Summary
חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.
Abstract
חיסונים בדרך כלל מוזרקים מתחת לעור או לשריר לגירוי של תגובות חיסון. ההצלחה של זה דורשת ניקוז יעיל של חיסון לבלוטות הלימפה שבו תאי המציגים אנטיגנים יכולים לקיים אינטראקציה עם לימפוציטים לדור של התגובות החיסונית רצתה. הכוח והסוג של תגובה החיסונית המושרית תלוי גם בצפיפות או התדירות של אינטראקציות, כמו גם את המיקרו, במיוחד התוכן של ציטוקינים. כמו שרק שבריר זעיר של חיסונים מוזרקים שולי מגיע לבלוטות הלימפה, חיסונים של עכברים ובני אדם שבוצעו על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות לימפה מפשעתי, כלומר הזרקת intralymphatic. באדם, ההליך מונחה על ידי אולטרסאונד. בעכברים, חתך קטן (5-10 מ"מ) הוא עשה באזור המפשעה של חיות מורדמות, הבלוטות לימפה היא מקומיות ומשותקת עם מלקחיים, ונפח של 10-20 μl של החיסון מוזרק תחת שליטה חזותית.החתך נסגר עם תפר אחד באמצעות תפרים כירורגית. עכברים שחוסנו עם פלסמיד דנ"א, רנ"א, פפטיד, חלבון, חלקיקים, חיידקים, כמו גם אדג'ובנטים, ושיפור חזק של תגובות חיסוניים נגד כל הסוג של חיסונים נצפה. שיטת intralymphatic של החיסון מתאימה במיוחד במצבים שבם חיסון קונבנציונלי מייצר חסינות בלתי מספיקה או שבו הסכום של חיסון זמין מוגבל.
Introduction
חיסונים בדרך כלל מוזרקים מתחת לעור או לשריר לגירוי של מערכת החיסונית. ההצלחה של הליך זה דורשת ניקוז יעיל של חיסון לבלוטות הלימפה שבו תאי המציגים אנטיגנים יכולים לקיים אינטראקציה עם לימפוציטים לדור של T-ותגובות B-cell. בנוסף, הכוח והסוג של תגובה החיסונית המושרית תלוי גם בצפיפות או התדירות של אינטראקציות כאלה, כמו גם את המיקרו עצמו, במיוחד את התוכן של ציטוקינים. כחלק קטן בלבד של חיסון המוזרק לרקמה היקפית מגיע לבלוטות לימפה, חיסונים של עכברים ובני אדם על ידי הזרקה ישירה של החיסון לבלוטות הלימפה, האתר היו תגובה חיסונית נוצרות, כבר בוצע. באדם, ההליך מונחה על ידי אולטרסאונד, הליך משמש גם לניהול סוכני הדמיה להדמיה ואבחון במערכת הלימפה. בעכברים, ההליך הוא פולשני. כאן, incisio קטן (5-10 מ"מ)n מורכב באזור המפשעה של חיות הרדים 1, הבלוטות לימפה היא מקומית ומשותק עם מלקחיים, ונפח של 10-20 μl של החיסון מוזרק תחת שליטה חזותית; 10 μl משמש לזריקות הראשונות ובעכברים צעירים עם בלוטות לימפה קטנות, בעוד שניתן להזריק 20 μl לבלוטות הלימפה של מבוגר או עכברים כבר דרוכים, שיש לי בלוטות לימפה גדולות יותר. החתך יכול להיות סגור עם תפר אחד באמצעות תפרים כירורגית. לפי שיטה זו, עכברים שחוסנו עם פלסמיד דנ"א 2,3, RNA שליח 4, פפטיד 1,3,5,6, חלבון 7-10, חלקיקי 11, חיידקי 12 כמו גם אדג'ובנטים 7,13, ושיפור חזק של חיסון תגובות נגד כל הסוג של חיסונים כבר נצפו. שיטת intralymphatic של החיסון מתאימה במיוחד במקרים בהם חיסון קונבנציונלי מייצר חסינות בלתי מספיקה או שבו הסכום של חיסון זמין הוא מוגבל או very יקר. באדם, בשיטת intralymphatic של חיסון הוחל חולי אלרגיה 14,15 או לחולים עם הסרטן 16-21. למרות שהרעיון הנוכחי הוא ששיטת intralymphatic היא יותר פולשניים יותר מאשר בשיטות אחרות, כגון זריקות זריקות תוך שרירית ותת עורית, לתפיסת הכאב היא לא גבוהה יותר מאשר לאחר ניקור ורידי 15. צפוי כי חיסון intralymphatic יהפוך חלופי או משלימים לשיטות אחרות של חיסונים מניעתי וטיפוליים במיוחד. מאמר זה מתאר בפרטים כיצד ההליך של חיסון intralymphatic מבוצע בעכברים. כל ההליכים שתוארו, אושרו על ידי וטרינרית סוכנות Cantonal ציריך ומבוצעים על פי הנחיות פדרליות שוויצריים והנחיות על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בהרדמה של עכברים
- הכן את חומרי ההרדמה על ידי ערבוב של קטמין (הרדמה דיסוציאטיבית) וxylazine (הרגעה ושיכוך כאבים) שבנאגר מלוח. הריכוזים של קטמין ו xylazine בפתרון הסופי הם 12.5 ו2 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה.
