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Biology

Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Analisi del proteoma dell'epitelio sensoriale cocleare può essere difficile a causa della sua piccola dimensione e perché le proteine ​​di membrana sono difficili da isolare e identificare. Sia membrana e proteine ​​solubili possono essere identificati dalla combinazione di più metodi di preparazione e le tecniche di separazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione.

Abstract

La proteomica è un approccio comunemente usato che può fornire intuizioni in sistemi biologici complessi. L'epitelio sensoriale cocleare contiene recettori che trasducono l'energia meccanica del suono in energia elettrochimica elaborati dal sistema nervoso centrale e periferico. Diverse tecniche di proteomica sono stati sviluppati per studiare l'orecchio interno cocleare, quali l'elettroforesi bidimensionale differenza gel (2D-DIGE), anticorpo microarray e spettrometria di massa (MS). MS è lo strumento più completo e versatile in proteomica e in concomitanza con metodi di separazione può fornire un proteoma approfondita dei campioni biologici. Metodi di separazione in combinazione con MS ha la capacità di arricchire campioni di proteine, di rilevare a basso peso molecolare e proteine ​​idrofobiche, e identificare le proteine ​​abbondanti bassi riducendo la gamma dinamica proteoma. Diverse strategie di digestione possono essere applicate a tutta lisato o frazionata lisato proteico che permettono di migliorare peptide e proteinacopertura della sequenza. Utilizzazione di diverse tecniche di separazione, comprese forte scambio cationico (SCX), a fase inversa (RP), e elettroforesi frazione intrappolamento liquido gel-eluito (GELFrEE) può essere applicato per ridurre la complessità del campione prima dell'analisi MS per l'identificazione delle proteine.

Introduction

Proteomica è lo studio di sistemi biologici complessi analizzando l'espressione della proteina, la funzione, modifiche e interazioni 1. Diversi metodi sono stati utilizzati per l'analisi del proteoma dell'orecchio interno, compresi anticorpo microarray 2, gel elettroforesi bidimensionale 3-5, e DIGE 6. Tuttavia, solo un numero limitato di proteine ​​sono state identificate e caratterizzate 2,7-10, rispetto agli oltre 10.000 geni e tag di sequenze espresse (EST) identificati nell'orecchio interno 11,12, MS è la tecnica più utilizzata completo e in proteomica per la caratterizzazione delle proteine. Analisi di campioni di proteomica complesse, come la coclea, può essere difficile. Tuttavia, la combinazione di più tecniche di separazione con MS consente l'identificazione di un maggior numero di peptidi e proteine, a causa di una gamma dinamica aumentata concentrazione e capacità di punta 13. Cromatografia multidimensionalePHY riduce miscele di proteine ​​altamente complesse, consentendo l'uso di differenti meccanismi di adsorbimento. Ci sono due approcci comunemente usati MS analisi del proteoma, fucile e proteomica bottom-up. In proteomica fucile, una miscela di proteine ​​intatte viene digerito enzimaticamente e separati mediante cromatografia multidimensionale con forte cromatografia a scambio cationico (SCX) seguita da cromatografia liquida a fase inversa (RPLC) 14,15. I peptidi separati sono sottoposti a tandem MS e database di ricerca 15. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che migliaia di proteine ​​possono essere identificati in una singola analisi e la tecnica è più adatto a proteine ​​di membrana.

Nell'approccio bottom-up, miscela proteica è separato, di solito da una o elettroforesi bidimensionale, e le singole bande proteiche o macchie, ritagliare e digerito con un enzima come la tripsina, solitamente con conseguente più peptidi. Tuttavia, un altro più recentely ha sviluppato l'approccio elettroforetico, utilizzato in proteomica bottom-up, è GELFrEE. Questa tecnica fraziona campioni di proteine ​​in fase liquida e li rende meno complessa prima dell'analisi. Questa tecnica è riproducibile, offre elevato recupero di proteine, e riduce la distribuzione delle alte proteine ​​abbondanti in campioni di proteine ​​complesse 16. Peptidi, derivanti da proteine ​​separate, sono analizzati da MS, utilizzando peptide mass fingerprinting o tandem MS (MS / MS), di creare tag di sequenza per database di ricerca 17-19. Alcuni dei principali vantaggi di utilizzare un approccio bottom-up sono la capacità di ottenere separazioni ad alta risoluzione e la copertura completa di proteine. Proteomica bottom-up è la tecnica più utilizzata in proteomica 20, quindi, diversi strumenti di bioinformatica sono disponibili. Inoltre, le proteine ​​possono essere separate in una miscela complessa prima di digestione, per cui vi è una maggiore possibilità di identificazione.

