Inledande av metastaserande Bröstkarcinom genom Inriktning av Ductal epitel med adenovirus-Cre: A Novel transgen musmodell av bröstcancer

Summary

Aktivering av latenta mutationer med adenovirus-Cre i bröst duktal systemet resulterar i en kliniskt relevant metastaserande bröstcancer. Införande av en YFP promotor möjliggör spårning av distala metastaserande tumörceller. Denna modell är användbar för att studera latent metastaser, antitumörimmunitet, och för att utforma nya immunterapier för behandling av bröstcancer.

Abstract

Bröstcancer är en heterogen sjukdom som involverar komplexa cellulära interaktioner mellan utvecklings tumör-och immunsystemet, så småningom resulterar i exponentiell tumörtillväxt och metastasering till distala vävnader och kollapsen av antitumörimmunitet. Många användbara djurmodeller finns för att studera bröstcancer, men ingen helt rekapitulera sjukdomsförloppet som förekommer hos människor. För att få en bättre förståelse av de cellulära interaktioner som resulterar i bildandet av latent metastaser och minskad överlevnad, har vi genererat en inducerbar transgen musmodell av YFP-uttrycker duktal cancer som utvecklas efter könsmognad i immun-kompetenta möss och drivs genom konsekvent, hormonoberoende onkogen uttryck. Aktivering av YFP, ablation av p53, och uttryck av en onkogen form av K-ras har uppnåtts genom tillhandahållandet av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i bröstkanal könsmogna, virgin honmöss. Tumörerbörjar dyka 6 veckor efter initiering av onkogena händelser. Efter att tumörer uppstår, utvecklas de långsamt i cirka två veckor innan de börjar växa exponentiellt. Efter 7-8 veckor efter adenovirus injektion, är kärl observeras ansluter tumörmassan till distala lymfkörtlar, med eventuell lymphovascular invasion av YFP + tumörceller till de distala lymfkörtlar. Infiltrerande leukocytpopulationer är liknande dem som finns i humana bröstkarcinom, inklusive närvaron av αβ och γδ T-celler, makrofager och MDSCs. Denna unika modell kommer att underlätta studier av cellulära och immunologiska mekanismer som är involverade i latent metastaser och dvala förutom att vara användbara för att utforma nya immunterapeutiska interventioner för behandling av invasiv bröstcancer.

Introduction

Bröstcancer är den vanligast förekommande malignitet hos kvinnor över hela världen ^1,2 och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall ^2. Komplexa genetiska ^3,4, histologiska ^5, och kliniska fenotyper ⁶ används för att karakterisera de olika subtyper av bröstcancer och ofta används som ett sätt att förutsäga överlevnad. Analys av en stor kohort av kvinnor med bröstcancer visade att de flesta (ca 80%) av de patienter som dog hade återkommit inom 10 år efter avlägsnande av den primära tumören ^7. För en majoritet av invasiva bröstkarcinom har lymphovascular invasion visat sig vara starkt korrelerad till ett dåligt utfall och mer aggressiv klinisk sjukdomsförlopp ^8.

På grund av den genetiska och fenotypiska komplexitet bröstcancer, det finns ingen djurmodell som rekapitulerar hela sjukdomsförloppet. Humana brösttumörcellinjer har oftaanvänds som xenograft eller orthotopic ⁹ modeller av invasiva och metastaserande bröstcancer i immun brist möss. Även informativ, dessa modeller förekommer i frånvaro av immun tryck och eftersom det är en cross art transplantat, snedvrider effekterna av hela tumören mikromiljö. Inducerbara genetiska mutationer som drivs av bröst specifika promotorer såsom murina brösttumörvirus (MMTV) och vassle surt protein (WAP) har bidragit med en enorm mängd kunskap om den genetiska naturen av bröstcancer. Dock är vävnadsspecifikt uttryck av dessa promotorer äventyras genom sin lyhördhet för det endokrina systemet ^10-16, vilket resulterar i varierande expression av inducerade mutationer som inte speglar uttrycket av onkogener vanligtvis överuttryckt i human bröstcancer. För att övervinna endokrina kontrollen av MMTV driven uttryck av onkogener, Moody et al. Genererade ett villkorat, doxycyklin inducible modell överuttryck Neu i bröstetepitel ^17. Denna modell är användbar för deinducing Neu efter tumörbildning för att studera regression och återkommande, men kräver ständig doxycyklin administration för konsekventa, långsiktiga onkogen uttryck. En omfattande diskussion om de många relevanta brösttumörmodeller som finns återfinns i den översyn av Vargo-Gogola et al. ¹⁰

