Summary
कट खुला वैसलीन खाई दृष्टिकोण तेज चैनल कैनेटीक्स के उच्च संकल्प के साथ Xenopus oocytes में व्यक्त वोल्टेज पर निर्भर आयन चैनल से आयनिक और gating धाराओं के कम शोर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मामूली संशोधन के साथ, वोल्टेज दबाना fluorometry कट खुला oocyte प्रोटोकॉल के लिए युग्मित किया जा सकता है.
Abstract
कट खुला oocyte वैसलीन अंतराल (COVG) वोल्टेज दबाना तकनीक oocytes में heterologous आयन चैनल के electrophysiological और गतिज गुणों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. कट खुले सेटअप से रिकॉर्डिंग कम परिमाण gating धाराओं, तेजी आयनिक वर्तमान सक्रियण, और क्रियाशीलता छोड़ना हल करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना (TEVC) तकनीक से अधिक मुख्य लाभ में वृद्धि हुई दबाना गति में सुधार के संकेत से शोर अनुपात, और intracellular और बाह्य परिवेश मिलाना करने की क्षमता शामिल है.
यहाँ, हम कट खुले सेटअप और प्रोटोकॉल के साथ ही वोल्टेज दबाना fluorometry क्षमता जोड़ने के लिए आवश्यक हैं कि संशोधनों को प्रदर्शित करने के लिए, (हंै वी 1.5), Xenopus oocytes में व्यक्त मानव हृदय सोडियम चैनल को रोजगार.
ऐसे हंै वी 1.5 के रूप में तेजी से सक्रिय आयन चैनल, गुण, पूरी तरह से जो में, TEVC का उपयोग कर कमरे के तापमान के पास हल नहीं किया जा सकता हैoocyte झिल्ली के घंटे संपूर्णता वोल्टेज नियंत्रण मुश्किल बना clamped है. हालांकि, कट खुला तकनीक में, कोशिका झिल्ली के केवल एक छोटे से हिस्से के अलगाव पैच दबाना तकनीक के साथ जुड़े चैनल चलाने के नीचे रोकने जबकि सही उपवास कैनेटीक्स रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक तेजी से clamping के लिए अनुमति देता है.
COVG तकनीक, आयन चैनल कैनेटीक्स और electrophysiological गुणों के साथ संयोजन के रूप में आगे प्रोटीन गति extracellularly लागू fluorophores, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रविष्टि, या अप्राकृतिक अमीनो एसिड के समावेश की सिस्टीन विकार के माध्यम से पता लगाया है जहां वोल्टेज दबाना fluorometry, का उपयोग करके assayed किया जा सकता है ब्याज 1 के क्षेत्र में. इस अतिरिक्त डेटा फ्लोरोसेंट अणु आसपास के microenvironment में परिवर्तन के माध्यम से प्रोटीन की वोल्टेज पर निर्भर गठनात्मक rearrangements के बारे में गतिज जानकारी पैदावार.
Introduction
विशिष्ट वोल्टेज clamping तकनीक नियंत्रित झिल्ली क्षमता पर आयनिक धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति. व्यापक रूप से दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना (TEVC) का इस्तेमाल किया और पैच दबाना तकनीक कई आयन चैनल के गुणों पर विश्वसनीय electrophysiological जानकारी प्रदान करते हैं. हालांकि, इन तरीकों के दोनों तेज वोल्टेज gated सोडियम चैनल और ऐसे Xenopus oocytes की उन के रूप में झिल्ली में अन्य तेजी से सक्रिय चैनल के लिए विश्वसनीय डेटा के अधिग्रहण को रोकने कि कमियां हैं. Bezanilla और स्टेफनी प्रयोगशालाओं फलस्वरूप oocytes 2 के लिए कट खुला वैसलीन खाई वोल्टेज दबाना तकनीक (COVG) विकसित की है. तकनीक, ना +, + K, और सीए 2 + चैनलों 3-8 रिकॉर्ड करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है.
COVG रिकॉर्डिंग के दौरान, एक heterologous प्रोटीन व्यक्त oocyte झिल्ली तीन क्षेत्रों में बांटा गया है. आयनिक मौजूदा डेटा के रूप में oocyte के शीर्ष क्षेत्र से दर्ज की गई हैशीर्ष क्षेत्र के आसपास के स्नान को आसानी से और जल्दी से बदला जा सकता है जो एक आदेश क्षमता, clamped है. मध्य क्षेत्र शीर्ष क्षेत्र 9 के रूप में एक ही क्षमता के लिए clamped किया जा रहा से रिसाव धाराओं के खिलाफ गार्ड. oocyte उद्घाटन (कट) खुला एक सैपोनिन समाधान या एक प्रवेशनी के उपयोग के माध्यम से होता है, जहां नीचे क्षेत्र है. रासायनिक या नीचे क्षेत्र में झिल्ली का मार्गदर्शन उद्घाटन भूमि से जोड़े, जो आंतरिक क्षमता के नियंत्रण की अनुमति देता है, और निचले सदन के समाधान के साथ सेल इंटीरियर सटे renders. शीर्ष चैम्बर में समाधान विनिमय बाहरी परिवेश को बदल देता है, जबकि निचले सदन में समाधान के छिड़काव, आंतरिक वातावरण के गुणों को समायोजित कर सकते हैं. 
चित्रा 1. Oocyte कट ओपन वोल्टेज दबाना स्नान सेटअप आरेख. (ए) ऊपरएक दूसरे से अलग तीन स्नान के मद्देनजर नीचे. COVG के लिए कक्षों का आयाम चित्रा पर प्रदर्शित कर रहे हैं. (बी) के परीक्षण की स्थिति में स्नान सेटअप के साइड देखें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
COVG तकनीक के फायदे कम मौजूदा शोर (3 kHz पर 1 ना), विदेशी मीडिया की आयनिक रचना, आंतरिक मीडिया, तेजी से समय संकल्प (के क्षय के 20-100 μsec समय लगातार मिलाना करने की क्षमता का नियंत्रण शामिल क्षमता क्षणिक), और कई घंटे 9 के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग. नुकसान यह विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और यह दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज clamping (TEVC) 10 की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए और अधिक कठिन है कि कर रहे हैं.
