Summary
Схема питания в Дрозофилы личинок служит простой, но мощный модель, которая позволяет изменения в скорости подачи, коррелирует с изменениями в стоматогастральных нервной схемы. Эта схема состоит из нейронов центральной серотонинергической, которые посылают проекции к устью крючков, а также передней кишки.
Abstract
Схема серотонинергической кормления в Дрозофилы личинок может быть использован для исследования нейронных субстратов решающее значение при разработке схемы. Использование функциональной выход схемы, кормление, изменения в нейронной архитектуры стоматогастральных системы могут быть визуализированы. Кормление поведение может быть записано, наблюдая скорость втягивания рта крючков, которые получают иннервацию от мозга. Поведение опорно-двигательного аппарата используется в качестве физиологического контроля для кормления, поскольку личинки использовать их рот крючки, чтобы пройти через агар субстрата. Изменения в пищевом поведении может быть соотнесена с аксонов архитектуры невриты, иннервирующих кишечник. Использование иммуногистохимию можно визуализировать и количественно эти изменения. Неправильное обращение с личинками во поведения парадигм может изменить данные, как они очень чувствительны к манипуляциям. Правильное томография аксонов архитектуры иннервирующихкишка имеет решающее значение для точного количественного определения количества и размера варикоз, а также от степени узлов ветвления. Анализ большинства схем позволяют только для визуализации аксонов архитектуры или поведенческих эффектов, однако, эта модель позволяет соотнести функциональную выход схемы с нарушениями нейронов архитектуры.
Introduction
Дрозофилы является чрезвычайно мощным модельной системой для изучения развития нервной цепи из-за времени быстрое поколения, низкий экспериментальной стоимости, а также возможность манипулировать и контролировать генетических и экологических факторов. Нейрогенез, нейронов вывод путь и синаптогенез сохраняются между людьми и дрозофилы, поэтому механизмы в создание, поддержание и изменение нейронных цепей сохраняются также.
Классические нейротрансмиттеров, таких как серотонин (5-гидрокситриптамин, или 5-НТ) может служить в качестве факторов роста, прежде чем принимать их роли в качестве сигнальных молекул в зрелой нервной цепи 1-3 Предыдущие исследования показали, что возмущенные уровни 5-HT во время эмбриогенеза изменить связность зрелых нейронов 4. Другие показали, что эктопической применение 5-НТ в культивируемых нейронах Helisoma подавлять рост нейритов, а также синаптогенез 5-7. В Drosophila, с развитием уровни 5-НТ обратно пропорциональны числу варикозной и размера, а также от степени aborization, вдоль длины нейритов, выступающих в передней кишки от ЦНС 8.
Нейротрансмиссии серотонина, как было показано, чтобы модулировать кормления поведения в различных видов, включая Drosophila 8-9. Схема подачи у дрозофилы является относительно простая схема, которая может быть использована в качестве модели для корреляции функциональную выход (подачи) с изменениями в развитии аксонов прогнозов от мозга к передней кишки. Schoofs др.. показали, что дрозофилы питания личинок регулируется центральными генераторами шаблонов, которые влияют на мускулатуру 10. Хотя конкретный мышечная анатомия не совсем понял, было показано, что усиков нерв, верхнечелюстной нерв, и переднегрудной добавочный нерв отвечает за мышечных целей, участвующих впищевого поведения. Большинство данных, связанные с мускулатуры и нервных анатомию беспозвоночных кормления ограничивается Calliphora личинок.
Скорость подачи второй личинок возрастной стадии можно оценить с помощью втягивания в cephalopharyngeal склеритов (рот крючков), и является воспроизводимым и высокой пропускной. В cephalopharyngeal пластины иннервируются волокнами из центральных нейронов 5-НТ с помощью фронтальной нерва. Железистого или передней кишки, иннервируется серотонергических волокон (recurrens нерв), что расположенный пучком в средней кишке и несут ответственность за сокращениями передней кишки (рис. 1) 11-12. Изменения в аксонов разветвления, а также количество и размер варикоз по длине аксонов, могут быть количественно с помощью иммуногистохимических методов. Манипулирование нейронов 5-НТ в процессе разработки, прямо или косвенно, может изменить функциональное вывод этой схемы питания, которые могут быть осмотрены и коррелирует с изменениями в morpholoGY архитектуры нейритов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Поддержание Клетки населения
- Поддерживать клетки населения при 25 ° С на 12 ч цикле свет-темнота. Пока контрольные и экспериментальные группы подвергаются воздействию тех же условиях освещения, то эта методика может быть выполнена в стандартном лабораторных условиях.