Vårt mål var att utveckla en musmodell av spårbar bröstcancer på en full C57BL / 6 bakgrund som, efter den permanenta induktion av mutationshändelser, modeller bildandet av en begynnande tumör i närvaro av immun tryck. Vi införde ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i bröstkanalerna i transgena möss som innehåller floxed alleler av TP53 och en onkogen form av K-ras och YFP. Cre uttryck ablates TP53, en ofta muterad gen i många bröstcancer ¹⁸ och inducerar en onkogen allel av K-ras förutom YFP uttryck specifikti mjölk duktal epitel. Även mutationer i K-ras är ovanliga i bröstcancer, som förekommer i endast 6,5% av bröstcancerpatienter ^19,20, överuttryck av uppströms kinaser såsom Her2/neu och EGFR leder till konstitutiv aktivering av Ras-signaleringsvägen i humana brösttumörer ^21-23. Aktivering av Ras-signaleringsvägen i många brösttumörcellinjer har också beskrivits ^24,25. Vi kommer att beskriva initieringen av tumörbildning och den teknik för intraductal injektion av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i könsmogna, virgin honmöss. Denna modell av bröstcancer utvecklar uppenbara skador som växer exponentiellt efter ca 8 veckors långsam tumörprogression, med lymphovascular invasion och metastasering till armhålan lymfkörteln med 7-8 veckor. Eftersom dessa möss är på en full C57BL / 6 bakgrund och YFP-uttryckande tumörceller är spårbara i distala lymfkörtlar, ger denna modell ett relevant verktyg för att studera cellular och immunologiska mekanismer för latent metastaser och kommer att bidra till att utveckla nya terapeutiska metoder för behandling av metastaserad duktal bröstcancer.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Wistar institutet Animal Care och användning kommittén.

1. Generation och underhåll av transgena möss

1. Ras LSL-K-ras ^{tm4Tyj 26} och Trp53 ^{tm1Brn 27} (erhållen från NCI musmodeller av human cancer konsortium på en blandad bakgrund) till en full C57BL / 6 bakgrund ²⁸ genom tillbakakorsning minst 10 generationer med C57BL / 6 möss. För att spåra tumörmetastaser, ras B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor ^{TM1 (EYFP) Cos} / J (LSL-EYFP, som erhållits från The Jackson Laboratory på en full C57BL / 6 bakgrund) med dubbel transgen LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} möss.
   Anm: Transgenic ^{LSL-K-ras-G12D / +} p53 ^{loxP / loxP-möss} har loxP-ställen som flankerar en transkriptionellt tystade allel av oncogenic K-ras och det endogena p53-lokuset, så att efter Cre-förmedlad excision, överexpression av en onkogen K-ras mutanten och ablation av p53 är achieved.
   Obs: LSL-EYFP mus innehåller ett stoppkodon som flankerar en gen för förhöjd gul fluorescerande protein (YFP) att vid Cre-medie excision resultat i uttrycket av YFP i vävnaderna där YFP stopp kassetten skars ut.
   1. Ras transgena möss för att få LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} möss eller LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP möss för intraductal injektioner.
      OBS: Möss föds som homozygota för p53 ^{loxP / loxP} och heterozygot för LSL-K-ras ^{G12D / +} eftersom möss med en homozygot deletion av K-ras dör i livmodern. Använd naiva jungfru honor minst sex veckor för intraductal injektioner.
      Anmärkning: De primrar för genotypning homozygot floxed p53-allelen är p53 - T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') och p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). De producerar en vild typ allel vid 391 bp och p53 floxed allelen vid 461 bp ^29,30.
      Anmärkning: De primrar för att detektera den mutanta formen av K-ras är oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') och oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). De producerar den muterade bandet upptäcktes vid 600 bp.
      Anmärkning: För YFP reporter trippel transgena möss, för att primrarna detektera ROSA kassetten (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), av vildtyp-allelen (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'), och en gemensam allel (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ") resulterar i förstärkning av banden på 320 bp för floxed allel och 600 bp för vildtyp-allelen.

