利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

摘要

介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。

摘要

组织中的细胞外基质（ECM）由细胞合成并组装形成三维纤维状蛋白质网络，其纤维直径、成分和结构受到严格调控。除了提供结构支持外，ECM 的物理和化学特性在多种细胞过程中也发挥重要作用，包括细胞黏附、分化和凋亡。体内的 ECM 组装是通过暴露蛋白质内部隐藏的自组装（成纤）位点实现的。该过程因不同蛋白质而异，但纤连蛋白（FN）的成纤过程已被充分表征，是细胞介导 ECM 组装的典型模型系统。具体而言，细胞利用细胞膜上的整合素受体结合 FN 二聚体，并通过肌动球蛋白产生的收缩力使 FN 展开，暴露出结合位点，进而组装成不溶性纤维。这种受体介导的过程使细胞能够在从细胞到组织的不同尺度上组装并组织 ECM。本文介绍一种称为表面引发组装（SIA）的方法，该方法通过蛋白质与表面的相互作用模拟细胞介导的基质组装过程，使 ECM 蛋白展开并组装为不溶性纤维。首先，将 ECM 蛋白吸附到疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面，在此过程中蛋白质发生部分变性（展开），暴露出隐藏的结合结构域。随后，通过微接触印刷技术将展开的蛋白质以明确定义的微米和纳米图案转移至热响应性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）表面。通过温度触发 PIPAAm 溶解，最终形成并释放具有明确几何结构的不溶性 ECM 蛋白纳米纤维和纳米结构。通过设计用于微接触印刷的 PDMS 印模上的特定图案，可构建复杂的结构。除 FN 外，SIA 方法还可用于层粘连蛋白、纤维蛋白原以及 I 型和 IV 型胶原蛋白，以构建多组分 ECM 纳米结构。因此，SIA 可用于精确调控蛋白质组成、纤维几何形状和支架架构，从而模拟 体内 ECM 的结构与组成，构建基于 ECM 蛋白的工程化材料。

引言

组织中的细胞外基质（ECM）由多种多功能蛋白组成，参与对细胞黏附、增殖、分化和凋亡等多种细胞过程的物理和化学调控^1-3。ECM由细胞合成、组装并有序排列，其蛋白纤维成分具有独特的组成、纤维尺寸、几何形态以及相互连接的结构，且随组织类型和发育阶段而变化。近期研究表明，ECM可提供指导性信号，引导细胞形成工程化组织⁴，这提示若能在组成和结构上模拟ECM，或将有助于开发用于组织工程和生物技术应用的仿生材料。

已开发出多种制造方法，用于构建可模拟组织中细胞外基质（ECM）特性的聚合物支架。例如，静电纺丝和相分离技术均已被证明能够形成孔隙结构的纤维基质，其纤维直径范围可从数十微米至数十纳米^5-7。这两种技术还表明，高孔隙率的纳米纤维基质能够支持细胞黏附并促进细胞向支架内部浸润⁸。然而，这些方法在可实现的纤维几何形态、取向以及三维结构方面存在局限性。静电纺丝通常生成纤维随机取向或高度定向排列的支架，而相分离则产生纤维随机取向的支架。此外，材料选择也受到限制，研究人员通常使用聚（ε-己内酯）⁸和聚（乳酸-共-乙醇酸）⁹等合成聚合物，并在其表面包覆细胞外基质蛋白以促进细胞黏附。天然生物聚合物也被用于此类支架，包括I型胶原¹⁰、明胶¹¹、纤维蛋白原¹²、壳聚糖¹³和丝素蛋白