COVG दृष्टिकोण अति विशिष्ट उपकरण और जटिल प्रक्रिया संबंधी तत्वों की आवश्यकता होती है, यह valu के अधिग्रहण के लिए अनुमति दे सकते हैंसक्षम electrophysiological डेटा. इस तरह के उपवास कैनेटीक्स और पूंछ धाराओं के साथ 4 धाराओं gating के रूप में इस डाटा, चैनल चलाने के नीचे सहित अन्य वोल्टेज clamping प्रोटोकॉल के साथ जुड़े मुद्दों में से कुछ के बिना दर्ज किया जा सकता है. COVG सेटअप मामूली संशोधनों के तापमान नियंत्रकों और वोल्टेज दबाना fluorometry (वीसीएफ) के उपयोग के लिए अनुमति दे सकते हैं. COVG विधानसभा के भीतर वोल्टेज दबाना fluorometry तत्वों के शामिल किए जाने के साथ ही साथ वर्तमान 11-13 जबकि रिकॉर्डिंग प्रोटीन गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करके डेटा उत्पादन बढ़ाने कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. प्रारंभिक उपकरण सेटअप
- विद्युत और यांत्रिक शोर को रोकने के लिए एक आसपास के फैराडे पिंजरे के साथ एक कंपन अलगाव प्रणाली (उदाहरण के लिए एक हवाई तालिका) पर मंच और microelectrode जोड़तोड़ रखें.
- 24 AWG तार की छह इंच लंबाई करने के लिए छह एजी / AgCl छर्रों मिलाप. इन लंबाई में से एक के लिए (P1 से जुड़े होने की), एक दूसरे तार में ब्याह एक "वाई" के रूप में. प्रत्येक तार के सिरों पर एम्पलीफायर के साथ शामिल है जो एक सोने BNC पिन, मिलाप.
- स्नान / गार्ड headstage (P1, P2, सीसी, जीएस 1, और GS2) को 24 AWG तार को soldered पांच एजी / AgCl छर्रों से कनेक्ट करें. कनेक्ट "मैं" "मैं" headstage और V2 headstage को P1 के बंद आ रहा दूसरा तार करने के लिए एजी / AgCl गोली.
- उपकरणों मैनुअल में दिए गए निर्देशों के अनुसार डाटा अधिग्रहण इकाई को एम्पलीफायर से कनेक्ट करें.
- प्लेस और तापमान नियंत्रक thermistors epoxy. धातु scaffol में एक छेद के माध्यम से ब्लॉक thermistor धागासीधे हीटिंग / ठंडा तत्व के केन्द्र से ऊपर घ. प्लेस और बहुत करीब है, लेकिन समाधान से संपर्क नहीं तापमान का आयोजन नीचे चैंबर के शरीर में drilled छेद में स्नान thermistor epoxy.
2. Oocyte और प्रारंभिक तैयारी
- ऐसे हंै वी 1.5 के रूप में एक heterologously व्यक्त चैनल को रिकॉर्ड करने के लिए, (hSCN5a से प्राप्त) mRNA synthesize और लगभग 4-5 दिनों प्रोटोकॉल 4 के प्रदर्शन से पहले एक Xenopus oocyte में यह इंजेक्षन. HSCN5a के लिए, शिखर अभिव्यक्ति 19 डिग्री सेल्सियस पर 4-5 दिनों के लिए incubating के बाद प्राप्त होता है विस्तृत oocyte पर निर्देश, mRNA तैयारी, और oocyte इंजेक्शन के लिए रिचर्ड्स और Dempski 14 और कोहेन एट अल. 15 को देखें.
- प्रोटोकॉल 4 शुरू होने से पहले AgCl तार और AgCl छर्रों क्लोराइड. ऐसा करने के लिए, कम से कम 20 मिनट के लिए ब्लीच में एक तार के अंत और छर्रों जगह और जब तक हे / एन के रूप में छर्रों chlorid किया गया है एक बारएड, चिपकने का उपयोग कई गुना करने के लिए उन्हें प्रत्यय.
नोट: तारों के माध्यम से वर्तमान ड्राइविंग भी तार और छर्रों क्लोराइड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक chloridation की गति में वृद्धि, लेकिन यह भी अधिक उपकरणों की आवश्यकता होगी. आगे की शिक्षा के लिए 16 चांदी के तारों Chloriding के लिए तकनीकों को देखने.
3. अग्रवाल ब्रिज तैयारी
- एक मध्यम लौ में एक borosilicate केशिका ट्यूब के एक सिरे को गर्म करके कम से कम छह अगर पुल बनाओ. केशिका टयूबिंग के अंत नीली लौ के शीर्ष भाग में है कि सुनिश्चित करें. मूल को नुकसान के मामले में अतिरिक्त पुल बनाओ.
- केशिका ट्यूब गर्म है एक बार, ट्यूब में एक 90 डिग्री के कोण मोड़ बनाने के लिए संदंश का उपयोग करें. एक चिकनी वक्रता के बजाय एक अचानक कोने के साथ एक मोड़ के लिए निशाना लगाओ या यह काफी अधिक कठिन बनाता है भरने और पुल का प्रतिरोध बढ़ जाती है जो कांच के आंतरिक व्यास कम कर सकते हैं.
- एक दूसरे से 90 डिग्री मोड़एक ही दिशा में पहला मोड़ से केशिका ट्यूब नीचे 25 मिमी ही चरणों का उपयोग कर.
नोट: पुल की सटीक लंबाई के रूप में लंबे समय से पुल के आकार के अनुरूप है के रूप में कोई फर्क नहीं पड़ता, लेकिन अंततः लंबाई वे पर इस्तेमाल किया जाएगा योजना के लिए उपयुक्त होना चाहिए. पुल प्रतिरोध इसकी लंबाई के लिए आनुपातिक है और कम से कम किया जाना चाहिए कि मन में रखो. - केशिका ट्यूब ठंडा है, लगभग 5 मिमी पुल की "पैर" ट्रिम करने के लिए एक हीरे की इत्तला दे दी ग्लास कटर का उपयोग करें.
