Summary
En este vídeo demostramos un protocolo para la disección del músculo transverso abdominal del ratón y utilizamos inmunofluorescencia y microscopía para visualizar las uniones neuromusculares.
Abstract
El análisis de la morfología neuromuscular de la ensambladura puede dar la penetración importante en la situación fisiológica de una neurona de motor dada. El análisis de los músculos planos delgados puede ofrecer una ventaja significativa sobre los músculos más gruesos utilizados tradicionalmente, como los de la extremidad posterior(por ejemplo. gastrocnemius). Los músculos delgados permiten una visión general completa de todo el patrón de inervación para un músculo dado, que a su vez permite la identificación de piscinas selectivamente vulnerables de neuronas motoras. Estos músculos también permiten el análisis de parámetros como el tamaño de la unidad motora, la ramificación axonal y la brotación terminal/nodal. Un obstáculo común en el uso de tales músculos es ganar la experiencia técnica para diseccionarlos. En este vídeo, detallamos el protocolo para diseccionar el músculo transverso abdominal (TVA) de ratones jóvenes y realizar inmunofluorescencia para visualizar axones y uniones neuromusculares (NMJ). Demostramos que esta técnica da una descripción completa del patrón de la inervación del músculo de TVA y se puede utilizar para investigar la patología de NMJ en un modelo del ratón de la enfermedad de la neurona de motor de la niñez, atrofia muscular espinal.
Introduction
Las uniones neuromusculares (NMJ) son la conexión sináptica entre una neurona motora inferior y una fibra muscular esquelética. Tradicionalmente se consideran una sinapsis tripartita, compuesta por una neurona (terminal presináptica), fibra muscular (terminal post sináptica) y célula terminal de Schwann1. Los NMJ parecen ser dianas tempranas y significativas en patología en una serie de enfermedades de la neurona motora y modelos de ratón2,3. Los síntomas típicos incluyen la denervación, donde el endplate del motor llega a ser desprovisto de una inervación presináptica, hinchazón del terminal presináptico, y una reducción en la complejidad de la morfología de NMJ4-11. También se pueden observar respuestas compensatorias, que incluyen brotación terminal y nodal, donde los procesos axonales se extienden desde terminales o entrenudos sinápticos restantes hasta placas finales denervadas reinnervadas12,13. Debido a la estrecha correlación entre la actividad sináptica y la morfología nmj, una gran cantidad de información se puede obtener sobre el estado funcional de las neuronas motoras a partir del análisis de la morfología NMJ. Como la pérdida de NMJ frecuentemente representa uno de los primeros aspectos de la patología neuromuscular4,10,la cuantificación a nivel de inervación puede dar información importante sobre la progresión de la patología y el efecto potencial de una intervención terapéutica. Además, pues la pérdida de NMJ representa un paso significativo en la progresión patológica, el desarrollo de la terapéutica que puede estabilizar conexiones y animar la regeneración puede rendir la ventaja significativa.
Al analizar la morfología de NMJ, la elección muscular es de gran importancia. Algunas de las consideraciones principales podrían incluir el tipo de fibra muscular, posición del cuerpo, y el análisis comparativo de las condiciones humanas. Además, cuando se requieren manipulaciones como la inyección de sustancias o lesiones traumáticas del nervio, la accesibilidad experimental también es importante considerar. En general, es preferible analizar una gama de músculos posicionados en todo el cuerpo que reflejan una gama de subtipos de unidades motoras. A menudo, sin embargo, la elección muscular está influenciada por la facilidad de disección. Por lo tanto, el análisis de NMJ se realiza a menudo exclusivamente en los músculos apendiculares grandes tales como gastrocnemius. Para obtener una buena tinción nmj en tales músculos, a menudo se requiere seccionamiento o interrupción mecánica de las fibras musculares. Como resultado, el patrón de inervación puede verse interrumpido y un análisis exhaustivo y de alta calidad de los patrones de inervación, brotación y denervación a menudo se ve comprometido. Un enfoque alternativo es utilizar músculos planos delgados que no requieren seccionamiento y pueden ser teñidos y montados intactos, lo que permite una visión general completa de toda la inervación del músculo. Hay una serie de músculos que se pueden utilizar para tal análisis, incluyendo un grupo de músculos craneales, (que abarca el elevador auris longus, auricularis superior, y aductor auris longus)14, músculos torácicos(por ejemplo. triangularis sterni) 15, y músculosabdominales (por ejemplo, transversus abdominis (TVA)). El principal obstáculo en el uso de tales músculos es la experiencia técnica necesaria para diseccionarlos sin daño.
