Summary
キイロショウジョウバエの幼虫での給電回路は、供給速度の変化は口と胃の神経回路の変化と相関することを可能にする、シンプルでありながら強力なモデルを提供しています。この回路は、口のフックに予測だけでなく、腸を送信中枢セロトニン作動性神経細胞で構成されている。
Abstract
キイロショウジョウバエの幼虫におけるセロトニン給電回路は、回路の開発時に非常に重要でのニューロンの基板を調査するために使用することができる。回路の機能出力を用いて、供給は、口と胃の神経系のアーキテクチャの変更を可視化することができる。摂食行動は、脳からの神経支配を受ける口のフックの後退速度を観察することによって記録することができる。幼虫は寒天基板全体横断する彼らの口のフックを使用しているため、運動の様子は、供給のための生理学的対照として使用する。摂食行動の変化は、神経突起の軸索アーキテクチャと相関させることができる腸を支配する。免疫組織化学を使用すると、これらの変化を視覚化し、定量することができる。彼らは操作に非常に敏感であるように行動パラダイム中の幼虫の不適切な取り扱いは、データを変更することができます。神経突起アーキテクチャ神経支配の適切なイメージング腸は、正確な静脈瘤の数とサイズの定量と同様にブランチノードの範囲のために重要である。ほとんどの回路の解析は神経突起のアーキテクチャや行動への影響の視覚化を可能にするが、このモデルでは、1が神経アーキテクチャの障害を持つ回路の機能出力を相関させることができます。
Introduction
ショウジョウバエは、急激な世代時間、低実験コスト、遺伝的要因と環境要因を操作し、制御する能力に神経回路の発達を研究するための非常に強力なモデル系である。神経発生、神経の経路検索やシナプス形成は、ヒトとショウジョウバエの間で保存されるため、作成、維持し、神経回路を変更することでのメカニズムも 同様に保存されている。
例えば、セロトニン（5 -ヒドロキシトリプタミンまたは5-HT）のような古典的な神経伝達物質は、成熟した神経回路1-3のシグナル伝達分子としての役割を採用する前に、成長因子として機能することができる 以前の研究は、成熟ニューロン4の接続性を改変胚形成の間に5-HTのレベルを摂動が示されている。その他、培養Helisomaニューロンへの5-HTの異所性アプリケーションが神経突起伸長だけでなく、シナプス形成5-7を抑制することが示されている。 Dではrosophilaは、発達5-HTレベルは逆CNS 8から前腸内に突出した神経突起の長さに沿って、静脈瘤の数およびサイズ、ならびにaborizationの程度に関連している。
セロトニン作動性神経伝達は、 ショウジョウバエ 8-9を含む、多様な種における摂食行動を調節することが示されている。 ショウジョウバエの給電回路は、前腸から脳への軸索突起の発達における変化と機能的出力（摂食）を相関させるためのモデルとして使用することができる比較的簡単な回路である。 Schoofs ら 。 ショウジョウバエ幼虫の摂食を筋肉組織10に影響を与える中枢パターン発生器によって調節されることが示されている。特定の筋肉の解剖学が完全に理解されていないが、それは触角神経、上顎神経、および前胸腺副神経はに関与して筋肉の目標に責任があることが示されている摂食行動。無脊椎動物の供給の筋肉と神経解剖学を含むほとんどのデータはオオクロバエ幼虫に制限されています。
二齢幼虫の供給速度は、咽頭骨片（口フック）の後退によって評価され、再現性があり、高スループットであることができます。咽頭プレートは前頭神経を介して中央5-HTニューロンからの繊維によって神経支配されています。前胃、または腸は、腸内束生のと（ 図1）11 月12日前腸の収縮に関与しているセロトニン作動性線維（神経をrecurrens）によって支配されている。軸索分岐の変化、神経突起の長さに沿った静脈瘤の数及び大きさは、免疫組織化学法を用いて定量することができる。直接的または間接的に、開発中に5-HTニューロンを操作する、morpholoの変化で評価し、相関させることができるこの給電回路の機能的出力を変更することができ神経突起アーキテクチャのGY。
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Protocol
1。人口ケージのメンテナンス
- 12時間の明暗サイクルで25℃、人口のケージを維持する。限り、対照群と実験群は、同一の照明条件にさらされているように、この技術は、標準的な実験室の設定で行うことができる。
- 女性はリンゴジュース寒天プレート上で一晩卵を産むことができます。
- 24時間25℃で、新たに堆積した卵でプレートを維持することにより、新たに孵化した幼虫を収集します。孵化した幼虫を引き付けるために、プレートの中央に酵母の小さなほんの少し加え配置します。
- リンゴジュースプレートの中央に酵母ペーストに移行した1 回目の幼虫を収集します。新鮮なリンゴジュースプレートに転送する金属ヘラを使用してください。付加的な酵母ペーストはアッセイを実施するまで十分な食料があることを確認するために添加することができる。グレープジュースプレートは、リンゴジュース板の代わりに使用することができる。