- अगर 17 में प्रतिरोध को कम करके प्रदर्शन में सुधार करने के लिए तीन "वर्तमान की आपूर्ति" पुलों की केशिका ट्यूब में प्लैटिनम तार की लंबाई डालें. ट्यूब के बाहर उजागर कोई तार इतना है कि वहाँ किसी भी अतिरिक्त प्लैटिनम तार काट दिया.
नोट: कारण प्लेटिनम की उच्च लागत के लिए, पुनः प्राप्त करने और टूट पुलों से किसी भी तार पुन: उपयोग. - इस तरह के एक micropipette टी के रूप में लागू करने के लिए आगे एक ठीक इत्तला दे दी साथ केशिका ट्यूब में प्लैटिनम तार पुशआईपी तार केशिका ट्यूब के दोनों सिरों पर कांच की तुलना में कम 1 मिमी है कि इतनी.
- HEPES के 1.2 जी के साथ बफर 1 एम NMDG के 100 मिलीलीटर. एक पीएच मीटर का प्रयोग करें और 7.4 के पीएच (~ 10 ग्राम) हासिल की है जब तक एमईएस हाइड्रेट पाउडर डालें. 7.4 का पीएच पर पहुंच गया है, पीएच इलेक्ट्रोड हटा दें. एक भंडारण समाधान के रूप में रखने के लिए अलग समाधान की 40 एमएल सेट करें.
- एक 2-3% अगर मिश्रण का उत्पादन करने के लिए दानेदार अगर जोड़ें. अगर समाधान जब तक हलचल और गर्मी भंग और स्पष्ट है. ज़रूरत से ज़्यादा गरम या यह पीढ़ी चिपचिपा और पुलों के लिए मुश्किल हो जाएगा भरने हो जाएगा के रूप में समाधान फोड़ा मत करो.
- एक नया बीकर अगर समाधान कदम है और एक छोटे से हलचल बार जोड़ें. हीटिंग और एक मध्यम गति से सरगर्मी जारी.
- केशिका पुलों का सामना करना पड़ पैरों के साथ एक समय में एक जोड़ें. समय के साथ पुलों अगर साथ भर जाएगा. वैकल्पिक रूप से, एक छोटे पिपेट टिप से जुड़ी एक सिरिंज के माध्यम से अगर समाधान धक्का द्वारा पुलों भरें.
- कोई बुलबुले बीआरआई में कर रहे हैं एक बारdges, अगर समाधान से पुलों पुनः प्राप्त करने और सुखाने के लिए एक कागज तौलिया पर पुलों जगह है. अवशिष्ट बुलबुले के साथ कोई पुलों बुलबुला बाहर निकलने की सुविधा के लिए संदंश के साथ उत्तेजित किया जा सकता है.
नोट: बुलबुले के साथ बसे अगर पूरी तरह से उबलते पानी में पुल डुबो कर हटाया जा सकता है. अगर निकाले जाने के बाद, अवशिष्ट पानी को निकालने के लिए एक निर्वात लाइन का उपयोग करें. पुल तो अगर उपचार के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है. - शुष्क जब पुल से अतिरिक्त अगर निकालें. 40 एमएल रिजर्व समाधान के लिए पानी की 60 मिलीलीटर जोड़ें और भंडारण समाधान में पुलों जगह है.
4. कट खुला रिग तैयारी
- तापमान नियंत्रक के लिए पानी के स्रोत और तापमान नियंत्रक को तो बिजली स्विच ऑन करें. स्नान तापमान निर्दिष्ट तापमान (19 डिग्री सेल्सियस) तक पहुँच जाता है जब तक प्रतीक्षा करें.
- 0.2-0.5 MΩ का प्रतिरोध करने के लिए एक microelectrode खींचने के साथ borosilicate केशिका टयूबिंग से microelectrodes खींचो.
नोट: कम रंजette प्रतिरोध क्लेम्पिंग गति में सुधार. हालांकि, कम प्रतिरोध pipettes oocyte को नुकसान होने की संभावना है. प्रयोगों प्रत्येक आवेदन के लिए सबसे अच्छा पिपेट प्रतिरोध मूल्य निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. - आंतरिक समाधान के 50 एमएल के साथ सूखी सैपोनिन की 0.125 ग्राम मिश्रण से सैपोनिन समाधान तैयार करें. यह एक 0.25% का समाधान हो जाएगा. मिश्रण करने के लिए धीरे उलटें.
- एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक बहुत ठीक इत्तला दे दी वस्तु के साथ मध्य कक्ष और ऊपरी सदन के नीचे की ओर के ऊपर की ओर छेद के किनारे के आसपास वैसलीन की एक छोटी राशि लागू होते हैं.
नोट: वैसलीन की "डोनट" छेद से अधिक जगह में oocyte रखने में मदद मिलेगी और मुहर के गठन में सहायता करेगा. हालांकि, बहुत ज्यादा वैसलीन जाल बुलबुले होगा और oocyte सतह तक पहुँचने से समाधान को रोकने के. - वहाँ स्लॉट से कोई अतिप्रवाह है लेकिन छर्रों और पुल पैर सिरों कोव हैं कि इतनी एजी / AgCl छर्रों पकड़े कई गुना स्लॉट में 3 एम KCl समाधान जोड़ेंलाल. स्लॉट्स के बीच अवांछित बिजली कनेक्शन को रोकने के लिए अतिरिक्त KCl बूंदों को साफ.
- कम और मध्यम स्नान कक्षों के लिए बाहरी समाधान जोड़ें.
- पुल प्रति एक पैर प्रत्येक स्लॉट में है कि इतना AgCl गोली कई गुना में स्लॉट में अगर पुल रखें. पुलों के दूसरे पैर बाद में संबंधित कक्षों में रखा जाएगा (P1, P2, सीसी शीर्ष; GS1, GS2 मध्य (गार्ड), मैं नीचे). प्लैटिनम तार पुलों GS2, p2 में हैं, और मैं स्लॉट्स सुनिश्चित करें.