- להזריק חומרי ההרדמה לעכברים על ידי ממשל intraperitoneal באמצעות מזרק עם מחט G 25-30. השתמש 0.1 ml/10 גרם של משקל גוף.
- החל משחת עיניים לעיניים של העכברים על מנת למנוע התייבשות של הקרניות.
- מבטיח שהעכבר הוא הרדים מספיק על ידי צובט את הרגל או הבוהן שלה עם המלקחיים. אם העכבר אינו מגיב עם רפלקסים לקורט, המשך לניתוח. אם העכבר מגיב לצביטה עם רפלקסים או התכווצויות שרירים, חכה 1-2 דקות ולחזור על בדיקת הצביטה. אם העכבר עדיין מגיב, להחליף את העכבר עם בעלי חיים חדשים ולחזור על ההליכים מהשלב 1.2 ואילך.
2. אני כירורגיncision של אזור מפשעתי של העכבר
- מניחים את העכבר על הגב שלה.
- הרטב אזור אחד מפשעתי עם אתנול חיטוי (70%). כדי לספק חיטוי טוב יותר, באזור המפשעה עשוי להיות מגולח כדי להסיר חיטוי לפני פרווה עם אתנול.
- קח את רגלו האחורית ולכופף את מפרק הירך כדי לייצר זווית כ 90 ° של מפרק הירך.
- בעזרת מלקחיים microdissecting מעוקלים, לקחת את העור של העכבר באזור המפשעה שבו מפרק הירך הוא כפוף ולמשוך את העור הרטוב מעט.
- בעוד מחזיק את העור עם המלקחיים, לחתוך חתך קטן (<5 מ"מ) דרך העור באמצעות מספריים כירורגיות.
- הנח את הקצה של המספריים הסגורים לתוך החתך ועוד יותר לפתוח את החתך על ידי פתיחת המספריים כשהוא אוחז אותו בתוך החתך. זה יגרום לעור לקרוע וצריך לייצר בקוטר של פחות מ -10 מ"מ. הערה: מקור אור קר עם מדריכי אור גמישים יכול לשמש כדי לשפר את הנראות. במבוגרעכברים, בעיקר זכרים, זיהוי של הבלוטות לימפה עלול להיות קשה בשל הרבה יותר רקמת שומן באזור המפשעה.
3. הזרקת Intralymphatic
- הכן את מזרק (0.5 מיליליטר או פחות) עם מחט מזרק G 28-30; פוע קצר עשוי להיות עדיף לפוע ארוך. לשאוב 10 μl של החיסון להיות מוזרק ולהבטיח שהמזרק הוא חופשי של אוויר.
- למקם את הצומת לימפה מפשעתי עם עזרה של המלקחיים המעוקלים והקצה של המספריים הסגורים. הבלוטות לימפה תופיע אפרפרות בתוך רקמת השומן לבנבן יותר וניתן לזהות עוד דרך נימים מביא efferent וכניסה וביציאה לימפה.
- לשתק את הבלוטות לימפה על ידי מחזיק אותו בין זרועות המלקחיים המעוקלים.
- קח את המזרק ולהכניס את המחט לתוך הבלוטה לימפה עם השיפוע כלפי מעלה; מוודא השלם שפוע נכנס לימפה.