- 後半2 番目の早第3齢Lを得る1 STは 40〜48時間熟成させることによって、齢arvae。この範囲内での供給率は、13の定数である。各幼虫の脱皮と、この構造体の明確な変化があるように、年齢は、口のフックを調べることにより確認することができる。
- 後半2 番目の早第3齢幼虫を静かにかつ広範囲に水とリンゴジュースのプレートを洗浄し、メッシュフィルターに幼虫を収集することにより、行動分析のために収集されます。幼虫は、その後、寒天プレートに移す。
- すべての分析は、対照および実験動物を用いて並行して行われる。
2。行動パラダイム - ロコモーション
- 100mmの組織培養皿の中で2％寒天基板上に単一の第3齢幼虫を置き、幼虫を30秒間順応することを可能にする。幼虫は、寒天、基板の表面全体に自分の体を推進するために彼らの咽頭骨片（口フック）を使用します。これは、別のプレート上で行われますので、私tは、動物、酵母とほぼ同じ色であるように酵母溶液に本体の収縮を可視化することはより困難である。
- 1分の間、基板の上に前方運動に各後部を観察し、記録します。 N =各遺伝子型のための20。これ以上の10以上の動物がプレート当たり、アッセイされるべきである。
3。行動パラダイム - 給餌
- 鈍イノックス＃5ピンセットを使用して、慎重に2パーセント活性化し、パン酵母溶液5mlを重層した寒天で満たされたプレートの中央に運動寒天プレートから第3齢幼虫を移す。酵母は時間をかけて定着するように溶液が均一であることを確認してください。際に酵母液に、幼虫は主に行動の観察が容易に場所や餌のままになります。口のフック収縮の速度を直接14を摂取した食物の量と相関する。
- 幼虫は、30秒間順応することができます。
- の数を観察し、記録する1分の間、口のフックの収縮。 N =各遺伝子型のための20。
4。幼虫ガットの解剖
- 3ウェルのスポットガラス1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で所定の位置に4％のEMグレードホルムアルデヒド固定液を作る。
- 慎重に前胃がそのまま残されていることを確認するたびに作り、1×PBS溶液を使用した3ウェルガラス皿に遅い第3齢幼虫の根性をさまよううち解剖。 1鉗子で、後端を保持し、相互に、口のフックを保持します。後端不動を押さえながら、ゆっくりと根性にアクセスするために口のフックを引っ張る。関連する組織（唾液腺、脳、脂肪体など ） を削除してから、ホルムアルデヒド修正を含む3ウェルディッシュに各腸を転送します。 第3齢幼虫を徘徊しているため、開発のこの段階で、幼虫はpupariationの準備のために供給することを中止使用されており、前胃は酵母のクリアされます。 <李>不透明な組織培養ボックス中で一晩4℃で根性をインキュベートする。
- 井戸からのホルムアルデヒド固定液を除去する前に、胃の盲腸を削除し、突起がはっきりと支障なしで見ることができるように、前胃から〜150μmの2中腸をクリップ。
- 井戸からのホルムアルデヒドの修正を削除し、1X PBT（1X PBS、0.1％のプロテアーゼフリーウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100）の緩衝液と交換してください。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
- セロトニンシグナリングを強化するために10 -6 Mの5-HTで1時間、4℃でインキュベートする。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。以前の研究は、外因性5-HTのこの濃度は、免疫組織化学分析におけるニューロンアーキテクチャまたは静脈瘤密度に影響を与えないことを実証し、単に雑音比15-16に信号を増強している。
- 4でインキュベートする＆＃176;で一晩抗セロトニン一次抗体（マウスまたはウサギで産生されたポリクローナル育ちモノクローナル）であった。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
- （; 1:400希釈のAlexaフルーア568ヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG）を二次抗体での90分間4℃でインキュベートする。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
- 4％n-プロピルgallate/20 10mMの炭酸ナトリウムでマウントし、蛍光の下で表示して、機械的な回転装置上で10分間4 mMの炭酸ナトリウムでインキュベートする。炭酸ナトリウムを封入媒体に使用される緩衝液およびpHにサンプルを変換するために使用される。
- 分析のための400倍の倍率で免疫染色組織サンプルの画像をキャプチャします。
5。神経回路の解析
- 神経繊維は、静脈瘤の（数とサイズを定量化したと分岐度）NeuroleucidaとNeuroexplorerを使用。しかしながら、これは、手動で達成または簡易神経トレーサ（オンラインでダウンロードすることができる無料のアプリケーション）を使用してすることができる。