नोट: सुनिश्चित पुलों कक्ष स्नान में डालने से पहले आसुत जल के साथ और पूरी तरह से सूखे धो रहे हैं. - डाटा अधिग्रहण प्रणाली और पीसी पर बारी. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो.
5. कट खुली प्रक्रिया
- एक oocyte के बिना शीर्ष और मध्य oocyte कक्षों को स्थापित करें. दो कक्षों में छेद ओवरलैप नहीं है कि इतनी ऑफ सेंटर शीर्ष चैम्बर स्लाइड. बाहरी समाधान के साथ सभी कक्षों को भरने और उनके संबंधित कक्षों में सभी इलेक्ट्रोड जगह.
नोट: कक्षों की स्थापना के लिए जब सभी तरह से नीचे शीर्ष चैम्बर धक्का नहीं है. एक बहुत छोटे से अंतराल के दो कक्षों के बीच बना हुआ है सुनिश्चित करें. बंद केंद्र व्यवस्था बेहतर एक सेल की उपस्थिति अनुकरण करने के लिए चैम्बर प्रणाली के प्रतिरोध बढ़ जाती है. "पुलों संतुलन" नामक यह प्रक्रिया, अगर पुलों के बीच inhomogeneity से उत्पन्न हो सकती है कि ऑफसेट क्षमता के लिए क्षतिपूर्ति.- बाहरी कमांड और दोनों clamps बंद करें. एम्पलीफायर पर वर्तमान पढ़ने की जाँच करें. शून्य वर्तमान को स्नान / गार्ड सिर में मंच के पीछे ऑफसेट एक छोटा पेचकश पी के साथ समायोजित करें.
- सक्रिय करने के लिए एम्पलीफायर पर स्नान / गार्ड स्विच और शून्य वर्तमान प्राप्त करने के लिए ऑफसेट जीएस समायोजित करें.
- दोनों (<100 एनए) शून्य के काफी करीब रहे हैं जब तक "सक्रिय" और "निष्क्रिय" के बीच दोहराएँ.
- शीर्ष चैम्बर निकालें और एक विंदुक पंप का उपयोग मध्य स्नान चेंबर में एक oocyte हस्तांतरण. यकीन oocy बनाओते स्नान के केंद्र में छेद के ऊपर स्थित है.
नोट: VCF के लिए एक oocyte की तैयारी करते हैं, तो ऊपर की ओर का सामना करना पड़ पशु ध्रुव (काले पक्ष) के साथ कक्ष में लेबल सेल जगह है. वीसीएफ प्रदर्शन किया जा रहा है, तो सेल अभिविन्यास कोई फर्क नहीं पड़ता. - Oocyte और स्नान सतह के बीच एक मुहर बनाने के लिए एक Aspirator का उपयोग कर नीचे स्नान से अतिरिक्त बाहरी समाधान निकालें.
- चैम्बर में छेद oocyte के शीर्ष पर केन्द्रित है ताकि oocyte से अधिक शीर्ष स्नान चैम्बर रखें. छेद के माध्यम से ऊपरी स्नान करने के लिए झिल्ली के केवल एक छोटे से हिस्से को बेनकाब करने के रूप में तो यह oocyte के खिलाफ कसकर दबाया जाता है जब तक धीरे धीरे चैम्बर पर दबाव नीचे लागू, एक अंगूठा और बीच की उंगली का उपयोग करना.
नोट: oocyte शीर्ष कक्ष से दबाव में उभार सकता है. इस oocyte टूटना कारण होगा, शीर्ष चैम्बर के लिए अत्यधिक बल लागू न करें. शीर्ष चैंबर के विकर्ण कोनों पर रखा चिमटी सुझावों Appl के लिए उंगलियों के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैY नीचे दबाव. - वे लगभग पूरा कर रहे हैं जब तक ऊपर और नीचे स्नान करने के लिए बाहरी समाधान जोड़ें.
- चित्रा 2 (पुल प्लेसमेंट) के रूप में देखा प्रत्येक स्नान के बाहरी समाधान में अगर पुल से मुक्त पैर रखें. प्रत्येक पुल इसकी सही स्नान स्थान में आराम कर रहा है कि सुनिश्चित करें. (मैं नीचे स्नान, मध्य स्नान में GS1 और GS2 पुलों, और P1, P2, और ऊपरी स्नान में सीसी पुलों में पुल). सक्रिय करने के लिए एम्पलीफायर पर स्नान / गार्ड स्विच.
नोट: सुनिश्चित पुलों, उनके कुओं, और रिकॉर्डिंग कक्षों के बीच कोई 3 एम KCl कनेक्शन हैं. इसके अलावा, वे रिकॉर्डिंग कक्ष समाधान ऊपर उठाया जाता है कि इतना यकीन है कि पुलों विचारों के हैं बनाते हैं.
चित्रा 2. अगर पुल से मुक्त सिरों के अग्रवाल ब्रिज सेटअप स्थान आरेख. प्लेसमेंट स्थानोंविभिन्न स्नान में. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . - रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में एक परीक्षण प्रोटोकॉल प्रारंभ करें. नाड़ी (निष्क्रिय में स्नान / गार्ड के साथ 0.3 MΩ के लिए इसी) अधिक से अधिक 100 से ना तो नहाने के कवर की जकड़न में वृद्धि है कि एक 100 एम वी पल्स लागू करने पर दो चोटियों के बीच क्षैतिज खंड के ऊर्ध्वाधर विस्थापन से पता चलता है. एक आदर्श परीक्षण नाड़ी का एक उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें.