- להזריק את החיסון (10 μl). אם ההנהון לימפהדואר הוא נפיחות (פיצוץ), ההזרקה ניתן להניח מוצלחת. אם המחט אינה ממוקמת עמוק מספיק לבלוטות לימפה, כל החיסון מסוים או עלול לדלוף החוצה ולא להיכנס לימפה. אם המחט מוחדרת עמוקה מדי, החיסון המוזרק ישוחרר תת עורי מתחת לימפה. במקרה של האחרון, לחזור על ההזרקה או להחליף את העכבר עם עכבר מטופל חדש.
4. סגירת החתך על ידי תפירה
- פתח חפיסת תפר כירורגי סטרילי.
- לאחוז במחט התפר עם בעל מחט בחלק הדיסטלי של גוף המחט. הדק את בעל המחט באמצעות אחיזתו עד שתופס את מחגר הראשון.
- לאחוז בעור בצד אחד של החתך באמצעות מלקחיים (בהתאם להעדפותיו של המנתח, שיניים או בלתי שיני מלקחיים או ווי עור עשוי לשמש). הכנס את ca המחט. 2-3 מ"מ מהקצה של החתך, שנכנס מהצד החיצוני של העור.
- לוסen האחיזה של העור עם המלקחיים ולהבין את הצד השני של החתך עם המלקחיים. הכנס את ca המחט. 2-3 מ"מ מהקצה של החתך, שנכנס מהפנימי של העור.
- שחרר את בעל המחט ולתפוס את קצה מחט עם המלקחיים. משוך את המחט עם לדרוך דרך העור, משאיר את אורך נוח של לדרוך מחוץ לנקודת מחט ההכנסה הראשונה (אם כמה עכברים יטופלו, להשאיר סוף קצר יותר; 5-10 עכברים יכולים להיות מופעלים על עם מחט תפר אחד / לדרוך).
- הפוך את הקשר המועדף על פי פרוטוקולי מנתח סטנדרטיים. תפר אחד די אם החתך אינו גדול מ10 מ"מ. לחתכים גדולים יותר, להפוך את התפר שני.
5. טיפול שלאחר תפעולי
- מניחים את העכבר בכלוב ולכסות עם רקמות כדי להתחמם. כאשר מטפלים עכברים מרובים, למקם אותם קרוב אחד לשני כדי להתחמם. לחלופין, למקם את העכברים על משטח חם עד שהם התעוררועד.
- שים לב לעכברים עד שהם מתעוררים.
- שים לב לעכברים יומיים בכל הקשור לריפוי פצע, כמו גם סימפטומים קליניים אחרים, כגון זיהומים בפצע. הפצע הוא בדרך כלל סגור במידה מספקת בתוך יומיים ורפאו בתוך שבעה ימים של ההליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך של זריקות intralymphatic בעכברים, למרות האופי כירורגית, הוא ישר קדימה ומהיר יחסית. אדם מאומן יכול לבצע את ההליך ב3-4 דקות. החתך שנסגר עם תפר אחד בדרך כלל מרפא בתוך יומיים (איור 1)
חיסון או חיסון Intralymphatic שבוצע עם ה-mRNA, ה-DNA פלסמיד, פפטידים, חלבונים, וירוסים וחיידקים. איור 2 ממחיש את ייצור הנוגדנים לאחר חיסון עם החלבון A2 פוספוליפאז (PLA2), אלרגן ארס דבורה הגדול. עכברי CBA היו שחוסנו בימים 0, 14, ו28 עם 0.01, 0.1, או 10 מיקרוגרם PLA2 adsorbed על אלומיניום הידרוקסיד על ידי תת עורית (SC) או זריקות intralymphatic (iln). נוגדני PLA2 ספציפי (IgG2a) נמדדו בדם לאחר 8 שבועות, והתוצאות הראה כי 0.01 מיקרוגרם PLA2 הייתה מספיק כדי לעורר תגובת נוגדנים חזקה, בזמן שהיה נדרש 10 מיקרוגרם PLA2 כאשר Uלשיר את המסלול תת עורית 9.
חיסון Intralymphatic שימש גם כדי לעורר תגובות תא T ציטוטוקסיים, למשל gp33 פפטיד (KAVYNFATM) מגליקופרוטאין LCMV, המחייב MHC-ברמה שאני בהקשר של H-2DB לגירוי של תאי CD8 T. בעוד הזרקה תת עורית בודדת של עכברי TCR318 עם gp33 גררה תגובות תא T ציטוטוקסי CD8, ההשפעה הייתה כ. שישה סדרי גודל חזק יותר לאחר הזרקת intralymphatic (איור 3 א); עכברי TCR318 הם מהונדסים לקולטן תא T CD8 הספציפי לgp33 1.