2. Kirurgisk förberedelse

1. Rengör kirurgiska material med 75% EtOH och autoklav dem före och efter alla injektioner.
2. Utför operation på en ren stilren laboratoriebänk i en sanerad rum inom en djuranläggning. Torka av alla ytor, inklusive scenen och rattar av operationsmikroskop med en bredspektrumdesinfektionslösning, följt av 75% EtOH.
3. Väg och söva möss genom intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (80 till 100 mg / kg) och xylazin (8-10 mg / kg) i steril saltlösning.
4. Placera försiktigt möss tillbaka i sina burar ostört i 5 minuter medan de går under narkos. Under denna tid generera virus utfällningar (se protokoll 3).
5. Verifiera bristande respons på smärta genom tå nypa. Täcka försiktigt ögonen på sövda möss med veterinär salva för att förhindra överdriven hornhinnan torkning.
6. För att förhindra hypotermi, placera sövda möss på en värmedyna inställd på låg värme under det kirurgiska ingreppet och tills de börjar att återhämta sig.
7. För hantering av smärta, administrera möss Meloxikam subkutant vid 1 mg / kg före operationen och 24 timmar efter.

3. Generation av Virus Utfällningar

VARNING: Adenovirusvektorer, även om de har ändrats och inte kan replikera, utgör en risk förinfektion. Handtag adenovirus med försiktighet. All personal ska ha lämplig utbildning enligt institutionens riktlinjer för hantering BSL2 agenter Efter intraductal injektion, kassera adenovirus enligt BSL2 riktlinjer.

1. Store adenovirus koncentrerade virusförråd vid -80 ° C frystes i alikvoter av 4 x 10 ⁸ pfu vardera, tillräcklig för att injicera 16 djur med 3 ml av 2,5 x 10 ⁷ pfu adenoviruspartiklar.
2. Förvara adenovirus alikvoter på torr is tills ca 15-20 min innan injektionerna.
   Obs: Undvik upprepade frysupptiningscykler, som virus titer minskar kraftigt mellan varje cykel.
   OBS: Adenovirus fällningar bildas genom modifiering ett protokoll beskrivits tidigare ^31.
3. Lös upp 504 mg av MEM-pulver med 50 ml sterilt molekylärbiologisk kvalitet vatten, komplettera med 244 mg natriumbikarbonat och filtrering under sterila förhållanden och förvara vid 4 ° C.
   <li> Förbered kalciumkloridlösningen genom tillsats av 1,5 g kalciumklorid till 50 ml av molekylärbiologisk kvalitet vatten och filtrering i sterila förhållanden och förvara vid 4 ° C.
   1. Blanda alikvoter innehållande 4 x 10 ⁸ pfu adenovirus-Cre med tillräcklig 3% sackaros i sterilt vatten till en slutlig volym av 10 ml. Lägg till 34 ml MEM till viruset och blanda försiktigt. Tillsätt sedan 4 ml av _{CaCl2-lösning,} blanda försiktigt och inkubera vid rumstemperatur under 15-20 min.
   2. Affär adenovirus på torris tills den ska bilda fällningar. Undvik upptining av adenovirus och lagring på is eller rumstemperatur under längre tider, om inte fällningar bildas.
      OBS: Det är även möjligt att blanda sackaros, MEM och _CaCl2 före operationer, om det inte är möjligt att tina adenovirus alikvot och börja göra fälls omedelbart efter avlägsnande från -80 ° C. Denna delmängd av sackaros, MEM, och kalcium kan sparas på torris tills den ska lägga adenovirus.
      Anm: Viruspartiklar är stabila under ca 1 timme.
   3. Före varje injektion, knacka försiktigt på röret för att se till att viruspartiklarna blandas. Dra upp 3 ml (2,5 x 10 ⁷ PFU) av viruspartiklar i 10 ml sprutan och förbereda musen för intraductal injektionen.

