幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ</i

サマリー

キイロショウジョウバエの幼虫での給電回路は、供給速度の変化は口と胃の神経回路の変化と相関することを可能にする、シンプルでありながら強力なモデルを提供しています。この回路は、口のフックに予測だけでなく、腸を送信中枢セロトニン作動性神経細胞で構成されている。

要約

キイロショウジョウバエの幼虫におけるセロトニン給電回路は、回路の開発時に非常に重要でのニューロンの基板を調査するために使用することができる。回路の機能出力を用いて、供給は、口と胃の神経系のアーキテクチャの変更を可視化することができる。摂食行動は、脳からの神経支配を受ける口のフックの後退速度を観察することによって記録することができる。幼虫は寒天基板全体横断する彼らの口のフックを使用しているため、運動の様子は、供給のための生理学的対照として使用する。摂食行動の変化は、神経突起の軸索アーキテクチャと相関させることができる腸を支配する。免疫組織化学を使用すると、これらの変化を視覚化し、定量することができる。彼らは操作に非常に敏感であるように行動パラダイム中の幼虫の不適切な取り扱いは、データを変更することができます。神経突起アーキテクチャ神経支配の適切なイメージング腸は、正確な静脈瘤の数とサイズの定量と同様にブランチノードの範囲のために重要である。ほとんどの回路の解析は神経突起のアーキテクチャや行動への影響の視覚化を可能にするが、このモデルでは、1が神経アーキテクチャの障害を持つ回路の機能出力を相関させることができます。

概要

ショウジョウバエは、急激な世代時間、低実験コスト、遺伝的要因と環境要因を操作し、制御する能力に神経回路の発達を研究するための非常に強力なモデル系である。神経発生、神経の経路検索やシナプス形成は、ヒトとショウジョウバエの間で保存されるため、作成、維持し、神経回路を変更することでのメカニズムも ​​同様に保存されている。

例えば、セロトニン（5 -ヒドロキシトリプタミンまたは5-HT）のような古典的な神経伝達物質は、成熟した神経回路^1-3のシグナル伝達分子としての役割を採用する前に、成長因子として機能することができる 以前の研究は、成熟ニューロン⁴の接続性を改変胚形成の間に5-HTのレベルを摂動が示されている。その他、培養Helisomaニューロンへの5-HTの異所性アプリケーションが神経突起伸長だけでなく、シナプス形成^5-7を抑制することが示されている。 Dではrosophilaは、発達5-HTレベルは逆CNS ⁸から前腸内に突出した神経突起の長さに沿って、静脈瘤の数およびサイズ、ならびにaborizationの程度に関連している。

セロトニン作動性神経伝達は、 ショウジョウバエ ^8-9を含む、多様な種における摂食行動を調節することが示されている。 ショウジョウバエの給電回路は、前腸から脳への軸索突起の発達における変化と機能的出力（摂食）を相関させるためのモデルとして使用することができる比較的簡単な回路である。 Schoofs ら 。 ショウジョウバエ幼虫の摂食を筋肉組織^10に影響^を与える中枢パターン発生器によって調節されることが示されている。特定の筋肉の解剖学が完全に理解されていないが、それは触角神経、上顎神経、および前胸腺副神経はに関与して筋肉の目標に責任があることが示されている摂食行動。無脊椎動物の供給の筋肉と神経解剖学を含むほとんどのデータはオオクロバエ幼虫に制限されています。

二齢幼虫の供給速度は、咽頭骨片（口フック）の後退によって評価され、再現性があり、高スループットであることができます。咽頭プレートは前頭神経を介して中央5-HTニューロンからの繊維によって神経支配されています。前胃、または腸は、腸内束生のと（ 図^{1）11 月12日}前腸の収縮に関与しているセロトニン作動性線維（神経をrecurrens）によって支配されている。軸索分岐の変化、神経突起の長さに沿った静脈瘤の数及び大きさは、免疫組織化学法を用いて定量することができる。直接的または間接的に、開発中に5-HTニューロンを操作する、morpholoの変化で評価し、相関させることができるこの給電回路の機能的出力を変更することができ神経突起アーキテクチャのGY。

