Summary
Un metodo quantitativo per studiare la migrazione spontanea di cellule in un microambiente confinato unidimensionale è descritto. Questo metodo sfrutta canali microfabbricati e può essere usato per studiare la migrazione di un gran numero di cellule in condizioni diverse in singoli esperimenti.
Abstract
Il metodo qui descritto consente di studiare la migrazione delle cellule sotto confinamento in una dimensione. Si basa sull'uso di canali microfabbricati, che impongono un fenotipo polarizzato a cellule da limitazioni fisiche. Una volta che i canali interni, le cellule hanno solo due possibilità: andare avanti o indietro. Questa migrazione semplificata in cui direzionalità è limitato facilita il tracciamento automatico delle celle e l'estrazione di parametri quantitativi per descrivere il movimento delle cellule. Questi parametri includono la velocità delle cellule, cambi di direzione, e pause durante il movimento. Microcanali sono anche compatibili con l'uso di marcatori fluorescenti e sono quindi adatti per studiare la localizzazione di organelli e strutture intracellulari durante la migrazione cellulare ad alta risoluzione. Infine, la superficie dei canali può essere funzionalizzato con substrati differenti, permettendo il controllo delle proprietà adesive dei canali o lo studio di haptotaxis. In sintesi, il sistema here descritto è destinato ad analizzare la migrazione di grandi numeri di cellule in condizioni in cui sia la geometria e la natura biochimica dell'ambiente sono controllate, facilitando la normalizzazione e riproducibilità di esperimenti indipendenti.
Introduction
La migrazione è una funzione cellulare complessa che è importante per molti processi fisiologici negli organismi multicellulari, incluso lo sviluppo, le risposte immunitarie e la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, alcune situazioni patologiche come invasione tumorale e metastasi basano sulla motilità cellulare 1. Per queste ragioni, la migrazione cellulare è diventato un importante campo di studio nell'ambito della ricerca sia fondamentale e traslazionale. In vivo, la maggior parte dei tessuti sono caratterizzati da una ricca matrice extracellulare ed elevata densità cellulare. La migrazione cellulare quindi, in condizioni fisiologiche, avviene in un ambiente confinato complesso. Classicamente, molto probabilmente a causa di ragioni storiche e limiti tecnici, la migrazione delle cellule è stato studiato in sistemi 2D piatte che non riproducono molte delle proprietà ambientali presenti nei tessuti, come ad esempio confinamento. Inoltre, fattori come l'adesione cellulare, che sono essenziali per la motilità in 2D, sono stati recentemente dimostrato di non essere necessapalmente necessari per la migrazione in vivo o all'interno gel, suggerendo che i meccanismi che regolano la locomozione cella in 2D e in altri ambienti sono distinti 2. Diversi sistemi sono stati sviluppati per imitare le proprietà complesse dei tessuti, i più noti gel dell'essere collagene, che mirano a ricapitolare le proprietà della composizione della matrice extracellulare 3. Qui proponiamo microcanali come metodo semplice complementare che permette la migrazione delle cellule studio in una dimensione in un ambiente confinato.
In questo sistema le cellule migrano lungo microcanali in cui essi entrano spontaneamente. Cellule migranti poi acquisire la forma dei canali, adottando una geometria tubolare che molto probabilmente rafforza il loro polarità. Il movimento lineare delle cellule nei canali permette inseguimento cella automatica e l'estrazione di parametri quantitativi da esperimenti. Dal punto di vista tecnico, questo sistema è facile e flessibile. Il coating delle pareti dei canali può essere manipolato, la dimensione e la forma dei canali possono essere adattati, e un gran numero di cellule può essere analizzato in singoli esperimenti. Questo sistema può essere anche in scala ingrandita effettuare medio analisi schermata gamma di molecole coinvolte nella motilità cellulare. Il protocollo qui descritto è stato standardizzato usando cellule dendritiche (DC) come modello cellulare. Queste cellule sono fondamentali per il sistema immunitario come partecipare al procedimento e la manutenzione di risposte immunitarie specifiche 4. In vitro, cellule dendritiche hanno dimostrato di migrare spontaneamente in ambienti confinati e sono quindi un buon modello per studiare la motilità cellulare in microcanali 5,6 . È importante sottolineare che questo sistema può essere esteso per analizzare la migrazione di qualsiasi altro tipo di cellula mobili come T linfociti, neutrofili, o cellule tumorali 7-9.
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Protocol
Nota importante: Questo protocollo presuppone che lo stampo contenente la forma per i microcanali desiderato è stato già fatto. Ulteriori informazioni sulla preparazione dello stampo è stato già pubblicato 10. Questo protocollo presuppone inoltre che la cultura DC midollo osseo è noto.