Una delle principali sfideutilizzando l'orecchio interno per l'analisi proteomica è la sua piccola dimensione, accessibilità limitato e tipo di cellula diversità 21. Inoltre, le proteine ​​chiave che contraddistinguono la sua funzionalità, come i canali ionici, trasportatori e recettori sono proteine ​​di membrana, che possono essere difficili da isolare 22. Così, la preparazione del campione filtro assistita (FASP) è vantaggioso per le analisi proteomica di tessuti che sono limitati per l'estrazione di proteine ​​e che richiedono detergenti per solubilizzare le membrane 23. Questo filtro permette l'analisi MS di membrana e proteine ​​solubili e per la capacità di isolare peptidi da contaminanti a basso peso molecolare 23,24.

Il presente protocollo descrive approcci di proteomica comunemente usati che vengono combinati e modificati per analizzare le proteine ​​solubili e di membrana e per massimizzare il numero di ID della proteina dall'epitelio sensoriale cocleare. Descriveremo utilizzando la proteomica fucile con FASP multi-digestione, cromatografia a scambio ionico, alta risoluzione MS, e l'analisi dei dati. Inoltre, descriveremo proteomica bottom-up con GELFrEE, FASP multi-digestione, alta risoluzione MS, e l'analisi dei dati.

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Protocol

Dichiarazione Etica

Esperimenti con topi di tessuto sono stati approvati dalla University of South Florida Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocolli 3931R, 3482R), come previsto in base alle direttive del National Institutes of Health.

1. Estrazione Protein

  1. Isolare cocleare epitelio sensoriale da 16 a 30 giorni di età (P30) CBA / J topi e conservare a -80 ° C.
  2. Il giorno dell'esperimento, lavare tessuti con 500 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Centrifugare per 3 minuti a 1000 xg, e rimuovere il surnatante. Ripetere per un totale di tre lavaggi.
  3. Tessuto ultrasuoni per 30 secondi su ghiaccio in 100 ml di tampone di lisi contenente 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 ug / AEBSF ml, 10 mg / ml leupeptina, 100 pg / ml pepstatina, 2 mg / ml aprotinina, e 0,5 mg / ml microcistina utilizzando un dismembrator sonico (Modello 100, Thermo Fisher). Raffreddare lisato su ghiaccioper 1 min tra ogni sonicazione. Sonicare un totale di 3x.
  4. Centrifugare l'estratto a 750 xga 4 ° C per 2 minuti e rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Estrarre il pellet in 50 ml di tampone di lisi per sonicazione per 30 secondi su ghiaccio. Centrifugare l'estratto a 750 xga 4 ° C per 2 min. Combinare entrambi i lisati e centrifugare a 28.600 xg a 4 ° C per 60 min. Rimuovere il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 20 microlitri di tampone di lisi contenente 0,1% ASB-14 al pellet. Vortex per 1 min e incubare per 60 min a 4 ° C.
  5. Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 minuti, poi raffreddare a 4 ° C per 60 min. Seguire con centrifugazione a 16.000 xg a 25 ° C per 10 min. Raccogliere il surnatante e trasferire in un nuovo tubo.
  6. Centrifugare la sospensione a 16.000 xga 4 ° C per 5 min e conservare il surnatante per la digestione.

2. Doppia Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP

  1. Aggiungere a 30 μl aliquota (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare, contenente 4% di sodio dodecil solfato (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di 8 M urea in Tris-HCl. Centrifugare a 14000 g per 15 min.
  2. Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min.
  3. Aggiungere 10 ml di 10x iodoacetamide (IAA) in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente (RT) al buio seguita da centrifugazione a 14.000 xg per 10 min.
  4. Aggiungere 100 ml di soluzione 8 M urea al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 pl di 50 mM di bicarbonato di ammonio soluzione (ABC) per l'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x.
  5. Aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w), enzima-to-Proteina rapporto e incubare una notte (O / N) a 37 ° C.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 50 mM ABC filtrare unità e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
  7. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con acido formico (FA) 1,0% per fermare la digestione.
  8. Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua.
  9. Lavare 3x l'unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina a 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C.
  10. Eluire peptidi triptici dal secondo digest aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
  11. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl alunità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con FA 1,0%.
  12. I campioni possono essere quantificati utilizzando il saggio colorimetrico per micropiastre con BSA come standard.