- Разрешить самки откладывают яйца на ночь на яблочный сок-пластин агара.
- Сбор вновь выведенных личинок, поддерживая пластины с недавно депонированных яиц при 25 ° С в течение 24 часов. Нанесите небольшое ложку дрожжей в центре пластины, чтобы привлечь вылупившихся личинок.
- Сбор 1-й стадии личинок, которые мигрировали в дрожжевой пастой в центре яблочного сока пластины. Используйте металлический шпатель, чтобы перенести его на свежий яблочный сок пластины. Дополнительная дрожжи пасты могут быть добавлены, чтобы обеспечить есть достаточное питание, пока анализы не выполняются. Сок пластины виноградные также может быть использован вместо сока пластин яблони.
- Получить конце 2-й-в начале 3-й возрастной стадии лarvae, позволяя 1-й возрастов возраста для 40-48 часов. В пределах этого диапазона ставки подачи постоянны 13. Возраст может быть подтвержден путем исследования рот крючки, поскольку есть отчетливые изменения в этой структуре с каждым личиночной линьки.
- В конце 2-й-в начале 3-й стадии личинок собирают для поведения анализов, осторожно и тщательно мыть сок пластины яблоко водой и сбор личинок на сетчатый фильтр. Затем личинки переносили в чашки с агаром.
- Все анализы выполняются параллельно, используя контроль и экспериментальных животных.
2. Поведенческая парадигма - Передвижение
- Поместите одну 3-й возрастной стадии личинки на 2% агара в подложке 100 мм блюдо культуры ткани и позволит личинка акклиматизироваться в течение 30 сек. Личинки использовать свои cephalopharyngeal склериты (рот крючки), чтобы продвинуть свои тела по поверхности агара подложки. Это делается на отдельной тарелке, потому что ят сложнее визуализировать сокращения тела в дрожжевой раствор, как животное почти такой же цвет, что и дрожжей.
- Проверяют и записывают каждый кзади от движения переднего над подложкой в течение 1 мин. N = 20 для каждого генотипа. Не более 10 животных следует анализировать за тарелку.
3. Поведение Парадигма - Кормление
- Использование тупых Inox # 5 пинцет, тщательно передачи 3-й возрастной стадии личинки от опорно-двигательного агаром к центру агар заполненные пластины обложил 5 мл раствора дрожжей 2% активированного пекаря. Убедитесь, что решение является однородным, как дрожжи осядут в течение долгого времени. Когда в дрожжевой раствор, личинки во многом будет оставаться на месте и кормов, облегчая наблюдение за поведением. Скорость рта крючок сокращений прямо коррелирует с количеством проглоченной пищи 14.
- Разрешить личинка, чтобы акклиматизироваться в течение 30 сек.
- Проверяют и записывают количестворот крюк сокращения сроком на 1 мин. N = 20 для каждого генотипа.
4. Личиночные Gut Вскрытия
- Сделайте 4% ЭМ-класса формальдегида фиксации решение в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) и место в спот стекла 3-а.
- Тщательно рассекать из блуждающих поздно 3-й возрастной стадии личинок кишки в стеклянной посуде 3-а, используя решение 1x PBS, убедившись, что каждый раз, когда железистого остается нетронутой. С одной Forcep, удерживайте задним концом, а другой, удерживая рот крючки. Удерживая задний конец неподвижно, осторожно потяните на рот крючки для получения доступа к кишках. Удалите все связанные ткани (слюнные железы, головного мозга, жира тела, и т.д.), а затем перенести каждый кишку к блюду 3-а, содержащего формальдегид исправить. Бродя 3-е взрослой личинки используются, потому что на данном этапе развития, личинка перестает кормления в рамках подготовки к pupariation и железистого очищается от дрожжей. <Li> Инкубировать кишки при 4 ° С в течение ночи в культуральной поле непрозрачной ткани.
