenas 3 injecções durante dois meses 14,15. Uma vez que ambos os números de injecção de doses pode ser fortemente reduzida, fazendo-imunoterapia específica intralinfática, e uma vez que os nódulos linfáticos não contêm mastócitos libertador de histamina, os métodos representa um benefício de segurança, e com o tempo de tratamento curto, a adesão do paciente é melhorada. Ao longo dos próximos anos, a alergia é talvez a indicação de que iria vê benefício mais imediato deste novo método de vacinação e imunoterapia.
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Disclosures
TMK é apontado como inventor de patentes relacionadas com a imunoterapia intralinfática no homem. TMK foi consultor científico e recebeu as despesas de viagem de ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, MannKind Corporation, e XBiotech EUA Inc. PJ não tem interesse conflito de divulgar.
Acknowledgments
Os autores são gratos pela ajuda experimental no desenvolvimento do método de imunização em camundongos intralinfática de Iris Erdmann, Barbara von Beust, e Julia Maria Martínez-Gómez. Obrigado também a Maggy Arras e Nikola Cesarovic por nos deixar usar seu teatro cirúrgico para esta produção de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Ketasol-100) | Graeub AG, Switzerland | Anesthetics | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer, Germany | Anesthetics | |
| Viscotears Eye-Gel | Novartis, Switzerland | To keep eyes from drying out during anesthesia. | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml | BD Medical, France | 29 G Insulin syringes with permanently attached needles | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue) | |
| Curved forceps, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision and holding of lymph node | |
| Straight surgical scissors, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision | |
| Needle holder, 5.5 in | Polymed, Switzerland | To close incision with suture |
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