3. Endoproteinase lysC e Trittico digestione delle proteine ​​di Whole lisato Uso FASP

  1. Aggiungere una aliquota di 30 microlitri (≤ 400 mg) di estratto proteico cocleare contenente 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 0,1 M DTT direttamente ad un filtro rotativo 30K e mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl . Centrifugare a 14000 g per 15 min.
  2. Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione 8 M urea e centrifugare a 14000 xg per 15 min.
  3. Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione 8 M urea al concentrato nel filtro e vortex per 1 min. Incubare il filtro rotativo per 20 min a temperatura ambiente al buio quindi si centrifuga a 14000 xg per 10 min.
  4. Aggiungere 100 ml di 8 M urea solution al concentrato sul gruppo filtro e centrifugare a 14000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC all'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x.
  5. Aggiungere 0,1 mg / mL di endoproteinase lysC in 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 30 ° C.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC all'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
  7. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl al filtro rotativo e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC di una nuova provetta e acidificare con FA 1,0% per fermare la digestione.
  8. Lavare il filtro con 40 ml di 8 M urea, e poi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua.
  9. Lavare 3x l'unità filtro con 100 ml di soluzione 50 mM ABC. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in 1:100 enzima-to-prorapporto proteina e incubare O / N a 37 ° C.
  10. Eluire peptidi triptici aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC all'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
  11. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M di NaCl per l'unità filtro e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici ad una nuova provetta e acidificare con il 1,0% FA.
  12. Il campione può essere quantificato utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico con BSA come standard.

4. Peptidi dissalazione Utilizzo Colonne Spin

  1. Attiva una colonna MacroSpin C 18 aggiungendo 500 ml di acetonitrile (ACN) e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through dopo la centrifugazione.
  2. Equilibrare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through e ripetere questo passaggio 1x.
  3. Aggiungere fino a 500 ml di peptide digerire alla una colonnad centrifugare a 1100 xg per 1 min. Se il volume del campione è superiore a 500 microlitri quindi ripetere questo passaggio.
  4. Lavare la colonna con 500 ml di 0,1% FA e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Gettare il flow-through. Ripetere questo passaggio 1x.
  5. Aggiungere 250 pl di un rapporto di 90:10 ACN-acqua alla colonna e centrifugare a 1100 xg per 1 min. Raccogliere l'eluente contenente i peptidi dissalati e trasferire ad una nuova provetta. Ripetere questo passaggio 1x.
  6. Essiccare il campione peptide dissalato in una centrifuga a vuoto ed evitare di lasciare completamente il campione secco.

5. Scambio ionico Cromatografia

  1. Iniettare 50-100 mg di campione proteico digerito su un 200 x 2,1 mm, 5 micron colonna SCX (Polysulfoethyl A) per separare peptidi.
  2. Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 50 min con una portata di 250 ml / min. Solvente A è formiato di ammonio 5 mM, pH 3,0 a 25% di acetonitrile e 75% DDH 2 O. Solvent B è formiato di ammonio 500 mM, pH6,0 nel 25% ACN e il 75% DDH 2 O.
  3. Monitorare le frazioni peptidiche a 280 nm e raccogliere le frazioni in 2 intervalli di minimo con un collettore di frazioni.
  4. Frazioni secche in un concentratore di vuoto e risospendere in 500 ml di 50% acetonitrile in DDH 2 O contenente il 5% di FA per aiutare con la rimozione sale.
  5. Frazioni Redry e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso per l'analisi nano LC-MS/MS.

6. Acetone Precipitazioni

Prima della separazione GELFrEE proteina supernatante cocleare deve essere dissalato. Acetone precipitazione può essere usato per desalinizzare e concentrare proteine.