1. Chip Fabrication
- Mescolare olio PDMS e l'agente indurente in un rapporto in peso 10:1 in una tazza di plastica. Mescolare accuratamente entrambi i composti.
- Gettate la miscela sopra microcanali cuscinetto stampo. L'altezza totale deve essere compresa tra 0,5-1 cm.
- Rimuovere le bolle d'aria in una campana barattolo vuoto durante 1 ora.
- PDMS indurisce in stampo ponendo quest'ultimo in stufa per 2 ore a 65 ° C.
- Una volta che il PDMS è a temperatura ambiente, tagliare un grosso pezzo attorno alla struttura con una lama chirurgica e sfilarlo dallo stampo (Figura 1A).
- Praticare fori dove verranno iniettate cellule (in genere 2 millimetri) e ridimensionare il PDMScon una lama chirurgica per adattarsi alle dimensioni di piatti con fondo di vetro, in cui sarà valutata la migrazione (Figura 1B). Prima di procedere, rimuovere la polvere residua dal piatto utilizzando salviette per la pulizia. Ciò favorisce il legame di PDMS al vetro descritto nella fase 1.10.
- Pulire il chip PDMS ridimensionata contenente i canali attaccando e peeling nastro adesivo sui lati del dispositivo.
- Sonicare i pezzi PDMS 30 sec a 70% di etanolo per rimuovere polveri e PDMS piccole particelle. Asciugare rapidamente poi soffiando aria pulita.
- Attivare i PDMS (strutture verso l'alto) e piatti della cultura in aereo (o di ossigeno) durante il trattamento al plasma 30 sec a 300 mTorr.
- Posizionare entrambe le superfici attivate in contatto per attaccare definitivamente i PDMS al substrato. Se necessario, utilizzare pinze metalliche per premere leggermente sopra le PDMS per forzare il contatto tra il polimero e il vetro del piatto (Figura 1C).
- Incubare il chip in forno a 65 ° C for 1 hr per rafforzare l'associazione.
2. Rivestimento di microcanali
- Attivare l'intera struttura da plasma di aria a 300 mTorr per 1 min. Ciò promuove l'ingresso di liquido nei canali al passaggio successivo.
- Riempire rapidamente i fori di ingresso del chip con fibronectina a 10 mcg / ml in acqua. Altri substrati quali PEG possono essere utilizzati per modificare l'aderenza delle cellule alle pareti del canale. Prestare attenzione che il liquido si diffonde in tutta la struttura. Questo può essere facilmente controllato da occhi sotto la luce normale o utilizzando un microscopio in campo chiaro regolare.
NOTA: In molto piccole strutture, in cui la diffusione è più difficile, entrata di liquido nei canali può essere forzato inserendo la struttura in una campana vaso vuoto per almeno 15 min. Per verificare l'efficienza del rivestimento substrati fluorescenti possono essere utilizzati (Figura 2). - Incubare 1 ora a temperatura ambiente per permettere adsorbimento della fibronectina o qualsiasi altro rivestimento substrate alle pareti dei canali.
- Lavare le strutture 3x con PBS per rimuovere il substrato nonbound.
- Dopo il lavaggio, procedere al protocollo 3 o conservare il chip a 4 ° C per un uso successivo (24 ore al massimo).
3. Cella di carico
- Rimuovere la PBS dalla piastra e riempire il microsistema con mezzo cella. Lasciare incubare per 1 ora a saturare i canali con il mezzo.
NOTA: Per gli esperimenti che coinvolgono farmaci come gli inibitori della molecola, si consiglia di Preincubare i canali con un mezzo contenente il farmaco alla giusta concentrazione. Inoltre, alcuni farmaci tendono a solubilizzare nella struttura PDMS che riduce la concentrazione efficace. Alcune soluzioni sono state proposte per contrastare questo problema 11-12. - Togliere DC galleggianti e recuperare cellule semi-aderenti mediante flussaggio con terreno di coltura. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
NOTA: Per l'imaging nucleo, un Hoechst 33342 colorazione può essere raggiunto in precedenza dalla incubating 2 x 10 6 cellule durante 30 min con il colorante a 200 ng / ml in terreno completo. Lavare due volte mediante centrifugazione per rimuovere l'eccesso di colorante prima di proseguire il protocollo. - Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min (tempo e velocità possono essere diverse a seconda del tipo di cellula) e scartare il mezzo. Diluire il pellet per raggiungere una concentrazione di 20 x 10 6 cellule / ml.
- Rimuovere l'eccesso di mezzo dalla piastra e vuotare i fori di ingresso nella struttura PDMS utilizzando una micropipetta. Riempire le voci con 5 ml di soluzione di cellule per raggiungere un ammontare di 1 x 10 5 cellule in ogni foro di entrata.