プロトコル

1。人口ケージのメンテナンス

1. 12時間の明暗サイクルで25℃、人口のケージを維持する。限り、対照群と実験群は、同一の照明条件にさらされているように、この技術は、標準的な実験室の設定で行うことができる。
2. 女性はリンゴジュース寒天プレート上で一晩卵を産むことができます。
3. 24時間25℃で、新たに堆積した卵でプレートを維持することにより、新たに孵化した幼虫を収集します。孵化した幼虫を引き付けるために、プレートの中央に酵母の小さなほんの少し加え配置します。
4. リンゴジュースプレートの中央に酵母ペーストに移行した1 ^回目の幼虫を収集します。新鮮なリンゴジュースプレートに転送する金属ヘラを使用してください。付加的な酵母ペーストはアッセイを実施するまで十分な食料があることを確認するために添加することができる。グレープジュースプレートは、リンゴジュース板の代わりに使用することができる。
5. 後半2 ^番目の早^第3齢Lを得る1 ^STは 40〜48時間熟成させることによって、齢arvae。この範囲内での供給率は^、13の定数である。各幼虫の脱皮と、この構造体の明確な変化があるように、年齢は、口のフックを調べることにより確認することができる。
6. 後半2 ^番目の早^第3齢幼虫を静かにかつ広範囲に水とリンゴジュースのプレートを洗浄し、メッシュフィルターに幼虫を収集することにより、行動分析のために収集されます。幼虫は、その後、寒天プレートに移す。
7. すべての分析は、対照および実験動物を用いて並行して行われる。

2。行動パラダイム - ロコモーション

1. 100mmの組織培養皿の中で2％寒天基板上に単一の^第3齢幼虫を置き、幼虫を30秒間順応することを可能にする。幼虫は、寒天、基板の表面全体に自分の体を推進するために彼らの咽頭骨片（口フック）を使用します。これは、別のプレート上で行われますので、私tは、動物、酵母とほぼ同じ色であるように酵母溶液に本体の収縮を可視化することはより困難である。
2. 1分の間、基板の上に前方運動に各後部を観察し、記録します。 N =各遺伝子型のための20。これ以上の10以上の動物がプレート当たり、アッセイされるべきである。

3。行動パラダイム - 給餌

1. 鈍イノックス＃5ピンセットを使用して、慎重に2パーセント活性化し、パン酵母溶液5mlを重層した寒天で満たされたプレートの中央に運動寒天プレートから^第3齢幼虫を移す。酵母は時間をかけて定着するように溶液が均一であることを確認してください。際に酵母液に、幼虫は主に行動の観察が容易に場所や餌のままになります。口のフック収縮の速度を直接^14を摂取した食物の量と相関する。
2. 幼虫は、30秒間順応することができます。
3. の数を観察し、記録する1分の間、口のフックの収縮。 N =各遺伝子型のための20。

4。幼虫ガットの解剖

1. 3ウェルのスポットガラス1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で所定の位置に4％のEMグレードホルムアルデヒド固定液を作る。
2. 慎重に前胃がそのまま残されていることを確認するたびに作り、1×PBS溶液を使用した3ウェルガラス皿に遅い^第3齢幼虫の根性をさまよううち解剖。 1鉗子で、後端を保持し、相互に、口のフックを保持します。後端不動を押さえながら、ゆっくりと根性にアクセスするために口のフックを引っ張る。関連する組織（唾液腺、脳、脂肪体など ） を削除してから、ホルムアルデヒド修正を含む3ウェルディッシュに各腸を転送します。 ^第3齢幼虫を徘徊しているため、開発のこの段階で、幼虫はpupariationの準備のために供給することを中止使用されており、前胃は酵母のクリアされます。
<李>不透明な組織培養ボックス中で一晩4℃で根性をインキュベートする。
3. 井戸からのホルムアルデヒド固定液を除去する前に、胃の盲腸を削除し、突起がはっきりと支障なしで見ることができるように、前胃から〜150μmの²中腸をクリップ。
4. 井戸からのホルムアルデヒドの修正を削除し、1X PBT（1X PBS、0.1％のプロテアーゼフリーウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100）の緩衝液と交換してください。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
5. セロトニンシグナリングを強化するために10 ^-6 Mの5-HTで1時間、4℃でインキュベートする。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。以前の研究は、外因性5-HTのこの濃度は、免疫組織化学分析におけるニューロンアーキテクチャまたは静脈瘤密度に影響を与えないことを実証し、単に雑音比^15-16に信号を増強している。
6. 4でインキュベートする＆＃176;で一晩抗セロトニン一次抗体（マウスまたはウサギで産生されたポリクローナル育ちモノクローナル）であった。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
7. （; 1:400希釈のAlexaフルーア568ヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG）を二次抗体での90分間4℃でインキュベートする。徹底的1X PBT中で10分間勇気を洗う6X。回の洗浄をしている間、機械的回転装置に組織サンプルを置きます。
8. 4％n-プロピルgallate/20 10mMの炭酸ナトリウムでマウントし、蛍光の下で表示して、機械的な回転装置上で10分間4 mMの炭酸ナトリウムでインキュベートする。炭酸ナトリウムを封入媒体に使用される緩衝液およびpHにサンプルを変換するために使用される。
9. 分析のための400倍の倍率で免疫染色組織サンプルの画像をキャプチャします。