4. Intraductal Injektion av viruspartiklar

1. Placera försiktigt musen på rygg på den upplysta scenen av en ren dissektion mikroskop. Belysa buken sidan med en extra ljuskälla och leta reda på vänster ^{4: e} eller höger ^{9: e} ljumsk mjölkkörtlarna med de små vita fläckar av päls (synliga på C57BL / 6 honor) som omger varje bröstvårta.
2. Gnid bröstvårtan försiktigt med en steril etanol indränkt bomull tippas applikatorn för att rensa håret från bröstvårtan och att sterilisera injektionsstället. Om de är svåra att hitta, försiktigt på ett tjockt lager av en hårborttagningskräm eller använda sax för att exponera bröstvårtorna. Avlägsna keratin plugg, ett skikt av täta döda hudceller, som täcker bröstvårtan. När bröstvårtan är utsatt, bör keratin kontakten vara väl synliga under dissektion mikroskop.
3. Fäst nippel med fin kirurgisk pincett och dra upp med ljus kraft för att ta bort keratin kontakten.
4. Stabilisera bröstvårtan mellan pincett.
5. Försiktigt in nålen mellan pincett, kanyle kanalen kanalen vid 90 °. Ange fästet lite förbi avfasning av nålen (högst 2 mm) för att förhindra inträngning genom bröstvävnaden och in i de serösa membran av den ventrala kroppen hålighet.
   1. För inte in nålen för djupt. För att säkerställa korrekt djup av injektion, dra försiktigt upp nålen efter att sätta in den i lumen av kanalen, dra bröstvårtan upp längs kanterna av nålen när den dras upp.
      OBS: Visualisering av injektionen är svårt, därför practice för detta steg rekommenderas att använda trypanblått.
6. När nålen är lämpligt placerad i bröstkanalen, släpper de 3 ml virus utfällningar (2,5 x 10 ⁷ PFU av adenovirus-Cre) genom att försiktigt störta sprutan med tummen på den hand som håller i sprutan. Nippeln bör lätt blåsa när vätskan tillsätts.

5. Återvinning av möss

1. Placera musen tillbaka på värmedynan efter injektionen tills den börjar att återhämta sig från anestesi.
2. När musen återvinns, lägg tillbaka den i en ren bur och övervaka för full återhämtning och rörelse.
3. 24 h efter den intraductal injektion, subkutant administrera meloxikam på en mg / kg.

6. Övervakning tumörprogression

1. Palpera den injicerade bröstkörteln på dag 30 efter utvidgningen och svullnad.
   1. Övervaka tumörprogression var 5-7 dag en gång en svullen och förstorade bröst Gland observeras.
2. Mät tumörvolymer var 3-4 dagar för tumörtillväxt kinetik när palpabla tumörer verkar (ca 50-60 dagar efter adenoviral injektion).
3. Euthanize möss när tumörvolymerna överstiger 10% av kroppsvikten hos mössen.

Representative Results

Framgångsrik riktat mammary ductal träd kan visualiseras genom att framställa hela monteringar av bröstkörteln som tidigare beskrivits ³² efter injektion av trypanblått (för att kontrollera injektionsteknik (Figur 1A) eller ett adenovirus som uttrycker mCherry (för att kontrollera korrekt virala preparatet och infektion av kärlepitelceller, Figur 1B).

Figur 1. Intraductal inriktning av bröstkörtlarna genom injektion med trypanblått eller adenovirus-mCherry. A) Ett hela berget, som tidigare rapporterats ^32, i bröstkörteln efter injektion av bröstkörtel # 4 med trypanblått bereddes 3 h efter injektion till visualisera / bekräfta inriktning av hela duktalträd. Bilder är 4X förstoring. B) Infektion av duktal epitel med adenovirus genom att injicera 2,5 x 10 ⁷ pfu av adenovirus som uttrycker mCherry. Möss injicerades intraductally, och 4 dagar efter injektion, en hela berget av mjölkkörtlarna var beredd att bekräfta virusinfektion i duktal trädet. Bilden är 4X förstoring. MG är bröstkörtlar, LD är lactiferous, eller huvudkanalen, och TD är terminal kanalen. Klicka här för att visa en större bild.