פונקציות מסוג CD4 T-cell נבדקו גם בassay אתגר גידול. שוב C57BL / 6 עכברים שחוסנו מתחת לעור או intralymphatically עם np52 פפטיד (SDLRGYVYQGLKSG) מnucleoprotein VSV, המחייב MHC-ברמה השנייה לגירוי של תאי T מסוג CD4, ופפטיד היה מעורב עם ODN CPG 1826. כאשר העכברים היו תיגר הווריד עם np52-להביע תאים סרטניים EL4 syngeneic, העכברים פיתחו לימפומה המערכתית (איור 3 ב). עכברים שחוסנו על ידי תוואי intralymphatic הראו פעמים הרבה יותר זמן הישרדות (> 75 ימים) מאשר עכברים שחוסנו על ידי תוואי תת עורית (<22 ימים).
השיטה של חיסון intralymphatic גם שבוצעה בגבר, במיוחד לטיפול באלרגיות כגון קדחת שחת. השיטה ידועה כיום כעילי (Intra הלימפה חיסון תרפיה). במחקר אחד על 165 חולים עם קדחת שחת, 3 מפגשים עיליים מעל 2 חודשים עם אלרגנים אבקת הדשא היו לא פחות יעילים כמו טיפול קונבנציונלי עם 54 זריקות תת עורית על פני 3 שנים 15. יתר על כן, המינון יכול להיות מופחת על ידי יותר מ -1,000 פי. באופן דומה, במחקר על 20 חולים עם אלרגיה לפרוות חתול, 3 מפגשים עם האלרגן פרוות חתול מנוהל intralymphatically היה מספיק כדי לגרום לסובלנות משופרת לחשיפה לאלרגן לאחר מכן 14.
jove_content "> אחד הסברים ליעילות המשופרת של חיסון intralymphatic בהשוואה לחיסון תת עורי יכולים להיות מתוארים באדם. שימוש בחלבון שכותרתו עם 99mTc רדיואקטיביים וכפי שמודגם באיור 4, זריקות תת עורית נצפו לניקוז גרוע לבלוטות הלימפה בזמן כמובן משלוח הזרקת intralymphatic ישיר כל תוכן החיסון למערכת הלימפה, ולכן, מה שהופך אותו לזמין לתאי מערכת החיסון ולגירוי תגובה חיסונית 22. תוצאות דומות התקבלו בעכברים שהוזרקו עם חלבונים רדיואקטיביים 9.
איור 1. ריפוי של פצע ניתוח לאחר הזרקת intralymphatic. עכברי נקבה BALB / ג היו שחוסנו בזריקת intralymphatic. Incis יון נסגר עם תפר תפר אחד. יומיים לאחר מכן, באתר של ניתוח והזרקה הצטלמו לניהול של ריפוי הפצע.
איור 2. חיסון Intralymphatic עם חלבון לתגובות נוגדן גירוי. נקבות עכברי CBA היו שחוסנו בימים 0, 14, ו28 עם המינון המצוין חלבון A2 פוספוליפאז adsorbed על אלומיניום הידרוקסיד של. החיסון היה מנוהל תת עורי (sc) על ידי הזרקה של 50 μl בעורף או 10 μl בבלוטות לימפה מפשעתי: הצומת עזבה לימפה בימים 0 ו -28 ובלוטות לימפה תקין ביום 14.
"Src =" / files/ftp_upload/51031/51031fig3.jpg "/>
איור 3. חיסון Intralymphatic עם פפטיד לתגובות תא T ציטוטוקסי הגירוי CD8. () עכברי נקבה TCR318 הוזרקו פפטיד gp33 לצומת לימפה מפשעתי (iln) או תת עורית (SC) לתוך שודד האחורי. לאחר 24 שעות, בלוטות הלימפה לנקז נקצרו ונותחו לgp33-ספציפי פעילות CTL ביחס תא (E / T) effector/target- של 30:1. (ב) נקבה C57BL / 6 עכברים שחוסנו בימים 0, 2, ו -4 עם 10 מיקרוגרם np52 ידי תת עורית (SC) או intralymphatic (iln) מסלולים של ממשל. עכברים אז היו תיגר עם תא לימפומה syngeneic (EL-4) להביע VSVnp52, ואת ההישרדות של עכברים שהומחש עם עקומות קפלן-מאייר.