नोट: परीक्षण प्रोटोकॉल स्नान कवर पर्याप्त तंग है और सभी घटकों को सही ढंग से इकट्ठा किया गया है देखने के लिए अगर एक वोल्टेज पल्स उत्सर्जन करता है. वैकल्पिक रूप से, एम्पलीफायर का परीक्षण समारोह में इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 3. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर से आदर्श परीक्षण पल्स. परीक्षण पल्सलागू प्रोटोकॉल के आधार पर ऊपर नाड़ी के लिए इसी तरह दिखना चाहिए. होल्डिंग वर्तमान (केंद्र आधारभूत) शून्य के करीब होना चाहिए. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . - नीचे स्नान में बाहरी समाधान निकालें और सैपोनिन समाधान के साथ बदलें. सैपोनिन जोड़ते समय बुलबुले बनाने से बचने के लिए सावधान रहें. , अधिकतम प्रतिस्थापन सुनिश्चित समाधान को जोड़ते समय नीचे स्नान के विपरीत छोर पर चूषण लागू करने के लिए.
- सैपोनिन समाधान जोड़ा गया है के बाद, दोहरा परीक्षण पल्स निरीक्षण करते हैं. परीक्षण प्रोटोकॉल की चोटी कम कर देता है या गायब हो जाता है तो यह oocyte नीचे स्थित एक बुलबुला है कि वहाँ एक संकेत है. इस मामले में पूरी तरह से सैपोनिन समाधान निकालने और फिर इसे बदलने के.
नोट: Permeabilization आमतौर पर ताजा सैपोनिन समाधान के साथ 30 सेकंड के भीतर पूरा हो गया है. फंस बुलबुले हैं अगर समाधान कठिनाई सेल तक पहुँचने के लिए हो सकता हैया कूपिक परत एक खराब पचा oocyte पर रहता है. वोल्टेज स्पाइक के ढलान (क्षय की लगातार समय में वृद्धि) कम हो जाती है जब oocyte (खोला) permeabilized किया गया है.
चित्रा 4. परीक्षण पल्स Oocyte Permeabilization के दौरान बताते हैं. परीक्षण पल्स प्रोटोकॉल से चयनित निशान एक 0.25% सैपोनिन समाधान नीचे oocyte चेंबर में पेश किया गया था के बाद. निशान में देखा क्षय की लगातार समय की वृद्धि oocyte permeabilization की वृद्धि दर्शाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . - सेल permeabilized है एक बार, सैपोनिन समाधान निकालने और आंतरिक समाधान के साथ स्नान भरें. परीक्षण प्रोटोकॉल बंद करो.
नोट: सैपोनिन के लिए उपयोग की अनुमति देता है हालांकिझिल्ली permeabilizing द्वारा सेल के इंटीरियर, कम स्नान और प्रसार से oocyte के cytoplasm के बीच आयन सांद्रता का संतुलन एक बहुत ही धीमी प्रक्रिया है. इस प्रक्रिया (चित्रा 5) की स्थिति पर निर्भर करता है मिनट के दसियों आवश्यकता हो सकती है. - स्नान में समाधान के किसी भी उच्च स्तर के लिए जाँच करें और इन शॉर्ट सर्किट और अनियमित व्यवहार का कारण बन सकता है के रूप में कई गुना के कुओं के बीच KCl सघन.
- एक microelectrode में 3 एम KCl इंजेक्षन करने के लिए संशोधित सिरिंज का प्रयोग करें. अन्य अंगुलियों से ताल्लुक़ है, जबकि एक उंगली से microelectrode कई बार झटका.
नोट: यह चरण microelectrode के भीतर किसी भी फंस हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए आवश्यक है. - खुले microelectrode अंत में तार रेशा डालने से micromanipulator हाथ पर KCl से भरे इलेक्ट्रोड माउंट. रेशा धारक में microelectrode के अंत पुश और इलेक्ट्रोड ढीला नहीं है सुनिश्चित करें. इलेक्ट्रोड बांधनेवाला कसो.
नोट: मातार सामान्य रूप से कार्य करने के लिए इलेक्ट्रोड के लिए एक भी AgCl कोटिंग है कि यकीन KE. - Oocyte स्नान से अधिक की स्थिति में हाथ स्विंग और आगे हाथ आंदोलन को रोकने के लिए clamps कस लें.
- जोड़तोड़ knobs का उपयोग, स्नान में इलेक्ट्रोड नीचे चलते हैं. कोई परीक्षण पल्स आवेदन किया है और झिल्ली परीक्षण सुविधा इस बिंदु पर सक्रिय नहीं है कि यह सुनिश्चित करें कि.
नोट: इलेक्ट्रोड टिप तरल में डाला जाता है इससे पहले, V1-V2 वोल्टेज दबाना पर सकारात्मक वोल्टेज पढ़ा होगा. इलेक्ट्रोड टिप तरल में डाला जाता है एक बार, वोल्टेज दबाना पर वोल्टेज मीटर शून्य के करीब एक मूल्य को बदलना चाहिए. वीसीएफ रिकॉर्डिंग के लिए, इलेक्ट्रोड उद्देश्य के लिए जगह छोड़ने के लिए एक काफी उथले कोण पर सेल दृष्टिकोण की जरूरत है. बंद केंद्र इलेक्ट्रोड के साथ सेल impaling, अलग झिल्ली पैच के किनारे के करीब भी इलेक्ट्रोड के साथ उद्देश्य के टकराव से बचने में मदद करता है. - इलेक्ट्रोड नीचे चलने बंद करो. ऑफसेट इलेक्ट्रोड सेटV1 बटन दबाने और फिर V1 समायोजन करके शून्य करने के लिए V1 वोल्टेज कम करके शून्य करने के लिए संभावित ऑफसेट. इसके अलावा, V2 के लिए एक ही समायोजन प्रदर्शन करते हैं. संभावित अंतर V1-V2 000 एम वी पढ़ना चाहिए.
- वापस V1 करने के लिए स्विच और इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापने के लिए पर z-परीक्षण बारी. मूल्य धीरे - धीरे गिर जाते हैं और वास्तविक प्रतिरोध दृष्टिकोण होगा. 0.2-0.5 MΩ का प्रतिरोध मूल्य के लिए निशाना लगाओ.