När tumörer induceras i p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} transgena möss, tumörer blir inte uppenbara förrän runt dag 40, när mjölkkörtlar blir förstorad och svullen. Det är nödvändigt att börja palpations när detta observeras, övervaka tumörtillväxt var 5-7 dagar. I våra händer, härdning av bröstkörteln alltid föregår uppkomsten av tumörutveckling. Tumörerna fortskrider långsamt under ytterligare två veckor. Med början omkring dag 56, kommer tumörer börjar växa exponentiellt (Figur 2B). Vid denna punkt är det viktigt att mäta tumörvolymer var 3 dagar om kinetiska studier är önskvärda, eftersom det kommer att vara ringa mus till mus variabilitet i tumörprogression, vilket är normalt (fig. 2A och 3A). Stora resistens i buken kommer att framgå av dag 80 (Figur 2A, 2B och 3A), varefter mössen ska avlivas om tumörer överstiga mer än 10% av sin kroppsvikt. cDNA-analys av tre kloner från en tumörbärande mus visade uttryck för mesotelin, cytokeratin-8, Her2/neu, och östrogenreceptor-α (figur 2C).

> Figur 2. Utveckling av tumörer hos p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} möss injicerade intraductally med adenovirus-Cre. A) Två exempel på tumörer 80 dagar efter injektion med adenovirus som uttrycker Cre. Möss fick 2,5 x 10 ⁷ PFU av adenovirus som uttrycker Cre och 80 dagar efter tumör-initiering, kan stora påtagliga massor visualiseras sticker ut från buken sidan av B) Typiska tumör kinetik och palpation schema för tumörer induceras i p53 ^loxP djur. ^{/ loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} möss. C) Karaktärisering av tre tumörcellkloner härledda från samma homogeniserades tumör i en p53 ^{loxP / loxP} LSL-K-ras ^{G12D / +} mus. RNA extraherades och cDNA syntetiseras för RT-PCR-analys med användning av primrar som är specifika för β-aktin, mesotelin, cytokeratin-8, Her2/neu, progesteronreceptor, östrogenreceptor-α, och östrogenreceptor-β.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

I likhet med den cellulära mikromiljön i human bröstcancer, har vi observerat infiltration av αβ och γδ T-celler såväl som myeloid härledd suppressor-celler och makrofager in i tumörer (Figur 4). Kärl dränering till armhålan lymfkörteln börjar uppsluka innan tumörer har vuxit till att omfatta hela bröstvävnaden vid injektions utfördes (Figur 3A). Lymphovascular invasion och metastas av tumörceller som kan spåras genom att korsa ^{LSL-K-ras-G12D / +} p53 ^{loxP / loxP-möss} med LSL-EYFP möss. Efter Cre-förmedlad excision, är tumörceller som uttrycker YFP (både hög och låg) detekteras i tumören och kan spåras metastaserande till den dränerande axillära lymfkörtlar (Figur 3B). Metastas till den distala axillär lymfkörtel bekräftadesgenom att framgångsrikt odla en tumör cellinje från denna webbplats i en tumörbärande LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} mus (data visas ej).

Figur 3. Bildning av tumörer och latent metastasering till armhålan lymfkörteln. A) Exempel på tre avancerade brösttumörer med olika priser för tumörprogression. En solid massa, som visas med pilspetsen, former och så småningom växer till storleken av hela buken mammarvävnad. Tumören förblir begränsad till bröstvävnad och observeras inte att invadera eller fästa till muskeln täcker bukhålan. Det är uppenbart svullnad av den ytliga epigastrisk ven mellan de inguinala och lymfkörtlar, betecknas med vita pilar. Efter 7-8 veckor, the axillär lymfkörtel börjar bli förstorad på grund lymphovascular invasion av tumörcellerna, som visas med pilen. B) Metastas av YFP positiva tumörceller kan visualiseras i den axillära lymfkörtlar med flödescytometri. LSL-K-ras ^{G12D / +} p53 ^{loxP / loxP} LSL-EYFP möss användes för att inducera tumörer och aktivering av YFP genom intraductal leverans av adenovirus-Cre. För att verifiera lymphovascular invasion av tumörceller i armhålan lymfkörteln, 80 dagar efter adenoviral injektion, var de angivna lymfkörtlar och organ skördas och färgas för lymfocyter markörer och undersöktes för YFP uttryck. CL representerar kontralateralt nontumor dränerande lymfkörtel. Resultaten representerar gating på CD45 negativa tumörceller, vilket tyder på tumörcellerna invaderar den distala armhålan lymfkörteln. Siffror representerar procent YFP positiva celler från totala befolkningen. Klicka här för att se larger image.