"/> Tp_upload/51031/51031fig4.jpg
איור 4. ממשל חיסון Intralymphatic בבני אדם. ממשל חיסון Intralymphatic בבני האדם נעשה על ידי הקצאת בלוטות לימפה תת עורי בעזרת אולטרסאונד. מחט hypodermal מוכנסת לתוך paracortex של הבלוטות לימפה, וההזרקה יכולה להיות נשלטה על ידי תצפית של בלוטות לימפה באופן מיידי נפיחות בתמונה אולטרסאונד. () הזרקת intralymphatic מונחה על ידי אולטרסאונד. (ב) תמונת אולטראסאונד מראה מחט (קו ישר לבנבן) מוכנס לתוך paracortex של הבלוטות לימפה. (C) Biodistribution לאחר ההזרקה של חלבון שכותרתו רדיואקטיבית לתוך צומת מפשעתי לימפה ("Injekt im LK"; קדמי מימין) ומתחת לעור ("subkutan Injekt"; קדמי משמאל). באדם לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיסונים וטיפול חיסוני Intralymphatic הוכחו כמתאימים לגירוי של שני תגובות נוגדנים ותגובות תאי T. כפי שמודגם במאמר וידאו זה, הליך intralymphatic של חיסון הוא שיטה מהירה וקלה להמרצת תגובה חיסונית חזקה בעכברים. מנתח מיומן יכול לבצע את ההליך ב3-4 דקות. המפגש יכול גם להיות משותף בין שני מנתחים שבו הוא בדרך כלל עושים הרדמה והתפירה והמנתח השני הוא עושה חתך וההזרקה. היעילות של ההליך היא יותר מפעיל תלוי מאשר שיטת חיסונים אחרת, במיוחד אם המנתח עדיין לא מאומן היטב. עם זאת, מפעיל מנוסה הוא מסוגל לשחזר תוצאות ניסוי גם כמותית כפיקוח על ידי ניתוח חיסונית תגובה. שינוי של השיטה הוא להזריק את החיסון ל1,2 הטחול. ההכנה דומה לזה של הזרקת intralymphatic, אבל הגודל דואר של החתך הוא בדרך כלל גדול יותר ושני תפרים נעשים כדי לסגור אותו. יתרונותיו העיקריים של חיסון intrasplenic כאלה שהטחול הוא קל יותר למצוא ולפגוע מאשר בלוטות לימפה, יכולים להיות מיושמים כרכי זריקות גדולים וזריקות תכופות יותר, ובזמן שכל נזק של בלוטות לימפה שנגרמה על ידי החדרת מחט או הזרקה יהיה כרוך אזור מרכזי של הבלוטות לימפה, הנזק של הטחול יהיה כרוך יחסית פחות של האיבר ולהיות יותר בטבע מקומי.
ההליך של חיסון intralymphatic בעכברים ניתן לחזור (למשל חיסון לחיזוק זריקות) לאחר פרק זמן התאוששות של 3-4 שבועות לפני הזריקה שנייה באותה הצומת לימפה נעשה. אם זריקות תכופות יותר מתוכננות, יש להשתמש בשתי בלוטות לימפה מפשעתי שמאלה וימינה. לפחות שתי זריקות לבלוטות לימפה יכולות להתבצע, אך מחקרים נוספים נדרשים כדי להגדיר הגבלת פוטנציאל זה באופן מדויק יותר. זריקות נוספות עשויות להיות ד הקשהUE להיווצרות צלקת הן בבלוטות לימפה ובעור, כמו גם היווצרות גרנולומה פוטנציאלית הנגרמת על ידי אדג'ובנטים. מצד השני, חיסון יהיה לגרום לדלקת בלוטה לימפה חולפת, ואת גודל הלימפה הצומת המוגברת יפשט לוקליזציה וזריקות הבאות. ואכן, הלוקליזציה של הבלוטות לימפה היא מגבלה העיקרית של השיטה. בעוד עכברים צעירים (פחות מ -5 שבועות) עשויים להיות בלוטות לימפה קטנות מאוד, מבוגרת ובמיוחד עכברי זכרים מבוגרים יכולים להיות כל כך הרבה שומן תת עורי, לוקליזציה, כי הוא קשה. תנאים אופטימליים מתקבלים עם נקבות עכברים של 6-12 שבועות. ואכן, אחד השלבים הקריטיים ביותר של ההליך הוא ההזרקה לבלוטות לימפה עצמו. הזרקה לאזור הסמוך של הצומת תהיה שווה ערך להזרקה תת עורית עם מפעילה חלשה בהרבה מתגובה החיסונית מאשר לאחר הזרקת intralymphatic ישירה. הסיבה לכך היא שהכמוסה ולא מוצקה שמקיפה את הצומת היא לא חדירה למולקולות גדולות.לאנטיגן כדי להיכנס לבלוטות לימפה, יש לו לרוקן עם הלימפה. המסע הזה מתחיל בדרך כלל בכלי הלימפה הראשוני בעור, ממשיך בצינורות גדולים יותר בשכבה העמוקה יותר של העור, המנקזת את הלימפה לאיסוף כלי ברקמה התת עורית, ומשם לימפה היא מונעת על ידי תנועה פריסטלטית כלפי הניקוז הבא בלוטות הלימפה 23,24. במורד הזרם אנטיגן נוסף מופקד בדרך זו, פחות מזה יקבל גישה לימפה מביא.