- शीर्ष स्नान में oocyte के दृश्य पैच की ओर इलेक्ट्रोड नीचे चलने जारी. Microelectrode oocyte के बहुत करीब है एक बार, इलेक्ट्रोड oocyte में प्रवेश करती है जब V1-V2 पढ़ने को देखने के लिए घड़ी, microelectrode सेल में प्रवेश करती है जब V1-V2 वोल्टेज नकारात्मक हो जाएगा.
नोट: इस बिंदु पर दिखाया मूल्य कोशिका की झिल्ली क्षमता है और व्यक्त चैनलों और इस्तेमाल समाधान से प्रभावित हो जाएगा. बहुत दूर microelectrode डालने कोशिका झिल्ली को नुकसान होगा. - में डेटा संग्रह प्रोटोकॉल खोलेंरिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर.
- वोल्टेज दबाना पर दबाना स्विच पर पलटें और "मैं" headstage पर स्थित घुंडी समायोजन करके आदेश (जैसे -100 एम वी) मैच के लिए संभावित समायोजित करें.
- समाई और प्रतिरोध मुआवजा स्विच पर पलटें.
- "टेस्ट" वोल्टेज क्लैंप के "आदेश" क्षेत्र में पर स्विच फ्लिप. संकेत कल्पना करने के लिए आस्टसीलस्कप का उपयोग करें. आस्टसीलस्कप पर capacitive यात्रियों को कम करने के संकेत कंडीशनिंग खंड में मुख्यमंत्री मुआवजा knobs समायोजित करें. अतिरिक्त रिवर्स चोटियों उत्पन्न होती है या चोटियों रिकॉर्डिंग में विरूपण साक्ष्य को पेश कर सकते हैं, जो एक sigmoidal वक्रता विकसित करने के लिए शुरू इस मुद्दे पर जहां चोटियों क्षतिपूर्ति पर-मत करो.
- समाई स्वयं एक संतोषजनक स्तर तक कम हो गया है एक बार, टेस्ट स्विच बंद कर देते हैं.
- रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में डाटा रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल शुरू.
6. सफ़ाई
- रिकॉर्डिंग मधुमक्खी है जबn पूरा, दबाना और स्नान / गार्ड स्विच सहित वोल्टेज दबाना पर सभी विभिन्न स्विच बंद कर देते हैं.
- विभिन्न स्नान से अगर पुल को दूर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
- शीर्ष स्नान निकालें और सभी स्नान से सभी समाधान और oocyte aspirate.
- सभी स्नान कुल्ला और फिर एक वैक्यूम के साथ स्नान निकालना विआयनीकृत पानी की एक बोतल का उपयोग करें. इस चरण 3-5X दोहराएँ.
- पुल बंद सघन KCl साफ कर लें और भंडारण समाधान में पुलों जगह है. पुल जब तक वे ठीक से जमा कर रहे हैं के रूप में कई हफ्तों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है.
- कई बार कई गुना कुओं से KCl समाधान Aspirate और विआयनीकृत पानी से कई गुना कुल्ला.
- तापमान नियंत्रण और रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर सहित सभी विभिन्न उपकरणों को बंद कर दें.
7. वोल्टेज क्लैंप fluorometry के अलावा
- एक पहले प्रकाशित जौव प्रोटोकॉल 16 ई में 6 के माध्यम से धारा 1 में चरणों का पालन करेंसाइट निर्देशित प्रतिदीप्ति लेबलिंग के साथ बगल में झिल्ली प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता xamining: पेज देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- 4X फोकस में सेट एक वीसीएफ माइक्रोस्कोप का उपयोग aforementioned COVG प्रोटोकॉल के 5.22 के माध्यम से धारा 4 में चरणों को पूरा करें.
नोट: VCF रिकॉर्डिंग COVG माप के लिहाज़ से बड़ा oocyte स्नान कक्षों की आवश्यकता होती है. (कस्टम वीसीएफ कक्षों के आयामों सामग्री सूची में स्थित हैं.) यह बड़ा वीसीएफ चैम्बर एक साथ उद्देश्य लेंस, microelectrode, और अगर पुलों को समायोजित करने में सक्षम होना चाहिए. इसके अतिरिक्त, पशु ध्रुव (oocyte के अंधेरे पक्ष) कम पृष्ठभूमि वीसीएफ रिकॉर्डिंग के लिए चैम्बर में ऊपर की ओर का सामना करना पड़ जाने की जरूरत है. - एक पानी में विसर्जन 40x उद्देश्य का उपयोग ध्यान में oocyte के शीर्ष भाग ले आओ.
नोट: 40X उद्देश्य के लिए 4X से स्विचिंग एक विशिष्ट जीई की आवश्यकताकट खुला घटकों और सावधान ध्यान के ometry 40X उद्देश्य को कम जब इलेक्ट्रोड, पुलों, या कक्षों हिट करने के लिए नहीं जा सके. इसके अलावा, के कारण शीर्ष गार्ड में वृद्धि की मात्रा के लिए, 40X उद्देश्य जगह में स्थापित है जब शीर्ष गार्ड से है कि स्नान मात्रा बीच गार्ड के साथ जुड़ा तो नहीं है. - Oocyte के बहुत ऊपर थोड़ा ध्यान देने के विमान से ऊपर है, इसलिए है कि उजागर oocyte सतह की परिधि के चारों ओर एक अंगूठी पर ध्यान दें.
नोट: देखने के क्षेत्र ज्यादातर झिल्ली और नहीं चैम्बर से भर जाता है तो xy विमान में समायोजन आवश्यक हो सकता है. XY अनुवाद सबसे अधिक आसानी से एक अनुवाद मंच पर माइक्रोस्कोप की नियुक्ति से पूरा होता है. - ऑप्टिकल पथ में फिल्टर क्यूब ले जाएँ और डिटेक्टर (डायोड) को ऐपिस से प्रकाश पथ स्विच.
- वीसीएफ प्रकाश स्रोत पर बारी.
- भूमि के ऊपर रोशनी, फाइबर प्रकाश प्रकाशक, और प्रकाश के अन्य स्रोतों को बंद कर दें.