NOTA: elevata densità cellulare è necessario per favorire il contatto delle cellule con i canali. Bassa densità cellulare può risultare basso numero di cellule all'interno canali e fallimento dell'esperimento. - Incubare il microchip per 30 min a 37 ° C in incubatore. Aggiungere 2 ml di terreno completo al piatto esperimento.
NOTA: L'intera struttura PDMS deve be coperti per evitare l'essiccazione delle cellule durante l'esperimento. Se 2 ml non è sufficiente, aggiungere altro mezzo per coprire completamente la struttura PDMS.
4. Imaging
- Pulire la superficie inferiore esterna dei piatti con le salviettine prima di posizionare le piastre al microscopio.
- Per analizzare la migrazione in gran numero di celle, utilizzare ingrandimento 10X e largo illuminazione in un campo di CO 2 e temperatura dotate di video-microscopio (Figura 3). Per facilitare il monitoraggio delle cellule, Hoechst colorazione e ai raggi UV può essere utilizzato (vedi punto 3.2). La migrazione può essere analizzata anche con microscopia confocale al fine di ottenere una maggiore risoluzione di strutture cellulari durante la migrazione.
- Per microscopia time-lapse a 10X, scegliere una frequenza di tempo in funzione della velocità di cella attesi (tipicamente 2 min per cellule dendritiche migrano con una velocità di 5 micron / min).
Nota: Il protocollo qui descritto fa not comprendono l'analisi dei parametri di migrazione cellulare. Alcuni punti sono elencati nella discussione per consigliare i lettori su come procedere per estrarre informazioni da filmati time-lapse.
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Representative Results
In ogni esperimento la superficie del PDMS è rivestita con una molecola adattato all'interesse dello studio. Figura 2 mostra canali rivestiti con una molecola fluorescente, PLL-g-PEG, prima e dopo il lavaggio (passo 2.4). Un simile esperimento permette di controllare l'omogeneità del rivestimento nei canali.
Dopo il caricamento delle cellule, microscopia video può essere eseguito per seguire la migrazione cellulare. Figura 3A mostra un esempio di DC migrazione in microcanali con una densità appropriata per monitorare le cellule. Entrambi, contrasto di fase e Hoechst colorazione possono essere utilizzati per questo scopo (vedi discussione). La tecnica è anche compatibile con microscopia confocale a fluorescenza ad alta risoluzione, e può essere utilizzato per monitorare organelli o strutture cellulari. Figura 4B mostra un esempio della dinamica di actina polimerizzata nella migrazione DC esprimenti LifeActGFP.
Un esempio di quantificazione delle cellulemotilità analizzato nelle DC migrazione è mostrato in Figura 5. Figura 5A mostra kymographs generati da WT o Y27632 DC trattate. Y27632 è un inibitore ben caratterizzato della contrattilità e migrazione cellulare, ed è stato utilizzato per verificare la capacità del sistema di rilevare variazioni di velocità. Le kymographs possono essere ulteriormente analizzati per estrarre posizione e la dimensione delle celle in funzione del tempo, permettendo lo studio di parametri differenti per descrivere la migrazione cellulare. Figura 5B mostra la velocità di migrazione monitorato mediante imaging posizionamento nucleo utilizzando un software fatto in casa 13. DC hanno una velocità media vicina ai 6 micron / min. Il trattamento con Y27632 diminuisce significativamente la loro velocità. Questo esempio mostra la potenza della tecnica, che consente la quantificazione di un gran numero di cellule in singoli esperimenti e l'utilità del sistema di rilevare differenze indotte da trattamenti farmacologici. Questo può essere esteso all'uso di siRNA e screening delle mole molecole coinvolte nel controllo della migrazione.
Figura 1. Fasi nei canali di montaggio. Chip di PDMS è stato replicato da uno stampo canale. (A) Il chip contenente i canali è stato estratto direttamente da stampo. (B) Il chip ridimensionata per adattarsi al piatto sperimentale e un foro è stato fatto per consentire l'entrata delle cellule. (C) Il chip è stato finalmente incollato sulla parte superiore del piatto di vetro. (D ed E) Rappresentazione schematica del dispositivo. (D) Vista superiore. (E) Vista laterale. Oggetti verdi rappresentano le cellule dentro o fuori canali (blu). Bar 1 cm.
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Figura 2. Rivestimento di canali con un substrato fluorescente. (A) 5 micron x 5 micron canali incubati con PEG fluorescente a 100 mcg / ml durante 1 ora. (B) Immagine rappresentativa della PEG fluorescente rimanente dopo PBS lavaggio dei canali. Bar 50 micron.