השיטה של חיסון intralymphatic היא מעניינת במיוחד עבור ממשל של נוגדנים הנמצאים בחולשה immunogenic כאשר מנוהלים על ידי שיטות קונבנציונליות כגון מסלולים תוך שרירית או תת עורית. חיסון Intralymphatic שבוצע עם ה-mRNA, ה-DNA פלסמיד, פפטידים, חלבונים, וירוסים וחיידקים 22,25-27. אמנם יש לי פפטידים וחלבונים לא אדג'ובנטים ב- לבנות, וירוס ה-mRNA פלסמיד דנ"א וחיידקים להפעיל effe adjuvant הפנימיCTS על ידי מתן אותות סכנה (משכפלים את הווירוס וחיידקים) או על ידי גירוי קולטני Toll-כמו (TLRs) שיכול לחוש דפוסים מולקולריים הפתוגן משויך (PAMPs) כגון RNA חד גדילים (TLR7 וTLR8), RNA גדילים הכפול (TLR3), אשכולות ציטוזין המפוגל בלתי oligonucleotide וגואנין (TLR9), flaggelin חיידקים (TLR5), lipopolysaccharide (TLR2 ו4) מולקולות כמו גם נגיפיות וחיידקיים אחרים 28. לפיכך, במיוחד פפטיד וחיסונים מבוססי חלבון ירוויחו potentiation החיסונית של הזרקת החיסון ישירות לתוך הבלוטה לימפה. ואכן, זה כבר הוכיח כי תגובות B-ו-T-תא מוגברים לאחר חיסון פפטיד והחלבונים intralymphatic בעכברי 1,8,9. יתר על כן, חיסונים גנטיים, במיוחד חיסונים מבוססי ה-mRNA, הם מאוד לא יציבים שלסיבה שהם בוודאי להרוויח משיטת ממשל שאפשרו פעמים קטע קצרות ברקמות תאית. ואכן, חיסון intralymphatic עם אנטיגן-enRNA קידוד הושר חסינות מניעתי וטיפולית חזקה במודלי גידול עכבר 4. בדומה לכך, ממשל intralymphatic של אדג'ובנטים כגון CPG אפשר הפחתת הרעילות בשל המינון נמוך יותר הנדרש, והשפעת adjuvant מוגברת נצפתה עקב ההשפעה הישירה וחייה בתאים חיסוניים 13. גם הביצועים של אדג'ובנטים אחרים או מערכות אספקת אנטיגן כגון ננו וmicroparticles פולימריים כמו גם ליפוזומים יכולים להיות משופרים על ידי ממשל intralymphatic 11. עוד יתרון גדול של intralymphatic על מסלולי חיסון מקובלים הוא כי במינונים נמוכים בהרבה נדרשים בדרך כלל. לחלבונים ולגירוי של תגובות נוגדן, המינון יכול להיות מופחת על ידי 100-1,000 פי 9, בעוד שהמינון של ה-DNA לגירוי של תגובות תא T ציטוטוקסי CD8 יכול להיות מופחת עם כ. 10,000 פי 2.