- 前胃に脳からの個々の繊維投影をトレースし、静脈瘤番号、支店および単位長さ当たりの大静脈瘤の数を定量化する。脳から突出する軸索繊維がrecurrens神経にバンドルし、彼らは分離前胃と束生のに到達するまで、分析のためにアクセスできません。
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Representative Results
ショウジョウバエの幼虫におけるセロトニン作動性供給回路は、神経系の発達上の特定の要因の影響を観察するには極めて有効なモデルとして機能することができます。供給速度を定量することにより、その機能の出力（図1）と給電回路の軸索アーキテクチャをリンクすることができる。幼虫は、寒天の表面を横切ってそれ自体を推進するために、口のフックを使用するので運動アッセイは、口のフックの撤回用生理対照として使用する。変異が唯一の給電回路8（図2A）に影響を与える場合、コントロールと変異遺伝子型の間運動応答に差があってはならない。有意な差が発生した場合には、幼虫の行動が不適切な取り扱いによって危険にさらされた可能です。アッセイの間幼虫停止寒天基板を介して穴を掘るしようとするならば、彼らはあまりにも古い可能性があり、おそらく齢放浪に移行している。したがって、それが困難な幼虫の口のフックが寒天基板をつかむために作る、寒天基板はあまりにも難しい場合も可能であり、これは寒天表面を濡らすことによって対処することができる。
このアッセイは、神経解剖学的欠陥を有するショウジョウバエ株はセロトニン作動性給電回路の発達に影響を与えるかどうかを評価するために使用することができる。 オープン変異型楕円体が（EBO 3）中央の複合体の楕円体に構造的な欠陥を持っています。野生型の親のカントン-S株、CS 呉との比較は、これらの解剖学的な欠陥が押さ摂食脳の発達の結果の間に移動します（図2B）影響を受けている間ことを明らかにしている。
EBOでの解剖学的な欠陥3の変異体は、腸の神経突起のアーキテクチャの開発を変更することが表示されます。 図3は、EBO 3幼虫のCOMPA内の繊維構造の変化を示しているCS 呉と赤、これらの幼虫は、分岐の増加だけでなく、神経突起の長さに沿って両方の小規模および大静脈瘤の数の増加が表示されます。ブランチ·ノード（矢印）、静脈瘤（矢頭）、大静脈瘤（アスタリスク）に注意してください。 図4は、これらの画像の定量化を表しています。
軸索のアーキテクチャを適切に定量化は、画像が非常に明確である必要があります。 図5（a）は解析のために適切なイメージを表しています。低品質のイメージはそれが困難な繊維と静脈瘤（図5B）とを区別するようになります。繊維構造を撮影すると、繊維がしっかりとバンドルされており、互いに分離され、それらが分岐しているかのように表示されることがあるため、前胃の前方の突起を含む画像を撮影しないようにします。彼らは一度束生のため腸内のより後方の繊維は、より分岐しているこの組織内で再。ブランチおよび静脈瘤の数、および静脈瘤の大きさの定量化は、手動で、または例えばNeuroleucidaなどの神経突起の形態を、研究するために設計されたプログラムを介して分析することができる。限り前胃を免疫組織化学プロトコル中に破損し、画像にフォーカスがされていないように、準備は、イメージングおよび分析のために許容されるものである。繊維構造は、明らかに背景から識別可能であり、個々の静脈瘤は、神経突起の長さに沿って同定することができれば、製剤は、分析のために適切である場合。個々の静脈瘤は、ファイバの残りの部分から識別することができる場合にも、これはまた、分析のための高品質の画像の他の指標である。全ての繊維は、その焦点の範囲（焦点の複数の面の間にいくつかのケースでは、繊維意志曲線）のうち、これらを除いて分析する。
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図1。幼虫給電回路。 第3齢幼虫から解剖腸組織は、ショウジョウバエのニューロントリプトファンヒドロキシラーゼ（DTRH、B）に対する抗体で免疫染色した。脳と腸の組織を示す第3齢幼虫（A）のフィレまたは5-HT（ C）A、B。 E、食道、MH、口のフック、PR、前胃、Brであり、脳（5-HTニューロンのパターンに注意してください）。アローヘッドは、前頭神経、である。、recurrens神経矢印C。前胃軸索繊維（矢じり）を示す。スケールバー=20μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