En este video, proporcionamos un protocolo para diseccionar y realizar el etiquetado inmunofluorescente del músculo TVA del ratón para permitir un análisis exhaustivo del patrón de inervación y la morfología NMJ. El músculo TVA es un músculo predominantemente lento de la contracción nerviosa que comprende la capa más profunda de musculatura abdominal y es inervado por los nervios intercostales más bajos. Trabajos anteriores han demostrado que es consistentemente altamente vulnerable a la patología en una serie de modelos de ratón de la enfermedad de la neurona motora infantil atrofia muscular espinal (AME) y en otros modelos de ratón de la degeneración de la neurona motora de inicio temprano4,16. Por lo tanto sugerimos que el TVA sea un músculo útil para emprender análisis de NMJ en neuropathies periféricos.
Protocol
Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con los estándares de cuidado animal establecidos por la institución.
1. Disección de la musculatura abdominal del ratón
- Antes de comenzar, enste y enste un 4% de paraformadehído (PFA). Precaución: Mantenga siempre el PFA dentro de una campana extractora de humos y use el equipo de protección apropiado.
- Eutanasia del ratón por un método aprobado. Nota: El ratón que se muestra en el video fue eutanasiado por sobredosis de CO2 y luxación cervical. Este ratón es un ratón de tipo salvaje de 4 semanas de antigüedad en un fondo híbrido CD1/C57Bl6. Este ratón fue criado en las instalaciones de animales de la Universidad de Ottawa a partir de ratones que fueron comprados originalmente.
- Haga una incisión inicial a través de la piel a nivel de la cadera y corte a través de la piel todo el camino alrededor del ratón.
- Despega la piel, tirando hacia arriba hasta que llegues al nivel de la extremidad anterior.
- Corte a través de la musculatura abdominal a nivel de la cadera y continúe la incisión hasta llegar a la columna vertebral.
- En este punto, comience a cortar hacia arriba a través de la musculatura y las costillas hasta llegar a la extremidad superior.
- Cortar recto a través de hasta llegar a la columna vertebral en el otro lado.
- Corta hacia abajo hasta llegar al punto en el que empezaste.
- Suelte el diafragma de debajo (teniendo cuidado de no dañar el músculo TVA) y colóquelo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un plato de disección recubierto de SYLGARD con pasadores de disección de 0,2 mm.
- Fije la caja torácica y la musculatura asociada en el plato, de lado superficial hacia arriba, asegurándose de que el músculo esté completamente estirado.
- Vierta el PBS 1x y reemplácelo con un 4% de PFA.
- Cubrir y dejar en una plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar 3x en 1x PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
* En este punto los músculos fijos se pueden dejar en una nevera durante la noche antes de la posterior disección.
2. Aislamiento del músculo TVA
- Para proceder con el aislamiento del músculo TVA, bajo un microscopio de disección, comience cortando a través del músculo oblicuo externo a nivel de las últimas costillas (Ver Figura 1 para una guía anotada).
- Cortar directamente hacia abajo al lado de la linea alba (teniendo cuidado de no cortar a través de la TVA a continuación) hasta llegar al inicio del músculo oblicuo interno.
- Luego corte para liberar los rectos abdominales y los músculos oblicuos externos de la parte superior de la TVA a continuación.
- Retire el vaso sanguíneo y cualquier grasa sobreabordante del músculo TVA.
- Suelte el músculo de la última costilla que lo sobrea relanza.
- Cortar alrededor de los márgenes del músculo y retirar a una placa de 24 pozos que contiene PBS.
3. Etiquetado inmunofluorescente y microscopía del músculo TVA
Para todos los pasos posteriores, retire el líquido con una pipeta de punta fina y deje la placa en una plataforma oscilante. A menos que se indique lo contrario, todos los pasos posteriores se realizan a temperatura ambiente.
- Incubar en PBS que contenga 1:1,000 bungarotoxina marcada fluorescentemente durante 30 min para etiquetar a los NMJ. Esto se puede hacer en una habitación oscura o bajo papel de aluminio.
- Permeabilizar el músculo añadiendo 300 μl por pozo de 2% Triton X-100 en PBS y dejar en una plataforma oscilante durante 30 min.
