中G3BP应力颗粒动力学在Live原代细胞可视化

Summary

应力颗粒剂（SGS）是含有受阻核糖核蛋白颗粒（的RNP），并且在对各种逆境的细胞应答重要的细胞质RNA的颗粒。超导重力仪的动态特性可以遵循的活细胞通过可视化的SG在应激后转染的原代细胞标记一个组件的国产化。

Abstract

SGS能按特定的蛋白质成分或聚腺苷酸+ mRNA的免疫染色进行可视化的细胞。超导重力仪是高度动态的，其装配和命运的研究是重要的，了解应激的细胞反应。在超导重力仪的关键因素，如G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白）的缺乏导致小鼠和中枢神经系统的改变发育缺陷。若要从一个有机体，人们可以培养的原代细胞研究超导重力仪的动态细胞和遵循的SG的转染标记组件的国产化。我们描述时间推移实验，观察含G3BP1-SGS在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）。这种技术也可以用来研究含G3BP-SGS在活神经元，这是至关重要的，因为它是最近表明，这些超导重力形成在神经变性疾病如阿尔茨海默病的发作。这种方法可以适用于任何其他的蜂窝体和颗粒的蛋白质成分，以及执行以转基因动物，从而允许例如颗粒动力学在没有这些颗粒的具体因子的活研究。

Introduction

应力颗粒剂（SGS）是形成为对环境胁迫，如升高的温度下，氧化应激，缺氧，渗透压休克，紫外线照射，葡萄糖剥夺，或病毒感染¹的蜂窝式保护性反应的非膜质细胞质灶。它们可以化学诱导治疗与像亚砷酸钠，触发氧化应激的化合物。超导重力积累停滞翻译被捕信使核糖核蛋白（mRNPs）配合物²中，从机械翻译的mRNA螯合剂，和它们的组件可以通过eIF2α蛋白的磷酸化（真核起始因子2α）来触发。超导重力仪是它与核糖体和其他颗粒，如P小体交换组件的动态结构。它们构成了一个“分流中心”，其中的mRNA进行分类和处理要么翻译，再引发，降低或包装成稳定的非多核糖体mRNPs ^3。超导重力仪的组装速度快bUT它是一个渐进的过程，最初众多的小聚集体，其凝聚成较大的颗粒。使用该中断或稳定微管的化学抑制剂表明，微管网络是必需的法国兴业动态，包括组装，聚结和拆卸过程。

超导重力的动态组件也促进特定RNA结合蛋白（RNA-BP），如TIA-1（T细胞内抗原-1）和聚集TIAR（TIA-1相关蛋白），其能够二聚化促进多聚核糖体拆卸和mRNA的路由到的SG ^4。 G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白）是这样的RNA-BP的本地化的SGS当细胞被强调用砷或高的温度，并去磷酸化G3BP的过表达可诱导的SG组件^5。

G3BP是一个进化上保守的RNA-BP，最初表征通过其与一个RAS-GTP酶激活蛋白相互作用（RasGAP p120 ^6）;但此相互作用是最近重新^7。该G3BP家族包括哺乳动物中两个成员，G3BP1（简称G3BP）和G3BP2 ^8。这两个蛋白共定位于SGS，当细胞受到应力^9。典型的RNA识别基序（RRM）与保守RNP1和RNP2基序：G3BPs包括一个N-末端结构域NTF2建议以影响其定位和低聚，接着富含脯氨酸（PxxP基）基序，则C-末端基序与RNA结合相关，其次是精氨酸 - 甘氨酸丰富（RGG）框。有趣的是，通过构建融合到EGFP的不同结构域的蛋白质的不同部分的分析表明，NTF2样结构域和RNA结合结构域是最有效地募集到的SG，表明二聚化的性质的重要性和RNA的结合超导重力仪的组装。多样化的车型已经在体外 ^10-13透露G3BP蛋白的不同功能。G3BP在小鼠干扰已经表明这种蛋白在发育的生长和存活^14，以及用于G3BP在中枢神经系统（CNS），在空间工作记忆¹⁵特征在于，共济失调和缺陷中起重要作用的重要性。 G3BP缺乏导致改变神经元的可塑性和钙稳态，建立SG的形成和神经退行性疾病¹⁵之间的直接联系。能够学习的SG的动力学在初级细胞如神经元因此，这是很重要的。

