Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.
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Artículo de método
Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal
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Resumen
Resumen
Proyección de imagen de lapso de tiempo es una técnica que permite la observación directa del proceso de morfogénesis, o la generación de la forma. Debido a su claridad óptica y la susceptibilidad a la manipulación genética, el embrión de pez cebra se ha convertido en un organismo modelo muy popular con el que se realiza un análisis cronológico de la morfogénesis en embriones vivos. De formación de imágenes confocal de un embrión de pez cebra en vivo requiere que un tejido de interés se persistentemente marcado con un marcador fluorescente, tal como un transgén o medio de contraste inyectado. El proceso exige que el embrión se anestesia y se mantiene en su lugar de tal manera que el desarrollo saludable continúa normalmente. Parámetros para la formación de imágenes se deben configurar para tener en cuenta para el crecimiento tridimensional y para equilibrar las exigencias de la solución de células individuales al obtener fotos instantáneas de desarrollo. Nuestros resultados demuestran la capacidad de realizar a largo plazo de imágenes in vivo de embriones de pez cebra marcados con fluorescencia y para detectar variadas conductas de tejido enla cresta neural craneal que causan anomalías craneofaciales. Retrasos en el desarrollo causados por la anestesia y el montaje son mínimos, y los embriones son sanos y salvos por el proceso. Embriones Time-lapse fotografiados pueden devolverse al medio líquido y posteriormente reflejados o se fijan en los puntos posteriores en el desarrollo. Con una abundancia cada vez mayor de líneas de pez cebra transgénico y suerte de cartografía bien caracterizado y técnicas de trasplante, las imágenes de cualquier tejido que se desea es posible. Como tal, time-lapse de imágenes in vivo combina fuerza con métodos genéticos de pez cebra, incluyendo los análisis de los embriones mutantes y microinyectados.
Introducción
Morfogénesis craneofacial es un proceso de varios pasos complejos que requiere la interacción coordinada entre múltiples tipos de células. La mayoría del esqueleto craneofacial se deriva de células de la cresta neural, muchos de los cuales deben migrar desde la dorsal del tubo neural en estructuras transitorias llamados arcos faríngeos 1. Al igual que con muchos tejidos, la morfogénesis del esqueleto craneofacial es más complicado que puede ser entendido por imágenes estáticas de embriones en puntos específicos de tiempo de desarrollo. A pesar de que es mucho tiempo para llevar a cabo, in vivo microscopía de lapso de tiempo proporciona una aparien....
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Protocolo
1. Ganadería y mutante alelos
- Levante y criar el pez cebra como se describe 21.
- Alelos mutantes de pez cebra utilizados en este estudio fueron 16 PDGFRA B1059, B1100 Smad5 22, y B577 SMO 23. Las fuentes de estas cepas de pez cebra son ZIRC.
2. Preparación de las soluciones e Implementos
Nota: Todas las soluciones y los instrumentos se pueden hacer con antelación y se almacenan para su uso futuro.
- Hacer medios embrión (EM) como se ha descrito previamente 21.
- Hacer 4 g / L MS-222 (tricaína....
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Resultados
En los embriones de tipo salvaje, a raíz de la población de la cresta neural, los arcos faríngeos se alargan a lo largo de los ejes ventral anterior / posterior y dorsal / mientras se mueve en una dirección rostral (Película 1). En 30 horas después de la fertilización (HPF), la longitud anterior / posterior de la primera arco faríngeo es entre 1.8 a 1.9 veces su dorsal / ventral altura. Dorsal / elongación ventral avanza de manera constante, más rápido que la extensión anterior / posterior hasta 36,5 HP.......
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Discusión
Time-lapse microscopía confocal es una poderosa herramienta para el análisis del desarrollo. Aquí, nos demuestran la utilidad del método en el estudio de la morfogénesis arco faríngeo en el pez cebra, que son mutantes para importantes vías de señalización que utilizan un transgénico que marca las células de la cresta neural. Además de los análisis a nivel de los tejidos, los análisis de lapso de tiempo también son aplicables a los análisis a escala celular 28. Muchos métodos de pez cebra ampliamente utilizado.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a Melissa Griffin y Jenna Rozacky para su cuidado de los peces experto. PDM gracias EGN para escribir la asistencia, la generosidad y la paciencia. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIDCR R01DE020884 a JKE.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Línea de monofilamento de prueba de 6 lb | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarosa I | Amresco | 0710 | |
| Láser de argón | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Tubo capilar, 100 mm, 0,9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| clavo | Hilltech Canadá, Inc. | HB-102 | |
| Grasa de alto vacío | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp incubadora de baño seco | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Microscopio láser de barrido | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Sulfato de magnesio hexahidratado | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscopio de vidrio, 22 x 22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Cubreobjetos de microscopio, 24 x 60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S Western | Chemical, Inc. |
Referencias
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B.
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Reimpresiones y permisos