Figura 3. Cellule che migrano lungo microcanali. Contrasto di fase (grigio) e il nucleo colorazione (blu) di cellule migrano in 5 micron x 5 micron canali microfabbricati. (A) Immagine singola estratta da un film di DC migrazione lungo i canali. (B) in sequenza che mostra lo spostamento di una selezioneted DC migrazione lungo i canali. Frecce bianche indicano cellule che migrano. Tempistica 1 img / 2 min. Bar 50 micron.
Figura 4. Esempio di celle ad alta risoluzione in microcanali. Imaging ad alta risoluzione delle DC migrazione lungo singoli microcanali. (A) in sequenza di immagini a contrasto di fase (1 img/20 sec) di un DC migrazione in un microcanali (ingrandimento 100X). (B) Montaggio di un lifeact esprimere DC (luci polimerizzati actina) che mostra la compatibilità del sistema con imaging di fluorescenza (1 img/20 sec, 60X di ingrandimento, sezione ottica single). Actina polimerizzata appare in bianco. Dimensioni Canale 10 ad alta micron di larghezza x 5 micron. Bar 10 micron.
Figura 5. Risultati rappresentativi di DC migrazione lungo microcanali. Questa figura illustra il tipo di analisi che può essere fatto da film di cellule migrazione lungo microcanali. Figura 5A mostra kymographs generati da immagini a contrasto di fase time-lapse di WT o Y27632 DC trattati migratori in microcanali (10X, 1 img / 2 min). Figura 5B mostra un esempio di quantificazione della velocità cellulare ottenuta dopo inseguimento nucleo DC utilizzando Hoechst colorazione e un software fatto in casa 13. I dati vengono analizzati utilizzando un test non parametrico t (test di Mann-Whitney). Bar 100 micron.
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Discussion
Qui si descrive un dispositivo composto di microcanali come metodo per studiare le proprietà migratorie di gran numero di cellule in singoli esperimenti. Questo sistema sperimentale imita i vincoli ambientali confinati trovati nei tessuti da cellule migranti endogene. Tuttavia, forzando la migrazione in una sola dimensione, facilita inseguimento cella automatica e l'estrazione di measurables (Figura 5). Mostriamo anche che il nostro dispositivo è compatibile con microscopia a fluorescenza e può pertanto essere adattato per studiare posizionamento organello durante le varie fasi della motilità cellulare (Figura 4).
Un punto critico all'interno del protocollo è la qualità dei canali. È importante controllare il buon incollaggio dei PDMS sulla superficie del vetro. Quando problemi di incollaggio appaiono le prime cose da controllare sono la pulizia di entrambe le superfici e quello del pulitore plasma. Un altro parametro che può essere critica è ªe densità di cellule caricate. La migrazione spontanea richiede prossimità delle cellule ai canali per facilitare l'ingresso nei tubi, e il numero ottimale dovrebbe essere valutata per ciascun tipo di cellula.
Come esempio, abbiamo dimostrato la migrazione spontanea di DC, ma il sistema può essere utilizzato per analizzare la migrazione di altri tipi di cellule. In laboratorio, è stato testato linfociti T, macrofagi primari e linee cellulari tumorali (dati non mostrati e riferimenti 7-9).
Per analizzare la migrazione cellulare nei canali, sono stati testati due protocolli principali. La prima richiede di imaging a contrasto di fase (10X), e si basa sul rilevamento automatico e generazione di kymographs da cellule migranti 3 (Figura 5A). Velocity, dimensione della cella e la persistenza sono, tra gli altri, parametri che possono essere estratti da kymographs. Questo sistema è limitato dalla qualità dei kymographs e allo sviluppo diil software per generare e analizzarli. Una seconda e più facile modo per quantificare i dati si basano sul rilevamento semi-automatizzato del nucleo mediante colorazione Hoechst (Figura 3). L'uso di fluorescenza consente la localizzazione e analisi di migrazione con software di imaging standard. Un esempio di tale strategia è stata sviluppata per la prima gara cella mondo 12.
Dato che la superficie dei PDMS può essere adsorbito con qualsiasi proteina, microcanali possono essere utilizzati per valutare l'impatto delle proteine della matrice extracellulare in migrazione cellulare. La geometria dei canali può essere anche modificato, facilitando lo studio degli effetti di vincoli fisici nella migrazione cellulare.
Infine, questo sistema sperimentale può essere adattato per acquisire diverse condizioni in singoli esperimenti. Questo, unitamente ad una analisi semi-automatizzato, è compatibile con proiezioni di throughput medio per la scoperta di nuovi attori coinvolgered nella migrazione di cellule tumorali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono notevolmente la piattaforma PICT IBiSA presso l'Institut Curie (CNRS UMR144). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal: Consiglio europeo della ricerca per AM.LD (Strapacemi 243.103), l'Associazione Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), la fondazione InnaBiosanté (Micemico) a MP e AM. LD e il giovane ricercatore sovvenzione CER Strapacemi a AM.LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2.5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H.
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