该协议提供了一种简单的方法来观察下砷治疗的原代细胞含G3BP1-SGS的组装。它可以被用来研究的SG组件在不同条件下，例如不同类型的应力。它也可以适用于其它颗粒的SG的或其他成分。事实上，这个协议的重点G3BP1，但也有其他应力的颗粒标记物像TIA-1 / ^{R，TTP（tristetraprolin）2，}FMRP（脆性X智力低下综合征蛋白^{）16，TDP-43（}有中介的响应DNA结合蛋白^43），17或¹⁸诗道芬。特别是，像TIA-1 / R蛋白是一样G3BP，成核RNA结合蛋白，可诱导的SG组件过度表达时，即使不同形成的SG可以在功能，调节和相关的转录物不同。的任意这些关键部件或成核剂的SG的荧光团标记的版本转染可以执行图像特定的SG组件和动态。

Protocol

在这个协议的所有动物的程序都在严格遵守与1986年11月24日（86-609/EEC）的欧共体理事会指令的指引。房子的小鼠组，从而允许食物和水随意 。他们保持在受控环境中（22±1℃，55±5％相对湿度）与12小时：12小时光照：黑暗周期（灯亮在7:00上午）。

1小鼠原代细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）

1. 高压灭菌镊子薄，以及弯曲镊子和解剖剪刀。存放在无菌容器中。使用无菌的D-PBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水）。准备完整的MEF培养基：Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/ F12补充10％胎牛血清（FBS），1 mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，和0.5mM 2 - 巯基乙醇并在37°C温暖
2. 安乐死怀孕小鼠（13.5天后coïtum（DPC）），通过颈脱位。从小鼠消毒用90％EtOH中取出子宫角。在无菌和清洁油烟机，将喇叭与胚胎在37℃预热的D-PBS。打开喇叭，地点 在100毫米无菌塑料培养皿的胚胎，从脐带材料清除它们，并用温水D-PBS冲洗，以去除血液中多余的。下一个双目，取出胚胎的四肢，内脏和 包含脑头的上部。
3. 在一个新的培养皿中，将剁碎 胚胎成非常小的碎片，用无菌手术 刀片 或剪刀（至少为1分钟）。在不同基因型的胚胎的情况下，小心把每个胚胎在个别培养皿中，并保持尾部或头部上进行基因分型。
4. 覆盖胚胎用1X胰蛋白酶-EDTA（0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA）中。孵育30分钟至1小时在37℃的培养箱中培养。加入10毫升完整的MEF培养基停止胰蛋白酶反应。吸管上下删除所有聚集。让坐着的细胞悬浮液置于50ml试管（填充有完全培养基）中10分钟，并离心上清为5分钟，在300×g离心室温。重悬沉淀完全培养基（6毫升1胚胎）。可行的有核细胞可使用台盼计算 蓝色 （约5×10 ⁶细胞可以从一个胚胎预期）。板3毫升每60毫米培养皿。
5. 第二天改变介质和 使细胞生长 直到菜都汇合。许多 细胞类型中可以看出， 但只有成纤维细胞才能生存的亚文化。
6. 分裂细胞，让他们在35mm培养皿生长与玻璃底（时间推移实验很重要），直到50-70％融合的转染。 测试支原体和鼠标的病原体。