- Перед удалением формальдегида фиксации решение из колодцев, удалите желудка слепых кишок и клип в кишки ~ 150 мкм 2 из железистого, так что прогнозы явно можно рассматривать беспрепятственно.
- Удаление формальдегида исправление из лунок и заменить 1x PBT (1х PBS, 0,1% протеазы, свободной от бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Тритон Х-100) буферного раствора. Тщательно вымойте кишки 6x в течение 10 мин в 1x PBT. Поместите образцы ткани на механическом ротатора делая моет.
- Инкубируют при 4 ° С в течение 1 часа в 10 -6 м 5-НТ для повышения серотонина сигнализации. Тщательно вымойте кишки 6x в течение 10 мин в 1x PBT. Предыдущие исследования показали, что эта концентрация экзогенного 5-HT не влияет нейронов архитектуру или плотность варикоз в иммуногистохимических анализов и просто усиливает сигнал-шум 15-16.
- Инкубировать при температуре 4 &# 176; С в течение ночи в анти-серотонина первичного антитела (моноклональные вырос в мыши или поликлональных вырос в кролика). Тщательно вымойте кишки 6x в течение 10 мин в 1x PBT. Поместите образцы ткани на механическом ротатора делая моет.
- Инкубируют при 4 ° С в течение 90 мин в вторичным антителом (Alexa Fluor 568 козьего антитела против мышиного или анти-IgG кролика; разведение 1:400). Тщательно вымойте кишки 6x в течение 10 мин в 1x PBT. Поместите образцы ткани на механическом ротатора делая моет.
- Инкубировать в 4 мМ карбоната натрия в течение 10 мин на механическом ротатора, а затем смонтировать в 4% н-пропил gallate/20 мМ карбоната натрия, и вид под флуоресценции. Карбонат натрия используется для преобразования образцов в буфер и рН используемой в mountant СМИ.
- Захват изображения образцов иммуноокрашиванию ткани в 400-кратном увеличении для анализа.
5. Анализ нервной схемы
- Нейрита волокна были количественно (число и размер варикози степень разветвленности) с помощью Neuroleucida и Neuroexplorer. Однако, это также может быть достигнуто вручную или с помощью простого нейрита Tracer (бесплатное приложение, которое можно скачать в Интернете).
- Проследите индивидуальные прогнозы волокна от мозга к железистого и количественно варикоз номер, филиалы и ряд крупных варикоз на единицу длины. Аксонов волокна, выступающие из мозга сгруппированы в recurrens нерва и не доступны для анализа пока они не достигнут железистого где они отделить и расположенный пучком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема серотонинергической кормления в личинки дрозофилы может служить чрезвычайно эффективной модели для наблюдения за влияние отдельных факторов на развитие нервной системы. По количественного скорость подачи, можно связать аксонов архитектуру схемы подачи с его функционального выхода (рис. 1). Опорно-двигательного аппарата анализ используют в качестве физиологического контроля для отводов рта крючков, поскольку личинки использовать их рот крючки чтобы продвинуть себя по всей поверхности агара. Там должно быть никакой разницы в ответах опорно-двигательного аппарата между контролем и мутантных генотипов если мутации затрагивают только цепь, питающая 8 (рис. 2а). Если существенные различия имеют место, можно личиночной поведение был скомпрометирован в результате неправильного обращения. Если личинки остановка во время теста, чтобы попытаться прятаться через агар подложки, они могут быть слишком стар, и, вероятно, переход на блуждающих возрастов.Кроме того, можно агар подложка может быть слишком сильно, что затрудняет для личинок рот крючки, чтобы захватить агара подложки; эту проблему можно решить путем смачивания поверхность агара.
Этот анализ может быть использован для оценки влияют ли штаммы Drosophila с нейрональных анатомических дефектов развитие цепи серотонинергической подачи. Мутантный тело эллипсоид открыт (EBO 3) имеет структурный дефект в эллипсоида орган центральной комплекса. Сравнение с дикого типа родительского Кантон-S деформации, CS Ву, показывает, что эти анатомические дефекты во результате развития мозга в подавленном кормления во время передвижения не влияет (рис. 2В).