5。神経回路の解析

1. 神経繊維は、静脈瘤の（数とサイズを定量化したと分岐度）NeuroleucidaとNeuroexplorerを使用。しかしながら、これは、手動で達成または簡易神経トレーサ（オンラインでダウンロードすることができる無料のアプリケーション）を使用してすることができる。
2. 前胃に脳からの個々の繊維投影をトレースし、静脈瘤番号、支店および単位長さ当たりの大静脈瘤の数を定量化する。脳から突出する軸索繊維がrecurrens神経にバンドルし、彼らは分離前胃と束生のに到達するまで、分析のためにアクセスできません。

結果

ショウジョウバエの幼虫におけるセロトニン作動性供給回路は、神経系の発達上の特定の要因の影響を観察するには極めて有効なモデルとして機能することができます。供給速度を定量することにより、その機能の出力（図1）と給電回路の軸索アーキテクチャをリンクすることができる。幼虫は、寒天の表面を横切ってそれ自体を推進するために、口のフックを使用するので運動アッセイは、口のフックの撤回用生理対照として使用する。変異が唯一の給電回路^8（図2A）に影響を与える場合、コントロールと変異遺伝子型の間運動応答に差があってはならない。有意な差が発生した場合には、幼虫の行動が不適切な取り扱いによって危険にさらされた可能です。アッセイの間幼虫停止寒天基板を介して穴を掘るしようとするならば、彼らはあまりにも古い可能性があり、おそらく齢放浪に移行している。したがって、それが困難な幼虫の口のフックが寒天基板をつかむために作る、寒天基板はあまりにも難しい場合も可能であり、これは寒天表面を濡らすことによって対処することができる。

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ディスカッション

後期胚形成時に発生するセロトニン作動口と胃の回路の異常な発展は、その成熟の機能に影響を与えます。神経突起のアーキテクチャの変更は、腸（酵母を溶液中に口のフック収縮によって測定される）速度を供給される回路の機能出力（図1）と相関させることができる支配する。 ショウジョウバエにおけるUAS-Gal4の二部系を用いることにより、特異的に特定の組織に与えられた転写物の上方または下方制御された発現を標的とすることができる。所与のタンパク質の発現の変化を正確に適切なツールが指定されて定量することができる。この技術は、脳領域、および特定の神経回路の発達に必要であっても、ニューロンのサブセットを解明するために使用することができる。

運動アッセイは、幼虫さもなければ生理学的に損なわれないことを確認するために使用されるので、40体壁の収縮以下証と幼虫ULDを解析し（図2A）から除外される。遺伝子型は物理的な異常が発生するため、または個々の動物が取り扱い中に負傷したため、これはどちらか発生する可能性があります。さらに、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Eclipse E-800 Microscope	Nikon Instruments
Neuroleucida	MBF Biosciences	NL-15	腸内線維の構造を分析するために使用され、
Northern Eclipse	Empix Inc		イメージングソフトウェア
G-2E/C TRITC EX 528-553	Nikon Instruments	96312	特定の二次抗体
用フィルターは必要ありませんN.A. 0.75;幅0.72 mm;DICプリズム:40xI、40x I-C;スプリング式	ニコンインスツルメンツ	MRH00400	イメージングに使用される対物レンズ
	NIH Image J		http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer

シンプルな神経突起トレーサーの