2，文化中的一种在神经元的案例daptations

1. 在培养的前一天，外套35毫米玻璃底培养皿用聚-L-赖氨酸（200微升的0.1毫克/毫升）在无菌和洁净罩，并留下过夜。
2. 第二天早晨，冲洗用无菌纯净水，5分钟两次，一次是45分钟至1小时。更换用2毫升的DMEM加10％FBS培养基中，并保持在37℃培养箱中培养。
3. 解剖胚胎在18.5 DPC。在无菌和清洁油烟机，将喇叭与胚胎冷无菌HBSS（Hank平衡盐溶液）以100毫米的培养皿。新生的幼崽，也可用于代替胚胎，以保持大坝的寿命，使其能够产生更多的后代，尤其是在转基因动物可以是难以获得的情况下。在个别培养皿，采取每个胚胎或新生儿和切头剪。握住头部插入弯钳入眼睛，切开皮肤，小心打开从后面的头骨软头部，直到眼睛，在头部的每一侧。切断视神经及脑干，取出大脑，并把它放在含有HBSS一个新的培养皿。下一个立体镜，删除所有使用两根细镊子脑膜。分离海马，皮质或大脑取决于研究该结构的任何其它部分。
4. 4.5毫升冷的HBSS浸入大脑解剖结构在15ml试管预先准备并保持在冰上，直到用胰蛋白酶消化。加入0.5毫升2.5％的胰蛋白酶和孵育在37℃下进行15分钟至20分钟。冲洗3次胰蛋白酶用HBSS，是非常小心，不要丢弃消化大脑部位。
5. 重悬在500微升（海马）至1ml（皮层）的DMEM加10％FBS和吸管上下数次1毫升微量装有1毫升尖，然后装有用1ml加200μl的提示，直到有没有明显的聚集。
6. 散布100-200微升细胞悬液至35毫米的玻璃博特米菜的DMEM加10％FBS和让神经元坚持在37℃至少3小时。通过预热神经元完全培养基更换（Neurobasal培养基补充有250μML-谷氨酰胺和NS21，如在Chen 等人 ¹⁹所述制备），并在37℃下离开以允许神经元生长。转染的神经元在5〜14天在体外 （DIV）（转染效率更高经过几个div，不过突触连接的是从7-10格更好地确立）。

的EGFP-G3BP1构造3。转染

转染的细胞用含有您感兴趣的蛋白的基因（SGS的任何成分）稠合到荧光标记（GFP，YFP，等）的载体，用3微克纯化的质粒的每35mm培养皿。

1. 使用市售的转染方法的MEFs中，按照制造商的方案（见表原料/试剂的）。
2. 转染的神经元与钙磷酸盐的方法改编自Xia 等 ²⁰简要：
   1. 准备解决方案：DMEM洗：含25毫米氯化钾的DMEM;转染溶液：DMEM洗含有1x DMKY（HEPES 5毫米， _氯化镁 10毫米，酚红）;和冲击的解决方案：HEBS 1X，1X DMKY和DMSO 2％（V / V）;并保持在37°C。
   2. 从神经元，滤液取出介质，并保持在37°C。用DMEM洗洗脸然后更换转染培养基和磷酸钙质粒DNA沉淀物的制备过程中保持在37℃。
   3. 在1.5 ml离心管中，加入（按照这个顺序）百灵水（终体积50微升），5微升_氯化钙 2.5 m和3微克质粒DNA。放弃这一组合到50微升HEBS 2倍的圆底聚丙烯管已经出台。通过转动沿与滴下混合管。在30分钟期间让沉淀物的形式在室温下进行。
   4. 添加precipitatË滴加到神经元，并在37℃时30〜50分钟离开。
   5. 更换1分钟冲击溶液，然后用DMEM洗，最后重新引入预处理介质。保持所述细胞在37℃下