Анатомические дефекты Ebo 3 мутанты появляются, чтобы изменить развитие аксонов архитектуры кишечнике. Рисунок 3 показывает изменения в архитектуре волокна в личинок ком EBO 3красный с CS ву; эти личинки отображения увеличение ветвления, а также увеличение количества малых и больших варикоз по длине аксонов. Обратите внимание на узлы ветвления (стрелки), варикозов (наконечники стрел), и большие варикоз (звездочки). Рисунок 4 представляет собой количественное определение этих образов.
Правильное определение количества аксонов архитектуры требует, чтобы изображения быть предельно ясно. 5А представляет собой образ, соответствующий для анализа. Изображения низкого качества будет трудно провести различие между волокном и варикоз (рис. 5б). При съемке архитектуры волокна, избегать изображения, в которых выступы на переднем из железистого, так как волокна плотно комплекте и отделяющие друг от друга и могут появиться, как будто они разветвленными. Еще задние волокна в средней кишке более разветвленной, потому что они расположенный пучком, как только они повторно в течение этой ткани. Количественное определение числа ветвей и варикозной и размера варикоз, могут быть проанализированы вручную или с помощью программы, предназначенной для С целью изучения нейритов морфологию, например, Neuroleucida. Пока железистого не поврежден во время иммуногистохимического протокола, и изображение в фокусе, препараты будет приемлемо для визуализации и анализа. Если архитектура волокно явно отличается от фона, и если отдельные варикоз могут быть идентифицированы по длине нейритов, препарат подходит для анализа. Кроме того, если индивидуальные варикоз могут быть идентифицированы от остальной части волокна, это еще один показатель из качеством изображения для анализа. Все волокна анализируются за исключением тех, которые вне диапазона фокусировки (в некоторых случаях волокна будет кривой между несколькими плоскостями фокусе).
es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 1. Личиночная цепи питания. Филе из 3-й возрастной стадии личинки, показывая мозга и кишечника ткани (A). Gut ткани рассеченные с 3-м возрастной стадии личинок, связывающие антитела, поднятые против Drosophila нейронов триптофангидроксилазы (DTRH, В) или 5-НТ ( С). A, B. E, пищевода; Mh, рот крючки; Pr, железистого, Br мозга (обратите внимание на рисунок 5-НТ нейронов). Arrowhead обозначает лобовой нерв; стрелка, recurrens нерва в.. железистого показывая аксональные волокна (наконечники стрел). Шкала бар = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
<бр /> Рисунок 2. Анатомические дефекты во время результатов в области развития мозга в подавленном пищевого поведения. Животных анализировали на опорно-двигательного аппарата (А) и кормов для поведения (B). Передвижение не пострадал. N = 20 для каждого поведенческого теста, из 2-3 независимых экспериментов. **** Р <0,0001, непарный т-тест. Линии выше графике изображены стандартная ошибка среднего значения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Анатомические дефекты в процессе развития результатов ЦНС в аберрации в архитектуре кишки волокна. Гут ткани рассекают от 3-го возрастной стадии личинок и иммуноокрашиванию с анти-5-HT. Стрелка обозначает филиал узел. Arrowhead обозначает небольшой варикоз. Asterisk деотмечает большой варикоз. Шкала бар = 40 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Анатомические дефекты во результате развития мозга у аберрантной архитектуры кишки волокна. Анализ proventricular ткани из 3-й возрастной стадии личинок расчлененным и инкубировали с анти-5-НТ. Нейритов ветвления (А), общее количество варикоз на 0,1 мм длины аксонов (B) и ряда крупных варикоз (> 1 мкм 2) за 0,1 мм длины (C). CS Ву, 20 волокна из 17 кишки от 2 независимых экспериментов; Ebo 3, 20 волокон из 18 кишками из 3 независимых экспериментов. **** P <0,0001, ** р <0,01, * р <0,05, непарный ттоц Линии выше графике изображены стандартная ошибка среднего значения. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 5. Качество изображения является важным для правильного количественного архитектуры кишки волокна. Gut ткани рассеченные из CS Wu третьей возрастной стадии личинок и иммунологически окрашивали анти-5-НТ. (A). Хорошее качество изображения. (B). Плохое качество изображения. Шкала бар = 40 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ненормальная развитие серотонинергической стоматогастральных цепи, которое происходит во время позднего эмбриогенеза, повлияет на его зрелый функцию. Изменения в архитектуре невритного иннервирующих кишечник можно соотнести с функциональной выходе схемы, которая скорость подачи (измеряется рта крючок сокращений в растворе дрожжей) (рис. 1). Использование двудольного системы UAS-Gal4 у дрозофилы делает возможным специально направлены вверх или вниз регулируется экспрессию данного транскрипта к конкретной ткани, изменения в экспрессии данного белка может быть точно количественно при соответствующих инструментов. Этот метод может быть использован для выяснения области мозга, и даже нейронные подмножества, необходимые для развития конкретного нейронной цепи.