नोट: आदर्श रूप में, वीसीएफरिकॉर्डिंग एक पूरी तरह से अंधेरे कमरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. - रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में एक प्रतिदीप्ति प्रोटोकॉल चलाएँ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 4 दिखाता एक सैपोनिन समाधान के रूप में oocyte की पारगम्यता में परिवर्तन oocyte के नीचे अनुभाग के लिए आवेदन किया है. 5 सैपोनिन permeabilization निम्नलिखित प्रसार द्वारा intracellular समाधान विनिमय की दर को दर्शाता है चित्रा. 20-40 मिनट के लिए एक स्थिर राज्य 2,18 करने के लिए आने के लिए आवश्यक हैं.
रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल से उत्पन्न चित्रा 6A शो निशान. चित्रा वोल्टेज प्रोटोकॉल (इनसेट) के जवाब में (P/-8 रिसाव घटाव के बाद) आयनिक धाराओं से पता चलता है. चित्रा में प्रत्येक का पता लगाने के लिए एक अलग लागू वोल्टेज का प्रतिनिधित्व करता है. धीमी कैनेटीक्स साथ निशान सोडियम चैनल खोल सकते हैं, जिस पर सबसे कम क्षमता का प्रतिनिधित्व करते हैं. आमतौर पर, पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर, यह आवक वर्तमान झिल्ली depolarizes क्योंकि ये कम क्षमता के लिए वोल्टेज नियंत्रण बनाए रखने के लिए मुश्किल है. बदले में इस विध्रुवण एक सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश बनाने और अधिक चैनलों को सक्रिय . कट खुला तकनीक के सुधार दबाना गति भी इन मुश्किल क्षमता पर चैनल रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक वोल्टेज नियंत्रण सक्षम बनाता है.
चित्रा 6B चित्रा 6A में निशान से उत्पन्न किया गया था जो वर्तमान / वोल्टेज की अवस्था को दिखाती है. वोल्टेज नियंत्रण के बिना जल्द से जल्द क्षमता पर मौजूदा शिखर (~ -60 एम वी) का अनुमान से अधिक होगा, ऊपर उल्लेख किया. यह वर्तमान वोल्टेज संबंध का सटीक वर्णन को रोका जा सके.
चित्रा 7 एक oocyte के लिए वोल्टेज दबाना fluorometry परिणामों का एक उदाहरण दिखाता है. प्रतिदीप्ति संकेत मानव हृदय सोडियम चैनल ना वी 1.5 की DII डोमेन में स्थिति 805 पर डाला सिस्टीन पर एमटीएस-Tamra के साथ लेबल एक oocyte से दर्ज किए गए.
_upload/51040/51040fig5.jpg "चौड़ाई =" 500px "/>
चित्रा 5. आंतरिक समाधान संतुलन के cytoplasmic ना + प्रसार से एकाग्रता बदले. दर की काइनेटिक्स सेल के दोनों बाह्य और आंतरिक पक्षों को 90 मिमी ना + लागू करने और फिर चतुर्थ संबंधों हर 2 मिनट रिकॉर्डिंग से ना + उलट क्षमता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. आंतरिक वातावरण पूरी तरह से बदल दिया गया था, तो ई राजस्व 0 एम वी होगा. सैपोनिन oocyte झिल्ली permeabilized जब समय मापन शुरू कर दिया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6. जंगली प्रकार ना वी 1.5कट ओपन वोल्टेज Clamping से सोडियम चैनल परिणाम. (ए) निशान 100 मिसे के लिए -120 एम वी, 40 वी में करने के लिए परीक्षण पल्स (-120 एम वी करने के लिए नीचे -80 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से विभिन्न उत्तेजनाओं voltages से मौजूदा दर्ज 200 मिसे, और अंततः -120 एम वी repolarizing के लिए 10 एम वी वेतन वृद्धि). (बी) यहाँ पैनल ए में चोटी वर्तमान वोल्टेज निर्भरता, एमवी दिखाया गया है 60 अप करने के लिए दालों के लिए मौजूदा शिखर का प्रतिनिधित्व करता है जो चतुर्थ वक्र,. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 7. एक oocyte से दर्ज ना वी 1.5 सोडियम चैनल वोल्टेज क्लैंप fluorometry रिकॉर्डिंग. (ए) आयोनिक धाराओंमानव हृदय सोडियम चैनल ना वी 1.5 की DII-S4 डोमेन में स्थिति 805 पर डाला सिस्टीन पर एमटीएस-Tamra के साथ लेबल. -170 एम वी से 70 वी तक लेकर वोल्टेज दालों -120 एम वी को एक prepulse निम्नलिखित 20 मिसे की अवधि के लिए 20 एम वी वेतन वृद्धि में लागू किया गया. (बी) जुड़े प्रतिदीप्ति संकेत. हर दूसरे प्रतिदीप्ति ट्रेस स्पष्टता के लिए छोड़ा जाता है. ΔF / एफ वोल्टेज स्पंद से प्रेरित प्रतिदीप्ति तीव्रता के सापेक्ष परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कट खुला oocyte वैसलीन खाई वोल्टेज दबाना तकनीक डेटा का तेजी से समाधान के लिए अनुमति देता है, कम शोर, अपेक्षाकृत लंबे प्रोटोकॉल 19 से अधिक आंतरिक समाधान और बाहरी समाधान संरचना पर नियंत्रण, और स्थिर रिकॉर्डिंग की वृद्धि हुई. इन फायदों के अलावा मानक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना और पैच दबाना तकनीक से इस तकनीक की स्थापना की. विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत मुश्किल है हालांकि सिस्टम अनुकूलित किया गया है एक बार, बहुत कुछ समस्याएँ उत्पन्न होती है. यह सोडियम (हंै वी 1.5) और अन्य तेजी से सक्रिय करने चैनलों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है.