G3BP 4。含可视超导重力大会和动态

1. 更换细胞培养基含有酚红酚红的培养基。
2. 利用共聚焦显微镜配有荧光的收购。打开显微镜系统：汞灯，计算机，激光器。热身室至37℃至少20分钟前收购的开始。
3. G3BP的过表达诱导型超导重力的自发形成。这些细胞可能因此无应力诱导转染后可观察到的超导重力仪24小时正确装配。另外，压力可诱发进一步诱发超导重力仪的组装。添加0.5 mM的亚砷酸钠和明星加入化合物（颗粒会在1小时内得到很好的形成）后右T的收购。
4. 添加到油中浸没物镜（使用40X或63X的目标），并在适于35毫米显微镜支架安装在培养皿在客观的，稳定的阶段保持器。检查盘是平的，否则收购将被改变。根据相关的荧光打开的荧光光以及可视化的转染细胞。关闭荧光曾经感兴趣的细胞是在现场以尽量减少漂白和细胞毒性。
5. 在“获取标签”，请根据所标记荧光基团（在我们的协议，使用绿色荧光蛋白标记的G3BP 488纳米）的激发波长的激光器和选择的PMT的适应发射长度（光电倍增管）。调整激光功率（通常不超过10％），以减少噪声和过饱和以及毒性，并设置增益和偏移修改的信号噪声比。扫描速度快（1000赫兹），以尽量减少激光博览会的持续时间（平均线2，帧平均1）。如果需要的话，设置参数的Z堆叠能够重建三维图像（1微米为Z步骤通常是细带细胞）。确定每个采集间隔时间：较小的间隔允许获得更加相干的影片，但是这可能导致光漂白性和毒性（20秒的时间间隔是在所描述的实验中使用）。总采集的持续时间可取决于应力类型而有所不同。许多含G3BP-SGS是根据砷处理形成非常迅速，而且是1小时的治疗后也可见：在这种情况下，选择快速细胞应激后立即拍摄并开始收购，以收购15的总持续时间 - 20分钟很大程度上足以观察几个超导重力仪的组装。
6. 保存图片和重建使用ImageJ软件堆栈和电影。

Representative Results

应力颗粒的形成是重要的细胞对应激的反应，允许一个细胞适应与停滞翻译，直到压力已被清除，相关的预防凋亡。此法允许以研究在原代细胞的SGS，通过以下关键蛋白质的SG部件国产化（ 图1）。 G3BP，SGS组件的一个重要因素，是存在而漫射在MEF中培养的或神经元（ 图2A中a和 c）的细胞质中，并且显然存在于离散的颗粒下在MEF中砷治疗以及神经元（ 图2A b和D）。主细胞可以从转基因小鼠模型来获得，例如允许应力颗粒在没有它们的组分之一的研究。有趣的是，G3BP1在小鼠的缺乏导致中枢神经系统的严重缺陷，特别是共济失调phenotype其特征在于，没有能力正确地协调的运动和空间工作记忆的改变（如在一个肢抱拢式测试， 图2B中所示）。 G3BP1存在于应力颗粒神经元中，这是更有趣的是，超导重力已经示出，形成在神经变性疾病如阿尔茨海默病的发作。

该测定中（ 图1），从而允许以研究的SG在原代细胞，不可缺少来研究其组成和装配体内 。此外，它允许活细胞的研究，并因此可以用于跟踪的SG的动态，通过可视化的一个或多个实时其过表达的元件， 图3示出了代表时间推移图像允许跟随装配和动力学G3BP1含SGS实验室砷处理后的MEF。在图4A中，相同的实验是在崇拜执行与鼠海马神经元URE。 EGFP-G3BP1本地化去从大亚细胞颗粒结构，以更明确和更小的颗粒，经SGS，砷治疗后。的SG是越来越定义，如果收购被持续（未示出），但其细胞形态开始变化，可能是由于诱导的激光激发的热量和毒性。

时间流逝允许视频的捕捉，直接观察了SGS动态。此外，使用共聚焦显微镜的允许重建的图像在Z轴堆叠，从而跟随整个3维细胞中的机构的完全的动力学（如在图4B中所定义的时间示出了神经元）。