- Incubar en reactivo de bloqueo (4% BSA, 1% Tritón en PBS) durante 30 min.
- Incubar en reactivos de bloqueo que contengan anticuerpos primarios (neurofilamento 1:100; proteína de vesícula sináptica 2, 1:250) a 4 °C durante la noche.
- Lavar 3x en 1x PBS.
- Incubar en PBS que contiene anticuerpo secundario 1:250 durante 2-4 horas.
- Lavar 3x en 1x PBS.
- Monte los músculos en diapositivas de vidrio usando suficientes medios de montaje fluorescentes y cubrebocas.
- Los portaobjetos se ven mejor utilizando un filtro de paso de doble banda en un microscopio epifluorescente estándar.
- Los NMJ se representan mejor utilizando una proyección de la serie z en un microscopio confocal equipado con al menos un objetivo de 40X.
Representative Results
El protocolo antedicho dirige el aislamiento y la coloración del músculo de TVA para el análisis de NMJ. Esto permite el análisis de montaje completo de los patrones de inervación muscular, así como el análisis de alta resolución de la morfología NMJ (Figura 2). Esta técnica se puede aplicar con éxito para revelar la patología NMJ en modelos de ratón de la enfermedad de la neurona motora, como SMA4,17(Figura 3). En modelos del ratón de SMA hay variabilidad intramuscular significativa en patología, no obstante el músculo de TVA es constantemente altamente afectado. Esto se evidencia por la denervación de las placas terminales motoras, la acumulación de neurofilamentos en el terminal presináptico y la brotación terminal (Figura 3). Los resultados presentados aquí demuestran así que la técnica descrita arriba puede ser un método de gran alcance para proporcionar una descripción comprensiva de la inervación y del análisis de la patología de NMJ en modelos del ratón.
Figura 1. Descripción general de la musculatura abdominal del ratón. (A)La imagen muestra la jaula torácica con musculatura abdominal adherida, que ha sido extraída de un ratón recientemente eutanásico y fijada en un plato de disección superficial lateral hacia arriba(A). (B)La disección en A ha sido anotada para marcar los límites aproximados de los músculos abdominales. Los músculos abdominales superficiales se pueden ver en el lado izquierdo de la disección, e incluyen oblicuo externo (delineado en azul) y recto abdominal (delineado en rojo). En el lado derecho de la disección, los músculos superficiales se han eliminado permitiendo la visualización del músculo transverso abdominal (delineado en verde) y el músculo oblicuo interno (delineado en amarillo). El objetivo de este protocolo es dirigir la disección de la parte superior del músculo TVA, mostrado aquí como triángulo verde sólido. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Descripción del Entero-montaje de ensambladuras neuromusculares en músculo de TVA. Imágenes que muestran ejemplos de NMJ del músculo TVA visualizados con tinción inmunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) y bungarotoxina (BTX; rojo). Las imágenes son micrografías fluorescentes montadas que muestran todo el músculo(A)o imágenes confocales que muestran grupos(B)o individuales(C)NMJ. Barra de escala = 800 μm(A), 70 μm(B), 25 μm (C). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Patología neuromuscular de la ensambladura en músculo de TVA de un modelo del ratón de SMA. Micrografías confocales que muestran NMJ del músculo TVA visualizado con tinción inmunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) y bungarotoxina (BTX; rojo) de control(Smn2B/+) o modelo de ratón SMA(Smn2B/-). Tenga en cuenta que mientras que la morfología normal de NMJ se puede observar en ratones de control, en los músculos tva de smn2B / - ratones hay evidencia de denervación completa (punta de flecha blanca), denervación parcial (punta de flecha púrpura) brotación terminal (punta de flecha azul) e hinchazón presináptica (punta de flecha amarilla). Las placas finales post-sinápticas también son menos complejas reflejando un fenotipo aparentemente menos maduro. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Discussion
En este video, hemos detallado un protocolo para la disección del músculo TVA del ratón y para el etiquetado inmunofluorescente de montaje completo de NMJ dentro del músculo. También presentamos datos que muestran que este músculo se puede utilizar para analizar la patología de la unión neuromuscular en un modelo de ratón de SMA.