  1. Aggiungere tre volumi di acetone ghiacciato al supernatante cocleare. Vortice delicatamente e incubare a -20 ° CO / N.
  2. Centrifugare la miscela campione a 15.000 xg per 15 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
  3. Lavare la proteina pellet 3x con acetone freddo e centrifugare a 14000 xg per 5 minuti a 4° C.
  4. Aria asciugare il pellet e sciogliere in 112 ml di acqua 18 mW.
  5. Determinare la concentrazione di proteine ​​utilizzando la micropiastra saggio colorimetrico.

7. GELFrEE Frazionamento di Cochlear sensoriale Epitelio

  1. Aggiungere 30 ml di tampone campione 5x (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) di SDS, 50% glicerolo, 0,5% (w / v) di blu di bromofenolo) alla proteina dissalato sospesa in 112 ml di 18 mW acqua.
  2. Aggiungere 8 ml di 1M DTT e scaldare a 95 ° C per 5 minuti per ridurre legami disolfuro proteici. Dopo il riscaldamento consentire il raffreddamento a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 8 ml di tampone di corsa al serbatoio anodo, 150 ml di tampone di corsa per assaggiare camera di raccolta, e 6 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo.
  4. Rimuovere eventuali buffer che può essere fluito nella camera del campione di caricamento con una pipetta.
  5. Carico 150 ml (≤ 1 mg) della miscela proteica cocleare, nella camera del campione-carico con un 8% Trè-acetato cartuccia con un intervallo di massa di 3,5-150 kDa.
  6. Elettrodi inferiori e chiudere il coperchio dello strumento per iniziare la corsa.
  7. Alla prima pausa sullo strumento aggiungere 2 ml di tampone di corsa al serbatoio catodo e riprendere la corsa.
  8. Ad ogni intervallo di pausa sullo strumento, raccogliere il campione dalla camera di raccolta del campione con una pipetta e aggiungere a una provetta appena marcato. Lavare i 2x camera di raccolta con 150 ml di tampone di corsa e scartare.
  9. Aggiungere 150 ml di tampone di corsa fresca alla camera di raccolta del campione e riprendere la corsa. Raccogliere le frazioni proteiche per un periodo di 2,6 ore in un volume totale di 150 microlitri / frazione.

8. 1D elettroforesi su gel di GELFrEE Frazioni

Elettroforesi su gel 1D può essere utilizzato per visualizzare i risultati di GELFrEE frazionamento prima digestione enzimatica e analisi MS. GELFrEE frazioni proteiche possono essere separati su un gel Tris-HCl 4-15%.

  • Mescolare un'aliquota di 5 ml di ogni frazione GELFrEE con 5 ml di campione di tampone di diluizione (DTT 350 mM in tampone campione).
  • Riscaldare i campioni a 95 ° C per 3 min.
  • Campioni Raffreddare a RT.
  • Caricare 10 ml di ogni frazione GELFrEE nelle singole corsie del gel e carico di 5 ml di molecolare standard di peso nell'ultimo corsia inutilizzato.
  • Attivare il gel a 125 V per 1,5 ore o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel.
  • Rimuovere accuratamente il gel e macchiare con Silver Stain Plus per visualizzare la separazione delle proteine.

    • 9. Digestione delle proteine ​​di frazioni GELFrEE Uso FASP

    Una procedura FASP modificato viene utilizzato per la rimozione del detersivo e la digestione delle frazioni GELFrEE.

    1. Aggiungere le singole frazioni direttamente ad un'unità filtro 30K, mescolare con 200 ml di urea 8 M in Tris-HCl e centrifugare a 14000 xg per 25 min.
    2. Diluire il concentrato con 200 ml di soluzione di ureae centrifugare a 14.000 xg per 12 min. Ripetere questo passaggio 1x.
    3. Aggiungere 10 ml di 10x IAA in soluzione di urea al concentrato in ciascuna unità filtro, vortex per 1 min, e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
    4. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di urea al concentrato sulle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 15 min. Ripetere questo passaggio 2x. Aggiungere 100 ml di soluzione 100 mM ABC alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 2x.
    5. Aggiungere 0,1 mg / mL di lysC per 1:50 (w / w) rapporto enzima-to-proteina alle unità filtra e incubare O / N a 30 ° C.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 ml di soluzione 100 mM ABC ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
    7. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl ai filtri spin e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi lysC da ogni filtro di selezione per una nuova provetta e acidificare con trifluoroacL'acido ETIC (TFA).
    8. Lavare i filtri di spin con 40 ml di 8 M urea, quindi lavare 2x con 40 microlitri 18 mW acqua.
    9. Lavare i filtri di spin 3x con 100 ml di soluzione di ABC 50 mm. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 0,4 mg / mL di tripsina in un 1:100 (w / w) rapporto enzima-to-proteina e incubare O / N a 37 ° C.
    10. Eluire peptidi triptici da ciascuna unità filtro aggiungendo 40 ml di soluzione 50 mM ABC e centrifugare a 14000 xg per 10 min. Ripetere questo passaggio 1x.
    11. Aggiungere 50 ml di soluzione 0,5 M NaCl alle unità filtranti e centrifugare a 14.000 xg per 10 min. Trasferire il filtrato contenente i peptidi triptici da ciascuna unità filtro a una nuova provetta e acidificare con TFA.
    12. Asciugare tutte le digerisce in un concentratore sotto vuoto.