方案

1. 使用光刻技术制备主模具

1. 首先使用计算机辅助设计（CAD）软件设计待制备的细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维、纳米织物和纳米结构。然后将该CAD文件转移至光掩膜。光掩膜的类型取决于特征尺寸的分辨率；对于特征尺寸小至约10 μm的情况，基于透明胶片的光掩膜即可满足要求。若特征尺寸小于<10 μm，则需要使用玻璃铬版光掩膜。本文中所有展示的纳米纤维和纳米结构均采用基于透明胶片的光掩膜制备，因此其厚度为纳米级，但横向尺寸不受此限制。
   注意：必须明确区分光掩膜中哪些区域为暗区（阻止紫外光透过），哪些区域为透明区（允许紫外光透过），因为这将与光刻胶类型（正性或负性）共同决定最终母模的表面形貌。
2. 开始制备母模时，将一片4"硅片置于设定为150 °C的加热板上，加热15分钟以进行脱水处理。
3. 将硅片居中放置于旋涂仪的真空卡盘上。将SU8-2015负性光刻胶倒入硅片中央，并以同心圆方式持续倾倒，直至覆盖约三分之二的硅片表面。
   注意：倾倒SU8时应使试剂瓶尽量靠近硅片，以减少气泡的产生。
4. 按以下参数设置旋涂仪：
   • 铺展阶段：500 rpm，加速度100 rpm/sec，持续10秒。
   • 旋涂阶段：4,000 rpm，加速度100 rpm/sec，持续30秒。
   注意：该旋涂程序将形成厚度约为10 μm的光刻胶层。通过调节旋转速度或SU8配方，可调整该厚度。

结果

SIA 能够精确控制纤维尺寸，从而构建细胞外基质蛋白纳米纤维。为证明这一点，将平面尺寸为 50 × 20 μm 的纤连蛋白（FN）纳米纤维阵列图案化于 PIPAAm 涂层的盖玻片上（图 2A）。释放后，纤维发生收缩，这是由于其在 PIPAAm 表面图案化时处于固有的预应力状态（图 2B）。对 FN 纳米纤维的分析显示，释放前纤维呈单一分散性，平均长度为 50.19 ± 0.49 μm，宽度为 19.98 ± 0.17 μm（图 2C）。尽管释放后纤维明显收缩，但仍保持单一分散性，平均长度为 14.15 ± 0.92 μm，宽度为 2.65 ± 0.32 μm（图 2D）。原子力显微镜提供了更高分辨率的图像，揭示了 SIA 释放过程中纤维尺寸变化的细节。值得注意的是，释放前的纤维厚度均匀，约为 5 nm（图 2E），而释放后的纤维厚度则不均一，数量级达数百纳米（图 2F）。

利用SI.......

讨论

本文介绍的SIA方法模拟了细胞介导的基质组装过程，能够对细胞外基质（ECM）蛋白纳米纤维和纳米结构的尺寸、排列方式及组成进行可调控的工程化构建。尽管SIA生成的ECM与细胞自然产生的ECM并不完全相同，但它所形成的ECM由纳米级蛋白原纤维组成²⁰，这些原纤维在机械应变下可发生可逆的折叠/去折叠过程²¹，并具备结合细胞的能力²⁰。这使得SIA具备独特的能力，可构建出在许多特性上重现体内（in vivo）ECM特征的ECM蛋白材料。例如，ECM纳米纤维可被制备成特定长度，其控制精度是其他技术难以实现的。我们展示了构建单分散纳米纤维阵列的能力（图2），在释放前（图2C）和释放后（图2D）均可精确控制其长度和宽度。这些ECM纳米纤维的长度可任意设计，例如我们已成功制备出长度约为1 cm的纤连蛋白（FN）纳米纤维（图3A）。相比之下，其他制备技术如静电纺丝和相分离法虽可生成纳米纤维，却无法精确控制其长度，通常只能产生连续的纤维。这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚(N-异丙基丙烯酰胺) / PIPAAm	Polysciences	21458-10	40,000 Mw
Sylgard 184 硅胶试剂盒 (PDMS)	Dow Corning		将10份基础剂与1份固化剂混合。
丁醇
纤连蛋白	BD biosciences	354008	人源，1mg
层粘连蛋白	BD biosciences	354239	超纯，小鼠源，1mg
负性光刻胶	Microchem	SU8-2015
SU8 显影液	Microchem
超声波破碎仪 Branson M3510	Branson Ultrasonic Corporation	CPN-952-318
Thinky ARE-250 混合器	Thinky Corporation
旋涂仪	Specialty Coating Systems	G3P-8
玻璃盖片，直径25mm，No 1.5	Fisher Scientific	12-545-86