<BR /> 図2。押下摂食行動における脳の発達の結果の間の解剖学的欠陥を。動物を自発運動（A）及び摂食行動（B）についてアッセイした。運動は影響を受けなかった。 N = 2〜3回の独立した実験から、各行動の分析のための20、。 **** P <0.0001、対応のないt検定。グラフの上の線は平均値の標準誤差を示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。腸の繊維構造の収差におけるCNSの結果 第3齢幼虫から切開し、抗5-HTを用いて免疫染色。腸組織の開発中に解剖学的な欠陥 。矢印は、ブランチノードを示している。アローヘッドは、小さな静脈瘤を示している。アスタリスクデ大静脈瘤は指摘している。スケールバー=40μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。異常な腸の繊維構造中の脳の発達の結果の間に解剖学的な欠陥。proventricular組織の解析抗5-HTに切開し、インキュベート第3齢幼虫から。 0.1ミリメートルの神経突起の長さ（B）と大静脈瘤の数当たりの総静脈瘤の神経突起（A）分岐数（>1μmの2）は、0.1ミリメートルの長さ（C）の単位。 CS 呉 、2つの独立した実験から17根性から20繊維、EBO 3、3つの独立した実験から18根性から20繊維。 **** p <0.0001、**はp <0.01、*はp <0.05、不対TTグラフの上に年推定線は平均の標準誤差を示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図5。画像の品質は、腸の繊維構造を適切に定量化のために重要です。、CS 呉第三齢幼虫から切開し、抗5-HTを用いて免疫染色ガット組織。（A）。良い品質の画像。（B）。悪い品質の画像。スケールバー=40μmである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
後期胚形成時に発生するセロトニン作動口と胃の回路の異常な発展は、その成熟の機能に影響を与えます。神経突起のアーキテクチャの変更は、腸（酵母を溶液中に口のフック収縮によって測定される）速度を供給される回路の機能出力（図1）と相関させることができる支配する。 ショウジョウバエにおけるUAS-Gal4の二部系を用いることにより、特異的に特定の組織に与えられた転写物の上方または下方制御された発現を標的とすることができる。所与のタンパク質の発現の変化を正確に適切なツールが指定されて定量することができる。この技術は、脳領域、および特定の神経回路の発達に必要であっても、ニューロンのサブセットを解明するために使用することができる。
運動アッセイは、幼虫さもなければ生理学的に損なわれないことを確認するために使用されるので、40体壁の収縮以下証と幼虫ULDを解析し（図2A）から除外される。遺伝子型は物理的な異常が発生するため、または個々の動物が取り扱い中に負傷したため、これはどちらか発生する可能性があります。さらに、アッセイが行われている部屋の温度が低温またはより暖かい温度がデータに影響を与えることができるので、制御する必要がある。これは、24〜26℃の間で、この動作分析を実行することをお勧めします試験室の温度が冷たい日には、寒天が硬化する傾向があり、各機関車アッセイは、寒天が十分柔らかく確実にするために完了した後にそのため、寒天プレートの再湿潤が必要になります。これは、幼虫が表面を横切って移動すると、穴を掘るのを防ぐことを可能にするために歩行湿った（濡れていない）のための寒天平板にしておくことが重要です。幼虫は優遇温度（24〜26℃）17〜18に向かって移動する傾向があるので、より低い温度はまた、寒天、基板上に幼虫のパフォーマンスに影響を与える。 NO 10以上の動物がプレート当たり、アッセイ、および寒天基板中のパンクで任意のプレートを破棄しなければならない。
摂食アッセイを実施するときは、酵母懸濁液は時間をかけて定着することを認識することが重要である、プレート上の酵母の旋回は、酵母が検定を通じて均質なままで保証されます。酵母液があまりにも濃厚になると口のフックの減少視認性が発生する可能性があります。酵母培地契約毎分、口のフックがおおよそ150〜170倍に入れ、健康な幼虫は、低減供給は120と低くすることができ、範囲の上限は210である。
免疫組織化学プロトコルを実行する際には、組織試料の類似の品質を確保するために並行して対照および実験組織試料の両方を免疫染色することが賢明である。神経突起アーキテクチャ神経支配腸の免疫蛍光を4℃で一晩、一次抗体中で組織サンプルをインキュベートすることによって高めることができるインキュベーションOfは4℃で抗体は信号対雑音比（図5）が向上する。これは繊維構造の正確な定量を分岐して静脈瘤の数とサイズ（図4）における変化を明らかにする（図3）のために重要であるとして、画像の品質は、非常に重要である。洗浄期間中に使用される回転子が一定の使用から任意の時点で加熱する場合に組織サンプルの品質を破壊することができる。イメージしながら組織サンプルは、このサンプル、現在フォーカスの下に1が、同様に、周囲のサンプルだけでなく、の免疫が低下するようにあまりにも長い間、顕微鏡光の下でサンプルを残していないことを確認してください。繊維構造の分析は、容易にソフトウェアの助けを借りて完成させることができるが、依然として手動達成することができる。小規模および大規模な静脈瘤の分類は静脈瘤のエリアを参照して、1μm以上2を測定する静脈瘤は、大静脈瘤に分類される。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、WSNに授与セントルイス大学の学長の研究基金を承認したいと思います
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
References
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