    10. Preparazione del campione per LC-MS/MS

    1. LysC Ricostituire secca e peptide trittico digerisce frazioni in 20 microlitri di 0.1% FA e vortex.
    2. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 10min e rimuovere la parte superiore 95% del campione in un flaconcino campione.
    3. Iniettare 5 ml di ogni frazione peptidica su una trappola 100 um x 25 mm campione per rimuovere i sali e contaminanti ed eseguire la separazione cromatografica su 75 micron × 10 cm C 18 colonna.
    4. Utilizzare un gradiente di 2-40% B per 100 min con una portata di 200 Nl / min. Solvente A è 95% ddH2O e 5% acetonitrile contenente 0,1% FA. Solvent B è 80% ACN e 20% ddH2O contenente 0,1% di FA.
    5. Raccogliere dieci spettri di massa tandem per ogni MS scansione su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Uno spettrometro di massa LTQ Orbitrap è stato utilizzato in questo esperimento.

    11. Protein Identification

    1. Identificare le proteine ​​che utilizza il database del mouse UniProt contenente sia avanti e indietro sequenze proteiche e contaminanti comuni. Software MaxQuant con motore di ricerca MASCOT viene utilizzato per effettuare ricerche nel database proteina.
    2. I parametri di ricerca che possono essere utilizzati comprendono; modific fissozione di carbamidomethyl di cisteina, modifiche variabili di ossidazione della metionina, proteina N-terminale acetilazione, massimo 2 mancati scissione. La lunghezza minima peptide da considerare per l'identificazione a 6 aminoacidi. Inserire una massa errore concentrazione del peptide di ± 8 ppm e una tolleranza massa frammento di 1.2 Da (errore di massa dipende dalla spettrometro di massa utilizzato).
    3. Nel software MaxQuant, utilizzare un falso tasso di scoperta 1% (FDR) per peptidi e proteine ​​identificazione. Identificazione delle proteine ​​è elencato con il numero di peptidi corrispondenti, la copertura della sequenza cento di proteine, e le sequenze peptidiche.

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    Representative Results

    Per ottenere il proteoma più completa dell'epitelio sensoriale cocleare, dissezione dei tessuti pratica è necessario prima di estrazione di proteine ​​e di preparazione del campione. Due tecniche di proteomica può essere utilizzato, fucile e bottom-up proteomica. Per preparare campioni per proteomica fucile, procedura digestione FASP stato utilizzato come illustrato nella Figura 1. Il metodo FASP consente concentrazione di proteine, rimozione di detergenti, e la digestione delle proteine ​​utilizzando più enzimi. C'erano due procedure di digestione doppi utilizzate, la prima era una digestione trittico seguita da una seconda digestione con tripsina, che sono stati riuniti, frazionato su una colonna SCX in 18 frazioni e analizzata da nano LC-MS/MS. Un totale di 1485 proteine ​​sono stati identificati con un FDR 1% durante l'esecuzione di una singola visione LC-MS/MS utilizzando questo approccio sperimentale. Tra le proteine ​​identificate, 329 e 258 proteine ​​sono stati classificati in mitocondrio e membrana plasmatica, rispettivamente (Figura2A). La seconda procedura di doppia digestione consisteva lysC digestione seguito da digestione con tripsina. Ogni digest è stato caricato individuale e separato sulla colonna SCX in 18 frazioni e analizzata da nano LC-MS/MS. I risultati del lysC e digestioni tripsina prodotto complessivamente 3.503 proteine ​​con un 1% FDR. Figura 2B mostra che 605 e 617 proteine ​​sono stati classificati in mitocondrio e membrana plasmatica, rispettivamente. Questo approccio ha fornito il maggior numero di ID proteine ​​associate alla membrana. Doppia analisi del lysC e frazioni tripsina ha mostrato più del 65% delle proteine ​​identificate sono state condivise tra gli esperimenti. Tuttavia, c'erano anche proteine ​​recentemente identificate nell'analisi replicare. I peptidi e proteine ​​addizionali sono stati identificati causa di piccole variazioni di cromatografia, dunque a diversi peptidi per frammentazione 25.