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम V1 इलेक्ट्रोड के साथ oocyte और कोंचना पर शीर्ष चैम्बर की नियुक्ति कर रहे हैं. सेल और चैम्बर छेद के किनारों के बीच सील की तंगी रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता पर काफी प्रभाव पड़ता है. शीर्ष चैम्बर उच्चतम संभव पुनः प्राप्त करने के लिए सेल पर नीचे धक्का दे दिया जाना चाहिएoocyte को नुकसान पहुँचाए बिना विरोध. इस oocyte उभार बनाने की आवश्यकता होती है और समतल है, लेकिन सेल गुणवत्ता के अनुभव और विचार टूटना को रोकने के लिए इष्टतम दबाव निर्धारित करने की जरूरत है होगा. फास्ट रिकॉर्डिंग लगातार सेल को नुकसान पहुँचाए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है कि सबसे बड़ी संभव पिपेट उद्घाटन के उपयोग की आवश्यकता है. विशेष ध्यान पिपेट टिप डाला जाता है के रूप में काफी घाव का विस्तार करने के लिए पर्याप्त नहीं उथले होना चाहिए जो पिपेट की घटना के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. कोंचना तुरंत झिल्ली संभावित पढ़ने की उपस्थिति पर इलेक्ट्रोड उन्नति रोक, धीरे धीरे और धीरे से किया जाना चाहिए.
Oocyte झिल्ली को नुकसान और सही oocyte / चैम्बर जवानों से भी कम उच्च रिसाव धाराओं को जन्म दे सकता है. उच्च रिसाव धाराओं हमेशा रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता खराब. इस प्रकार, रिकॉर्डिंग हमेशा कम रिसाव धाराओं (अधिमानतः <150-200 ना) होना चाहिए. एम्पलीफायर का मुआवजा सर्किट, पी / एन ऑनलाइन रिसाव सह का उपयोगrrection, या बंद लाइन प्रक्रियाओं रिसाव वर्तमान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं.
समस्या निवारण आम तौर पर समस्याओं के अधिकांश हल करेंगे जो सभी घटकों को सही ढंग से संलग्न या समायोजित कर रहे हैं कि डबल जाँच, से शुरू करना चाहिए. तैयारी और प्रयोग के दौरान ही, विशेष ध्यान देने की किसी भी गिरा या बह निकला तरल पदार्थ के स्तर को भुगतान किया है और इन विद्युत पृथक हो लिए हैं कि डिब्बों कनेक्ट कर सकते हैं के रूप में KCl सघन किया जाना चाहिए. प्रणाली अप्रत्याशित रूप से व्यवहार करती है, पुलों और कोठरियों के बीच लापता या अवांछित कनेक्शन के लिए जाँच करें. एयर अगर पुल के छोर पर, अगर पुलों के भीतर बुलबुले, या सेल नीचे फंस भी पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है कि कनेक्टिविटी समस्या पैदा कर सकता है.
संशोधन, ऊपर वर्णित है, COVG के साथ वोल्टेज दबाना fluorometry (वीसीएफ) प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं. मुख्य संशोधन एक बदल स्नान डिजाइन का उपयोग शामिल है. एक पानी में विसर्जन 40x उद्देश्य का उपयोग समायोजित करने के लिएमाइक्रोस्कोप पर, ऊपरी सदन स्नान यह एक मानक कटौती खुला स्थापना के लिए की आवश्यकता होगी से बड़ा होना चाहिए. अन्य पहलुओं और COVG मोड में वीसीएफ रिकॉर्डिंग के उपकरण की जरूरत है दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना मोड 14 में वीसीएफ रिकॉर्डिंग के समान हैं. पहले पर बल दिया, COVG तकनीक का मुख्य लाभ यह स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति सिस्टम में पाया जा सकता है की तुलना में कहीं अधिक आयन चैनल व्यक्त करता है कि एक झिल्ली पैच में TEVC की तुलना में बहुत तेजी से और सही वोल्टेज नियंत्रण है. इस प्रकार, तकनीक VCF और उच्च अस्थायी समाधान और उच्च चैनल संख्या दोनों detectable संकेत के लिए आवश्यक हैं जहां मौजूदा अध्ययनों gating के लिए आदर्श है.
सिद्धांत रूप में अतिरिक्त और intracellular दोनों समाधान एक्सचेंजों संभव हो रहे हैं हालांकि, मुद्रा की अपनी पूर्णता और गति प्रयोगों के कुछ प्रकार पर कुछ सीमाएं निर्धारित किया है. चित्रा 5, कोशिका द्रव्य और कम चाम के बीच ईओण सांद्रता के संतुलन की दर में दिखाया गया हैप्रासंगिकता काफी धीमी सैपोनिन permeabilization पीछा कर रहा है. ईओण सांद्रता बदलने से इसलिए एक स्थिर अवस्था में पहुंचने से पहले सेल को लंबे प्रयोगों के दौरान विचार किया जाना चाहिए. एक्सचेंज शर्तों के आधार पर काफी हद तक भिन्न हो सकते हैं. उच्च चैनल अभिव्यक्ति, बड़ी प्रेरणा शक्ति, और तेजी से दरों में उच्च तापमान परिणाम. हमारे प्रयोग में सेल 19 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया गया था, चैनल अभिव्यक्ति उदारवादी था, और चतुर्थ प्रोटोकॉल द्वारा संचालित शुद्ध प्रभारी बदलाव के कारण वर्तमान दिशा के लिए कम से कम था. इन स्थितियों में सामान्य COVG तकनीक विभिन्न पैच दबाना विन्यास को नीचा है. Cytoplasmic माध्यम के त्वरित प्रतिस्थापन की आवश्यकता COVG अनुप्रयोगों के लिए एक छिड़काव प्रवेशनी इस्तेमाल किया जा सकता है. भविष्य में, निर्मित में छिड़काव बंदरगाहों के साथ बनाया गया COVG कक्षों कोशिकी समाधान के आदान विशेषताओं पर बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति दे सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
सभी सेंट लुइस कार्डिएक आण्विक इंजीनियरिंग लैब में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के सदस्य हैं. एक Burroughs वैज्ञानिक इंटरफेस पर फंड कैरियर पुरस्कार में आपका स्वागत है - 1010299 (जे एस के लिए).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F.
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , Wiley-VCH. (2006).
- Susan, G. A. Methods in enzymology. 296, Academic Press. 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N.
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf (1999).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R. Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).