图1描述的协议的主要步骤 。主细胞进行培养从胚胎（18.5 DPC（天后coitum）（或新生儿幼仔）的神经元（一），13.5 DPC为的MEF（b）条）。含EGFP-G3BP1基因的质粒转染后，细胞被强调和成像与激光扫描共聚焦显微镜。含G3BP1-SGS的动态观察。 神经元是由微管相关蛋白（微管相关蛋白2）染色（a）中，G3BP1染色的MEF（b）中显示。它们被给定为说明性的图片，以及EGFP-G3BP1转染的鼠神经元（c）和成纤维细胞（d）中，它是独立的图片和不对应于在（a）和给定的细胞（b）所示。

图2（A）。 G3BP定位在培养的MEF和海马神经元，未经处理或与亚砷酸钠强调。 G3BP主要是细胞质，与弥漫性染色的MEF（a）或在大颗粒结构中的神经元（三）当细胞没有强调的躯体。 1小时的亚砷酸钠治疗后，G3BP变得以离散的胞质颗粒局部（MEFs细胞，b和神经元，d）所示。这里，固定细胞并进行免疫染色用抗G3BP1抗体。 MAP2染色许可证，以确定在C神经元）和d）。 DNA的复染为蓝色用Hoechst。标尺代表2微米（a和b）和10微米（c和d）（B）。当向地板 （肢紧握测试） 的尾部抬起 ，野生型小鼠延长他们的腿（左），而G3BP1基因敲除小鼠表现出异常的爪子紧紧抱住反射接近蝙蝠一样的姿势。 请点击此处查看大图这个数字。

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图3中的时间推移实验逐次采集与MEFs细胞转染EGFP-G3BP1获得，使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜 （激发波长为488纳米的波长）。收购已经开始10分钟内添加亚砷酸钠后，并在10分钟内以20秒的间隔获得。六个代表性的图片给出，与T增加了亚砷酸钠（0.5毫米）后的时间以秒为单位。箭头显示了两个方面，我们可以看到的SG的组装。比例尺= 2微米。

图4（A）。在时间推移实验连续采集与转染EGFP-G3BP1小鼠海马神经元获得的，使用的是徕卡SP5激光扫描共聚焦显微镜 （激发在488纳米的波长）。收购已经开始5分钟加入的亚砷酸钠后，并在40分钟内以20秒的间隔获得。六个代表性的图片给出，与T增加了亚砷酸钠（0.5毫米）后的时间以秒为单位。箭头显示了两个方面，我们可以看到的SG的组装。标尺为5微米D：。枝晶;一：轴突 。 （B）。来自Z堆栈转染EGFP-G3BP1并与亚砷酸钠治疗的神经元（5收购Z轴合共逾10微米）3维重建 N：神经突起（树突或轴突）。 请点击此处查看大图版本这个数字。

Discussion

在协议中关注的转染和更具体的时间间隔采集，它必须以降低下来的细胞毒性进行仔细的监测中最关键的步骤。

原代细胞培养并不是一件困难的部分，只要在无菌条件得以维持，谨慎采取以防止在解剖和细胞分离步骤的损害。 MEFs细胞可以冷冻保存在早期传代。神经元的转染与磷酸钙已被证明工作良好²¹和从夏适于此协议等人 ²⁰使转染的良好的水平，但它可诱导在一定的细胞死亡。它转染的培养下在几天之内的神经元，以检查溶液的pH值，并监测与磷酸钙沉淀的质粒，它不应该超过1小时的神经元的培养是十分重要的。检查光镜下，取出TRANsfection媒体聚集是否得到遵守。洗涤液用DMEM的数量可以增加。