    Proteomica bottom-up è stato applicato utilizzando GELFrEE frazionamentoprima LC-MS/MS come illustrato nella Figura 3. C'erano 12 frazioni GELFrEE raccolti. Prima di digestione e analisi LC-MS/MS, un gel-argento macchiato era disposto a visualizzare i risultati da GELFrEE frazionamento come illustrato nella Figura 4. Il gel ha mostrato separazione delle proteine ​​mediante l'aumento del peso molecolare per ogni frazione consecutiva. Pertanto, i 12 GELFrEE frazioni liquide sono stati digeriti utilizzando due diversi approcci digestione multi-FASP e analizzati mediante LC-MS/MS. Il primo approccio di digestione è stata effettuata utilizzando una doppia digestione tripsina, che ha portato all'identificazione di 2165 proteine ​​con un 1% FDR quando si esegue una LC-MS/MS-run singolo. Figura 5A mostra che ci sono stati 516 e 399 proteine ​​classificati in mitocondrio e membrana plasmatica, rispettivamente. Il secondo approccio digestione è stata effettuata utilizzando endoproteinase lysC seguito da digestione con tripsina. A conduzione singola analisi LC-MS/MS identificato 2.211 proteine ​​con un FDR 1%. Questoapproccio ha mostrato un numero simile di proteine ​​associate alla membrana come quando si utilizza l'approccio tripsina / tripsina (Figura 5B). I dati di proteomica spettrometria di massa sono stati depositati al Consorzio ProteomeXchange 26 con l'identificatore del set di dati PXD000231 25. Combinando i risultati delle diverse tecniche portato a un gran numero di membrana e proteine ​​solubili dal mouse coclea epitelio sensoriale (Figura 6).

    Figura 1
    Figura 1. Schema di un fucile da caccia esperimento di proteomica utilizzando FASP, cromatografia a scambio ionico e ad alta risoluzione MS. Proteine ​​vengono estratti, solubilizzato, e digerito con FASP con lysC e endoproteinases tripsina. Il lysC (tubo verde) e peptidi triptici (viola tubo) sono separati in frazioni meno complesse mediante cromatografia SCX e analizzato utilizzando nano LC-MS/MS. Il motore di ricerca MASCOT è stato utilizzato per elaborare i dati di MS per l'identificazione delle proteine. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

    Figura 2
    Figura 2. GO componenti cellulari profilo di ID proteine ​​quando si esegue una (A) prima e seconda digestione con tripsina seguita dalla separazione SCX e (B) prima digestione con lysC seguita da una seconda digestione con tripsina seguita dalla separazione SCX. Tutte le categorie sono contati nonexclusively, quando una proteina ha più di una categoria di componenti cellulari.ES.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

    Figura 3
    Proteine ​​Figura 3. Schema di un bottom-up esperimento di proteomica utilizzando GELFrEE, FASP, e ad alta risoluzione MS. Estrazione sono solubilizzato e le proteine ​​vengono precipitate con acetone (tubo blu) per rimuovere i sali e contaminanti indesiderate dal lisato. Il pellet proteina è solubilizzato e le proteine ​​frazionato con GELFrEE. Ogni frazione è stato digerito con FASP con lysC e endoproteinases tripsina. Il lysC (tubi verdi) e peptidi triptici (tubi viola) da ogni frazione sono analizzati usando nano LC-MS/MS e le proteine ​​identificate dalla ricerca dati MS utilizzando MASCOT. Clicca qui per vedere immagine r.