Figur 4. Immun infiltrerar i mus transgena brösttumörer. Mouse brösttumörer homogeniserades och färgas för CD45, CD3, γδTCR, CD11b och GR1. Siffrorna representerar procent av positiva leukocyter i hela tumören (63,5), total CD3 ⁺ (46,7), totalt CD3-negativa (40,1), total CD3 ⁺ γδ ⁺ (γδ T-celler, 13), CD3 ⁺ γδnegative (24), totalt GR1 hög CD11b (MDSC, 28,6) och totala CD11b GR1 låg (makrofager, 18,5). Klicka här för att visa en större bild.

På grund av anatomin av musen och teknik för intraductal injektioner, finner vi riktar of mjölkkörtlar 4 och 9 (Figur 5) ger den mest konsekventa resultat och tillförlitliga injektioner. Däremot kan någon körtel riktas beroende på önskemål av teknikern som utför operationen.

Figur 5. Numreringen av bröst kanaler. Bröst kanaler 4 och 9 är markerade i rött på diagrammet och anges med pilar på musen. I våra händer, fann vi att injektioner var enklast att utföra på dessa bröst kanaler, men alla andra bröstvävnad som vi riktade utvecklade tumörer med liknande kinetik. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Framgången för detta förfarande hänger på korrekt teknik under intraductal injektioner, vilket kommer att bli svårt för otränade praktiker. Erfarna forskare i vårt laboratorium får vanligtvis brösttumörmassor 79% av de gånger de administrerar adenovirala injektioner. Problem med injektion kan leda till kraftigt försenad, variabel, eller frånvarande tumörutveckling. Om nålen sätts in för djupt eller vid en olämplig vinkel, kan duktal kanalen missas. Det är viktigt att komma in i bröstvårtan något förbi fasningen på nålen (ej mer än 2 mm), för att förhindra penetrering genom bröstvävnad och in i de serösa membran av den ventrala kroppshåligheten. Dessutom kan för grunt placering av nålen eller injektion av mer än 3 ml virus fällningar leda till spill av viral prep utanför bröstkörteln och induktion av oavsiktliga tumörer. Ett sätt att lösa dessa problem är att sätta nålen i bröstvårtan något deeper än 3 mm, och långsamt dra tillbaka sprutan upp ur kanalen tills 2 mm från spetsen av avfasningen. Detta kommer att säkerställa att bröstvävnad är riktad i stället för den muskel som omger bukhålan hos möss (Figur 1A). Detta kommer också att sträcka nippeln längs kanterna på sprutan så att när viruset drivs ut in i kanalen, det finns inget spill och förlust av virus-fällningar.

Visualisering av injektion är svår och praxis för detta steg är att rekommendera. Vi har observerat en ökning av framgångsrika injektioner efter praktiken, vilket resulterar i en högre penetrans av tumörutveckling. Eftersom denna teknik använder nonlactating jungfru honor, är det viktigt att avlägsna keratin plugg täcker nippeln att avslöja den underliggande kanalen kanalen. Vi rekommenderar att praktisera det här steget genom att injicera trypanblått eller någon annan steril spårbar färg på insidan av kanalen och förbereda hela bröst fästen för att bekräfta inriktning av duktal tree. Dessutom har andra protokoll som beskriver intraductal injektion av reagens publicerad ^33,34, som kan vara användbart för att utveckla rätt teknik. Problem med viral beredning eller infektion i duktal lumen kan också undersökas genom att använda en mCherry uttrycker adenovirus. Icke-transgena möss kan användas för vart och ett av dessa syften, tills injektionstekniken optimeras.