过表达某些蛋白质的SG组件导致颗粒的自发组装，这似乎涉及低聚和RNA结合这些蛋白质的性质，如在TIA-1 / R ⁴或G3BP ⁵的情况。因此，重要的是要界定上，你就可以开始的时间间隔采集的时间。数的SG是可见的，只要EGFP-G3BP转染，当表达蛋白质后24小时。然而，诱导了额外的压力导致了更多的粒子，这可能与不同种类的超导重力仪的不同关键部件的形成已经确定在不同应力^1,22,23。超导重力仪的组装速度快于活细胞（快10-20分钟），以及许多颗粒在1小时内砷治疗完全形成，它以尽快船尾开始收购是重要的内质网应激的诱导，如果组件具有待研究。然而在稍后的阶段，SGS的动态，也可以研究，因为小的颗粒可以结合成较大的结构，以及这些结构是不固定的：它们的组件可以与象P小体，站点颗粒的细胞质或其它类型的交换的RNA降解^3。快速眼检测转染的细胞和快速监测的采集参数（尤其是，X，Y和Z坐标）允许获得一个电影，包括颗粒的组装，以及限制光漂白和激光诱导的细胞毒性，这是其他在实时成像关键的一步。事实上，在某些情况下，我们可以观察细胞形态和重要变化的几个细胞甚至死亡，如果长时间（氧化应激与应激亚砷酸治疗诱导后超过1小时）进行了收购。为了防止这些现象，有可能以固定的扫描，并增加了间隔每次采集的时间。然而，一个较短的时间间隔许可证，以更好地遵循包含的可视化蛋白质超导重力仪的动态，并获得更完整的电影。因此，人们应的参数适应每个实验以获得具有有限的光漂白和毒性的最佳电影，这取决于初级细胞类型，这是随后的颗粒组成的，并且在相关联的荧光团分子。

荧光蛋白标记通常足够耐光要成像的实验的持续时间。不同的荧光蛋白可以很好地工作，只要它们产生一个强大的信号，是缓慢进行漂白和无毒的。重要的是，它们应足够亮，以便使细胞的自发荧光上述信号并由此被可靠地检测。事实上，原代细胞可诱导背景信号由于细胞器的自体荧光（如线粒体和溶酶体）。然而，在我们的手中，是自发荧光相比非常低EGFP-G3BP的亮度，并且很容易区分转染的细胞相对于未转染细胞的EGFP信号。总体而言，最佳的滤波器和激光的光强度水平的选择将是至关重要的，以获得合适的信号 - 噪声比，关联到低毒性。最后，如​​果图像要定量地研究，它是确定该蛋白质的荧光强度是不给环境因素，如培养基的成分敏感是很重要的。

超导重力仪的动态确实可以比较不同的条件（从野生型和敲除的动物，例如细胞）之间（的颗粒组装，大小和数目的速度）。为了得到显著结果，1应该从至少三个不同的动物每种基因型或条件（从三个不同升），并且细胞在每个独立的实验图像之间10和50的培养细胞。这是可能的标记多个职位在采集软件，从而对图像数转染的细胞的同时，允许增加在相对短的时间而获得的数据。同时成像多个细胞是有趣的，因为这将是很难进一步使用相同的培养皿中，一旦细胞被强调和成像（在超导重力的组件进行研究的情况下，或者如果在实验条件在长采集诱导的细胞毒性）。然而，量化参数“数字”的和“大小”的SG的时 - 而为了增加细胞成像，以获得更多的统计相关性（超过50个细胞的每个单独的）的数量 - 细胞可以是固定的砷处理后，使即在相同的培养皿中更多的细胞进行研究。画将仍然被用作在这种情况下，定性结果。

这里所描述的协议允许以研究含有G3BP-SGS在主活细胞，并且可以适用于其它蜂窝体和其他蛋白质小样图这些机构的onents（如TIA-1 / R为SGS，FRMP和诗道芬的超导重力仪和神经传递颗粒）。使用原代细胞是特别有趣的生理学研究的背景下，涉及例如转基因动物。的确，G3BP1 KO小鼠揭示例如运转^14,15一个超导重力因子在生存的有机体和开发，以及在中枢神经系统的基本功能。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5