    Figura 4
    Figura 4. Silver-gel colorato di cocleari sensoriali frazioni epitelio GELFrEE, visualizzare la separazione delle proteine ​​in ogni frazione prima dell'analisi MS. (M) marcatore Proteine, (1) Frazione 1, (3) Frazione 2, (5) Frazione 5, (7) Frazione 7, (8) Frazione 8, (9) Frazione 9, (10) Frazione 10, (11) Frazione 11, (12) Frazione 12. Ristampato (adattato) con il permesso di Darville e Sokolowski 24. Copyright 2013 dalla American Chemical Society. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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    Figura 5. GO componenti cellulari profilo di ID proteine ​​quando si esegue una (A) prima e seconda digestione con tripsina dopo separazione GELFrEE e (B) prima digestione con lysC seguita da una seconda digestione con tripsina dopo separazione GELFrEE. Tutte le categorie sono contati nonexclusively, quando una proteina ha più di una categoria di componenti cellulari. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

    Figura 6
    Figura 6. GO componenti cellulari profilo di tutte le proteine ​​identificate utilizzando SCX, WAX, o separazione GELFrEE. Quando una proteina ha più di una categoria di componenti cellulari, tutta la sua categorias sono stati contati in via non esclusiva. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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    Discussion

    I passaggi chiave per massimizzare l'identificazione delle proteine ​​dalla epitelio sensoriale cocleare sono: 1) utilizzo di più endoproteinases per la digestione, 2) utilizzo di più tecniche di separazione, e 3) l'utilizzo di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L'applicazione di più enzimi aumenta il numero di peptidi e migliora la copertura sequenza proteica, consentendo così di migliorare il numero di proteine ​​identificate dal tessuto cocleare. Tripsina, la proteasi più utilizzata prevede clivaggio efficiente e specifico di proteine, generando peptidi che sono buoni per MS ionizzazione e frammentazione. Tuttavia, utilizzando un altro enzima prima della tripsina, come lysC, che scinde anche al residuo di lisina, fornisce più efficiente clivaggio del peptide. È stato osservato che la copertura della sequenza delle proteine ​​generato dalla digestione lysC / tripsina ha mostrato un aumento di proteine ​​copertura della sequenza relativa alla copertura sequenza proteica della tripsina / tripsina digest.

    ove_content "> Attuazione della separazione multidimensionale prima MS ridotto l'elevata complessità campione cocleare nella proteomica fucile. Ciò ha permesso l'identificazione di altre proteine, tra proteine ​​di membrana, che sono tipicamente difficili da identificare. Un numero maggiore di proteine ​​di membrana sono stati identificati usando l'approccio fucile in contrasto con l'approccio bottom-up. Tuttavia, l'approccio bottom-up che usa GELFrEE consentito per l'identificazione delle proteine ​​più abbondanti bassi. Ciò è dovuto all'isolamento di proteine ​​superiore abbondanti, come Cochlin dalla coclea, in singoli frazioni.

    I dati di alta qualità ottenuti nel presente protocollo da uno spettrometro di massa ad alta risoluzione, come un LTQ-Orbitrap, migliora e aumenta il numero di proteine ​​che possono essere identificati nella coclea. Il LTQ-Orbitrap offre alta risoluzione, elevata accuratezza di massa, e alta sensibilità per l'analisi dei peptidi. Pertanto, l'applicazione di questo strumento enabindividuazione les di proteine ​​da campioni biologici complessi, quali l'epitelio sensoriale cocleare e migliora l'identificazione di peptidi a basso abbondanti. Utilizzo di questi approcci sperimentali combinati con la potente strumento di MS aiuta ad aumentare significativamente la proteina dataset cocleare, migliorando così l'opportunità di individuare nuovi biomarcatori proteici coinvolti nella dell'udito e della sordità.

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    Disclosures

    Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

    Acknowledgments

    Gli autori ringraziano il Dr. Kent Seeley, direttore del Centro per la Drug Discovery e l'innovazione (CDDI) Proteomica Nucleo Strutture presso University of South Florida, per l'uso di questo strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCD concessione R01 DC004295 a BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

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    References

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    Biochimica Cochlear cromatografia LC-MS/MS spettrometria di massa proteomica epitelio sensoriale
    Bottom-up e Shotgun Proteomica per identificare una completa Cochlear Proteome
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    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

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