Även om någon bröstkörteln kan användas för att initiera tumörer har vi uppnått de mest konsekventa tillväxttakten genom att rikta bröstkörtel 4 eller 9, vilket vi tror beror på att det är lättare att utföra ordentliga injektioner på dessa körtlar, vilket resulterar i en effektivare inriktning av kanalen. Närheten till vänster ^{4: e} eller höger ^{9: e} ljumsk mjölkkörtlar till dränerande inguinal lymfkörteln är också användbart för att undersöka antitumörimmunsvar under olika tidspunkter tumörprogression. För att modellera och spåra latent metastasering till distala platser, transgenic möss korsas med LSL-EYFP möss. Eftersom tumören fortskrider, kommer vaskulatur ansluter tumören till axillär lymfkörtel blivit något svullna hos ca 5 veckor, innan tumören börjar växa exponentiellt (figur 3A). Så småningom, efter 7-8 veckor kommer lymphovascular invasion resultera i tumörtillväxt i den axillära lymfkörtlar (Figur 3A och 3B). Använda reporter möss och Cre-loxP-teknik, inkorporering av YFP skapar en plattform för att spåra tumörceller metastasizing till distala platser i hela tumörprogression. Detta kan underlätta studier för att belysa de cellulära och epigenetiska mekanismer som främjar latent metastaser. I våra händer, brösttumörcellinjer uttryckte cytokeratin-8, mesotelin, östrogenreceptor-α, och Her2/neu bekräftar inriktning av duktal epitel. Emellertid, beroende på mutationer induceras och på grund av svårigheten och variationen i injektioner rekommenderar vihistologisk karakterisering av tumörer När modellen är väl etablerad i laboratoriet.

Eftersom bröstcancer är en så dödlig och genomträngande sjukdom ^1,2, är det viktigt att använda djurmodeller som exakt rekapitulera det komplexa samspelet mellan tumör och värd. Här beskriver vi ett fullständigt tillbakakorsade C57BL / 6 mus modell av brösttumör. Först genom att inducera tumörer från naturliga celler, tillåter vi tumören att utvecklas naturligt i en fullständig immunmikromiljö. Immunmikromiljö i de avancerade mus brösttumörer rekapitulerar befolkningarna av αβ och γδ T-celler, myeloid härledda suppressorceller, och makrofager som vanligen observerats i human bröstcancer (Figur 4). Som vi tidigare har publicerat med hjälp av adenovirus-Cre att framkalla äggstockstumörer, fann vi att den virala injektionen hade försumbar effekt på de motsvarande tumör infiltrat och tumörprogression ^28. För det andra, endokrina oberoendeuttryck av onkogener gör att tumörcellerna har fortsatt höga nivåer av mål-genuttryck. För det tredje, genom att utnyttja latenta mutationer, kan vi styra tidpunkten för tumörbildning för att underlätta exakt tidsmässig spårning av tumörutvecklingen. Tillämpningar av denna modell inkluderar forskning på tumörcellbiologin, studier av faktorer i tumörmikromiljö, anti-tumör immunsvar, och även effekten utvärdering av nya läkemedel. Genom tillgång till Cre-loxP-systemet, kan denna teknik användas som en plattform för att undersöka en mångfald av ytterligare mutationer i initiering och progression av brösttumörer. Vi hoppas att användningen av denna modell kommer att öka förståelsen för bröstcancer biologi och på sikt leda till nya läkemedel för att behandla metastaserande bröstcancer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trp53tm1Brn Transgenic mice K-rastm4Tyj Transgenic mice	Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium		Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1- Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice	Jackson Labs	006148
Primers p53loxP/loxP	Integrated DNA Technologies		5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-rasG12D/+	Integrated DNA Technologies		5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter	Integrated DNA Technologies		5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression	Integrated DNA Technologies		5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-Cre	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVCre	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Adenovirus-mCherry	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVmCherry	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80 °C to avoid repeated freeze thaw cycles.
Hamilton syringe	Hamilton company	701RN	10 μl syringe, RN series. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle	Hamilton company	7803-05	33 G 0.5 in long RN needle, with a 12° bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps	Dumont	52100-58	Dumostar No. 5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder	Cellgro	50 012 PB	Store at 4 °C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233	Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride	Sigma	C4901	Minimum 96%, anhydrous