בניגוד לאנטיגנים למקטע או חיסונים מתים, לחיות virאל וחיסונים חיידקים בדרך כלל לא צפויים ליהנות מממשלי intralymphatic. הסיבה לכך היא בחלקו שגר חיידקים בדרך כלל לנקז גם לבלוטות הלימפה ללא כל עזרה adjuvant. יתר על כן, חיידקים מדבקים יכולים להתמודד עם תופעות דילול אנטיגן ברקמות היקפית על ידי שכפול. לפיכך, את מינון האנטיגן לכת במערכת הלימפה המשנית יהיה בדרך כלל מספיק כדי לייצר את חסינות. עם זאת, שבו חיסוני חיים הקיימים מייצרים חסינות מספיקה, ממשל intralymphatic יכול לספק את התיקון הדרוש כדי להפוך את החיסון יעיל. זה לאחרונה הודגם כי חסינות לאחר חיסון עם חיסון שחפת זמין כרגע רק מ ' בוביס BCG אפשר לשפר באופן משמעותי על ידי הזרקה ישירה של BCG לבלוטות לימפה מפשעתי של עכברים 12. ממשל Intralymphatic גם אפשר את הקטנת הסכום מחוסן של BCG ידי 100-1,000 פי השוואה למנהל תת עוריתטיפול במשפחה. זה מייצג יתרון בטיחות של חיסון intralymphatic, במיוחד באנשים נפגעים מערכת החיסון.
חיסון Intralymphatic וטיפול חיסוני בבני אדם עד כה חלו על חולי סרטן וחולי אלרגיה. השיטה בבני אדם היא לא פולשנית, אך התוצאות הטובות ביותר ובקרת איכות מתקבלת על ידי השימוש באולטרסאונד כדי להנחות את ההזרקה, אשר עלול להגביל את היישום לבתי חולים או ביחידות לטיפול גדולות יותר. במחקרי סרטן, חיסון בפריים להגביר עם פלסמיד דנ"א ופפטיד לטיפול במלנומה גרורתית חשף immunogenicity וראיה לשליטה במחלה באוכלוסיות חולות מוגדרות 29. גם חיסון עצמי intralymphatic עם תאים דנדריטים שבוצע בחולי סרטן. בעוד שחלק מניסויים משופרים תגובות חיסוניים 30,31, ניסויים אחרים לא הצליחו להוכיח את התועלת של הממשלים intralymphatic 32,33. ההליך של ממשל intralymphatic הוכיח להיות בייחודcially לטובה בטיפול החיסוני של חולי אלרגיה. על ידי שינוי שיטת intralymphatic, מספר הזריקות לטיפול החיסוני שלם ומוצלח יכול להיות מופחת מ50 כ זריקות תת עורית על פני 3 שנים רק 3 זריקות מעל 2 חודשים 14,15. מכיוון ששני מספרי הזרקת מינונים יכולים להיות מופחתים במידה רבה על ידי עושה אימונותרפיה intralymphatic אלרגן הספציפי, ומכיוון שבלוטות הלימפה אינן מכילות תאי פיטום משחרר היסטמין, השיטות מייצגים יתרון בטיחות, ועם משך טיפול הקצר, תאימות חולה משופרת. במהלך השנים הבאות, אלרגיה היא אולי הסימן לכך שהייתי רואה את התועלת המיידית ביותר של שיטה חדשה זו של חיסון וחיסוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TMK נקרא על שמו כממציא פטנטים העוסקים בטיפול החיסוני intralymphatic באדם. TMK היה יועץ מדעי וקיבל הוצאות נסיעה מImVisioN GmbH, Cytos ביוטכנולוגיה, חברת MannKind, ויש לי XBiotech ארה"ב בע"מ PJ שום עניין סכסוך לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים על העזרה הניסיונית בפיתוח שיטת חיסון intralymphatic בעכברים מאיריס ארדמן, ברברה פון בויסט, וג'וליה מריה מרטינז-גומז. תודה גם לMaggy אראס וניקולה Cesarovic ומאפשרות לנו להשתמש בתיאטרון כירורגית שלהם לייצור בסרטון זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Ketasol-100) | Graeub AG, Switzerland | Anesthetics | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer, Germany | Anesthetics | |
| Viscotears Eye-Gel | Novartis, Switzerland | To keep eyes from drying out during anesthesia. | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml | BD Medical, France | 29 G Insulin syringes with permanently attached needles | |
| 6-0 Dermalon Monofilament Nylon | Covidien, MA, USA | For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue) | |
| Curved forceps, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision and holding of lymph node | |
| Straight surgical scissors, 4.5 in | Polymed, Switzerland | For incision | |
| Needle holder, 5.5 in | Polymed, Switzerland | To close incision with suture |
References
- Johansen, P., et al. Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity. Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).