Опорно-двигательного аппарата анализ используют для подтверждения того, что личинки не иначе физиологически угрозу, поэтому личинки с 40 стенки тела сокращений или менее шоULD быть исключены из анализа (рис. 2а). Это может произойти либо потому, что генотип вызывает физические отклонения, или потому, что отдельные животные были ранены во время обработки. Кроме того, температура в помещении, в котором выполняется анализ необходимо контролировать, так как холодные или более высокие температуры могут повлиять данные. Рекомендуется выполнять эту поведения анализа между 24-26 ° С. В дни, когда температура комнату тестирования холоднее, агар имеет тенденцию затвердевать, поэтому повторное увлажнение чашки с агаром будет необходимо после каждого локомотива анализ завершен, чтобы обеспечить агар достаточно мягким. Важно держать агар пластины для передвижения Moist (не мокрой), с тем чтобы личинки путешествовать по поверхности, а также предотвратить их от рытья. Более низкие температуры также повлиять на производительность личинок на агар подложки, как личинки, как правило, путешествия к льготных температурах (24-26 ° С) 17-18. Nо более чем 10 животных следует анализировать за тарелку, и отказаться от любых тарелку с проколами в агар подложки.
При выполнении подачи анализа, важно знать, что дрожжи подвеска будет располагаться в течение долгого времени, Вихревой дрожжей на тарелке обеспечивает дрожжи остается гомогенной анализа. Ограниченная видимость из рта крючков может произойти, если дрожжи раствор становится слишком концентрированным. Здоровый личинки помещают в договоре дрожжей СМИ их рот крючки примерно 150-170 раз в мин, снижение подачи может быть по цене от 120, а верхний предел диапазон 210.
При выполнении иммуногистохимическое протокол, имеет смысл immunostain как контроль и образцы экспериментальных тканей параллельно для обеспечения аналогичного качества образцов ткани. Иммунофлуоресценции из аксонов архитектуры иннервирующих кишечника может быть повышена путем инкубации образцов тканей в первичных антител в течение ночи при 4 ° С. Инкубационный ое антитела при 4 ° С улучшает отношение сигнал-шум (рис. 5). Качество изображений очень важно, так как это имеет решающее значение для точного количественного определения архитектуры волокна (рис. 3), чтобы выявить изменения в ветвление и число варикоз и размер (рис. 4). Качество образцов ткани могут быть уничтожены, если ротатор использоваться во время мытья периоды нагревается в любой точке от постоянного использования. Хотя визуализации образцы тканей убедитесь, что не оставляют образцы под микроскопом света слишком долго, поскольку это приведет к снижению иммунофлюоресценции образцов, не только в текущий момент под фокусом, но окружающие образцов, а также. Анализ архитектуры волокна могут быть легко завершены с помощью программного обеспечения, но все еще может также быть выполнена вручную. Классификация малых и больших варикоз см. площади варикоз, варикозов измерения более 1 мкм 2, классифицируются как крупных варикоз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность исследовательский фонд Президента от Сент-Луиса, присужденную БСС
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
References
- Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. Why do neurotransmitters act like growth factors? Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Neurotransmitters and neuromodulators during early human development. Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sodhi, M., Sanders-Bush, E.
- Goldberg, J., Kater, S. Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system. Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).
- Goldberg, J. Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis. Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).
- Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons. Sci. 226, 561-564 (1984).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.
- De Vry, J., Schreiber, R. Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).
- Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).
- Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae. J. Morphol. 269, 272-282 (2008).
- Neckameyer, W. S., Bhatt, P. Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster. Biomed Cent NeuroSci. 13, 26 (2012).
- Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste. Genet. Res. 24, 163-173 (1975).
- Joshi, A., Mueller, L. Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection. Evolution. 42, 1090-1093 (1988).
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sykes, P., Condron, B. Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system. Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- McKemy, D. D.