El éxito en esta técnica depende de una serie de factores. Algunos de los problemas más comunes se describen a continuación. En primer lugar: mala tinción inmunohistoquímica. Puede haber una serie de razones para esto, una de las más comunes es el uso de reactivos diferentes a los enumerados en este protocolo. Un PFA de grado de microscopía electrónica de alta calidad es muy importante para asegurar una buena tinción, al igual que la elección de los anticuerpos enumerados en este protocolo. Además, en animales mayores(es decir,> 3 meses), obtener tinciones de buena calidad puede ser más difícil. Esto se debe al aumento del grosor de la fascia que rodea el músculo y el aumento de la acumulación de grasa entre el oblicuo externo y el tranversus abdominis. Es importante quitar la grasa, antes de proceder a la inmunofluorescencia. También puede ser necesario quitar parte de la fascia que cubre el músculo, que puede engrosarse. A veces es difícil quitar la fascia y la grasa del músculo sin incurrir en algún daño a la fibra muscular y una interrupción en el patrón de inervación. Sin embargo, si esta técnica se realiza con cuidado, se pueden adquirir tinciones de buena calidad de ratones hasta por lo menos 1 año de edad. En ratones más jóvenes(es decir,menores de 3 meses de edad) no debería ser necesario realizar ninguna burla o separación de fibras musculares. En segundo lugar: difícilmente en encontrar NMJs después de la disección y de la coloración. Esto es a menudo porque la disección no se ha extendido por debajo de la última costilla. La mayoría de los NMJ se encuentran justo debajo de la última costilla y, por lo tanto, se debe tener cuidado para garantizar que esta parte del músculo se incluya en la disección. En tercer lugar: adherencia del músculo EO al músculo TVA. Esto es a menudo una queja cuando los individuos intentan extender la disección debajo del nivel del músculo oblicuo interno (IO). El área del músculo TVA donde el IO también está presente es más difícil de analizar, ya que puede ser difícil distinguir qué músculo es cuál. Por esta razón, rutinariamente sólo diseccionamos la parte más superior del músculo TVA. En este nivel, no hay adherencia entre los músculos de la OE y la TVA, y por lo tanto esto no debería ser un problema significativo.
Un obstáculo significativo al uso del músculo TVA, comparado a los músculos apendiculares, es accesibilidad para las manipulaciones quirúrgicas o la inyección de sustancias. Estos tipos de experimentos pueden ser cruciales para investigar la fisiología de NMJ en un músculo dado. Aunque la TVA es ciertamente menos fácilmente accesible que los músculos más comúnmente utilizados como tibialis anterior o gastrocnemius,trabajos anteriores han demostrado que es posible denervar la TVA por lesión quirúrgica de los nervios intercostales18. Recientemente también hemos utilizado este músculo para la administración local de sustancias bajo anestesia general (datos inéditos). Aunque estos experimentos pueden representar un desafío técnico moderado, este trabajo muestra que son factibles y por lo tanto extienden la utilidad de este músculo para el análisis de NMJ bajo manipulación patológica y fisiológica.
El músculo TVA es uno de una serie de músculos planos delgados situados en todo el cuerpo que se pueden utilizar para el análisis de montaje completo de los patrones de inervación. Otros músculos incluyen un grupo de músculos craneales inervados por las neuronas motoras que se originan en el núcleo facial del tronco encefálico, abarcando el elevador auris longus, auricularis superior,y el aductor auris longus,las disecciones para las que se han descritoanteriormente 14,19. Además, la musculatura que rodea el músculo TVA, incluyendo EO, IO, y abdominis del músculo recto,se puede también etiquetar y utilizar para el análisis de NMJ. Para un análisis exhaustivo de la patología NMJ en un modelo de ratón, es importante considerar una serie de músculos situados en todo el cuerpo y no restringir el análisis a un solo músculo. Esto se ejemplifica en modelos murales de enfermedades de la neurona motora donde existe una heterogeneidad significativa en los niveles de patología NMJ entre diferentes músculos20. Tal variabilidad intermuscular es una herramienta extremadamente valiosa al investigar el mecanismo de la vulnerabilidad de la neurona motora y, por lo tanto, restringir el análisis a un solo músculo podría disminuir significativamente el potencial de la investigación.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (número de subvención MOP 38040) a R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) a R.K., Families of SMA a R.K. y L.M.M, The SMA Trust a T.H.G., y The Muscular Dystrophy Campaign a T.H.G.. L.M.M es un receptor de una beca postdoctoral de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá, y R.K. es un receptor de una cátedra de investigación de salud de la Universidad de Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
| Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
| α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
| Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
| Coverslips | Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |
References
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