- Maloy, K. J., et al. Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3299-3303 (2001).
- Smith, K. A., et al. Enhancing DNA vaccination by sequential injection of lymph nodes with plasmid vectors and peptides. Vaccine. 27, 2603-2615 (2009).
- Kreiter, S., et al. Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res. 70, 9031-9040 (2010).
- Johansen, P., et al. Antigen kinetics determines immune reactivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).
- Smith, K. A., et al. Lymph node-targeted immunotherapy mediates potent immunity resulting in regression of isolated or metastatic human papillomavirus-transformed tumors. Clin. Cancer Res. 15, 6167-6176 (2009).
- Johansen, P., et al. Toll-like receptor ligands as adjuvants in allergen-specific immunotherapy. Clin. Exp. Allergy. 35, 1591-1598 (2005).
- Johansen, P., et al. Heat denaturation, a simple method to improve the immunotherapeutic potential of allergens. Eur. J. Immunol. 35, 3591-3598 (2005).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Intralymphatic injections as a new administration route for allergen-specific immunotherapy. Int. Arch. Allergy Immunol. 150, 59-65 (2009).
- Martinez-Gomez, J. M., et al. Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy. Allergy. 64, 172-178 (2009).
- Mohanan, D., et al. Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems. J. Control Release. 147, 342-349 (2010).
- Waeckerle-Men, Y., et al. Lymph node targeting of BCG vaccines amplifies CD4 and CD8 T-cell responses and protection against Mycobacterium tuberculosis. Vaccine. 31, 1057-1064 (2013).
- von Beust, B. R., et al. Improving the therapeutic index of CpG oligodeoxynucleotides by intralymphatic administration. Eur. J. Immunol. 35, 1869-1876 (2005).
- Senti, G., et al. Intralymphatic immunotherapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 1290-1296 (2012).
- Senti, G., et al. Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).
- Lesterhuis, W. J., et al. Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients. Clin. Cancer Res. 17, 5725-5735 (2011).
- Fadul, C. E., et al. Immune response in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccination after radiation chemotherapy. J. Immunother. 34, 382-389 (2011).
- Eizenberg, P., et al. Acceptance of Intanza(R) 9 mug intradermal influenza vaccine in routine clinical practice in Australia and Argentina. Adv. Ther. 28, 640-649 (2011).
- Durando, P., et al. Adjuvants and alternative routes of administration towards the development of the ideal influenza vaccine. Hum. Vaccin. 7, 29-40 (2011).
- Barth, R. J., et al. A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
- Schwaab, T., et al. Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients. Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M.
- Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen. Immunity. 21, 341-347 (2004).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).
- Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. M., Gander, B.
- Johansen, P., von Moos, S., Mohanan, D., Kundig, T. M., Senti, G. New routes for allergen immunotherapy. Hum. Vacc. Immunother. 8, 1525-1533 (2012).
- Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. Intralymphatic immunotherapy: from the rationale to human applications. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 352, 71-84 (2011).
- Duthie, M. S., Windish, H. P., Fox, C. B., Reed, S. G. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol. Rev. 239, 178-196 (2011).
- Ribas, A., et al. Intra-lymph node prime-boost vaccination against Melan A and tyrosinase for the treatment of metastatic melanoma: results of a phase 1 clinical trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).
- Bedrosian, I., et al. Intranodal administration of peptide-pulsed mature dendritic cell vaccines results in superior CD8+ T-cell function in melanoma patients. J. Clin. Oncol. 21, 3826-3835 (2003).
- Lesimple, T., et al. Injection by various routes of melanoma antigen-associated macrophages: biodistribution and clinical effects. Cancer Immunol. Immunother. 52, 438-444 (2003).
- Brown, K., et al. Adenovirus-transduced dendritic cells injected into skin or lymph node prime potent simian immunodeficiency virus-specific T cell immunity in monkeys. J. Immunol. 171, 6875-6882 (2003).
- Fong, L., Brockstedt, D., Benike, C., Wu, L., Engleman, E. G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. J. Immunol. 166, 4254-4259 (2001).
