Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

लाइव प्राथमिक कोशिकाओं में G3BP तनाव granules गतिशीलता के दृश्य

Published: May 21, 2014 doi: 10.3791/51197
Automatic Translation
1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535

Summary

तनाव granules (एसजीएस) ठप Ribonucleoprotein कणों (RNPs), और विभिन्न तनाव सेलुलर प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण युक्त cytoplasmic शाही सेना कणिकाओं हैं. एसजीएस के गतिशीलता तनाव के बाद ट्रांसफ़ेक्ट प्राथमिक कोशिकाओं में एसजीएस की एक में चिह्नित घटक के स्थानीयकरण visualizing द्वारा जीवित कोशिकाओं में पीछा किया जा सकता.

Abstract

एसजीएस विशिष्ट प्रोटीन घटकों या Pólya + mRNAs का immunostaining के द्वारा कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं. एसजीएस अत्यधिक गतिशील हैं और उनके विधानसभा और भाग्य का अध्ययन करने के लिए तनाव सेलुलर प्रतिक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. G3BP (RasGAP SH3 डोमेन बंधनकारी प्रोटीन) की तरह एसजीएस के प्रमुख कारकों में कमी चूहों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के परिवर्तन में विकास संबंधी दोषों की ओर जाता है. एक जीव, एक कर सकते संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं से कोशिकाओं में एसजीएस की गतिशीलता का अध्ययन और एसजीएस के एक ट्रांसफ़ेक्ट में चिह्नित घटक के स्थानीयकरण का पालन करें. हम माउस भ्रूणीय fibroblasts में G3BP1 युक्त एसजीएस (MEFs) का निरीक्षण करने के लिए समय चूक प्रयोग का वर्णन है. इस तकनीक को भी यह हाल ही में इन एसजीएस अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों की शुरुआत में गठन कर रहे हैं कि दिखाया गया था के रूप में जो महत्वपूर्ण है, जी न्यूरॉन्स में G3BP युक्त एसजीएस अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण किसी भी अन्य सेलुलर शरीर और दाना प्रोटीन घटक के लिए अनुकूलित, और किया जा सकता हैट्रांसजेनिक जानवरों के साथ, इन कणिकाओं की एक विशिष्ट कारक के अभाव में उदाहरण के लिए कणिकाओं की गतिशीलता का जीना अध्ययन की अनुमति.

Introduction

तनाव granules (एसजीएस) ऐसे ऊंचा तापमान, oxidative तनाव, हाइपोक्सिया, आसमाटिक झटका, यूवी विकिरण, ग्लूकोज अभाव, या वायरल संक्रमण 1 के रूप में पर्यावरण तनाव, एक सेलुलर रक्षात्मक प्रतिक्रिया के रूप में गठन गैर झिल्लीदार cytoplasmic foci हैं. वे oxidative तनाव से चलाता है जो सोडियम आर्सेनाइट, जैसे यौगिकों के साथ इलाज के द्वारा रासायनिक प्रेरित किया जा सकता है. एसजीएस ठप अनुवाद गिरफ्तार दूत Ribonucleoprotein (mRNPs) जमा translational मशीनरी से mRNAs sequestering, 2 परिसरों, और उनके विधानसभा eIF2α की phosphorylation (यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 2 α) द्वारा शुरू किया जा सकता है. एसजीएस पी निकायों की तरह polysomes और अन्य granules के साथ घटकों का आदान जो गतिशील संरचनाओं हैं. वे mRNAs हल और स्थिर गैर polysomal mRNPs 3 में अनुवाद, reinitiation, गिरावट, या पैकेजिंग के लिए या तो कार्रवाई की जाती है, जहां एक "ट्राइएज केन्द्र" का गठन. एसजीएस के विधानसभा तेजी ख हैकेन्द्र शासित प्रदेशों यह बड़ा granules में संगठित होना जो प्रारंभिक कई छोटे समुच्चय के साथ एक क्रमिक प्रक्रिया है. सूक्ष्मनलिकाएं बाधित या स्थिर कि रासायनिक inhibitors का उपयोग microtubule नेटवर्क विधानसभा, एकीकरण और disassembly प्रक्रियाओं सहित एसजी गतिशीलता के लिए आवश्यक है कि पता चलता है.

एसजीएस के गतिशील विधानसभा भी TIA -1 (टी सेल आंतरिक प्रतिजन -1) और जैसे विशिष्ट शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (आरएनए बीपी) के एकत्रीकरण द्वारा पदोन्नत किया है TIAR dimerize करने में सक्षम हैं जो (TIA-1 से संबंधित प्रोटीन), और एसजीएस 4 में polysome disassembly और mRNAs का मार्ग बढ़ावा देने. G3BP (RasGAP SH3 डोमेन बाध्यकारी प्रोटीन) कोशिकाओं आर्सेनाइट या उच्च तापमान के साथ जोर दिया जाता है, और dephosphorylated G3BP की overexpression एसजीएस विधानसभा 5 पैदा कर सकते हैं जब एसजीएस localizes कि इस तरह के एक शाही सेना बी.पी. है.

G3BP शुरू में RasGAP पी (एक रास GTPase सक्रिय प्रोटीन के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से होती थी कि एक evolutionarily संरक्षित आरएनए बी.पी. है120 6); लेकिन इस बातचीत हाल ही में 7 पर दोबारा गौर किया गया. G3BP परिवार दो स्तनधारियों में सदस्यों, G3BP1 (G3BP के रूप में) और G3BP2 8 शामिल है. कोशिकाओं तनाव 9 के अधीन हैं जब दोनों प्रोटीन, एसजीएस में colocalize. विहित आरएनए मान्यता आकृति (RRM) संरक्षित RNP1 और RNP2 रूपांकनों के साथ: G3BPs एक एन टर्मिनल NTF2 डोमेन प्रोलाइन अमीर (PxxP) रूपांकनों द्वारा पीछा उनके स्थानीयकरण और oligomerization, प्रभावित करने के लिए सुझाव शामिल है, तो सी टर्मिनल रूपांकनों शाही सेना बाध्यकारी के साथ जुड़े , एक arginine-ग्लाइसिन अमीर (RGG) बॉक्स के द्वारा पीछा किया. दिलचस्प है, EGFP के लिए जुड़े हुए अलग डोमेन के निर्माण से प्रोटीन के विभिन्न भागों का विश्लेषण NTF2 तरह डोमेन और शाही सेना बाध्यकारी डोमेन सबसे अधिक कुशलता से dimerization के गुणों के महत्व का सुझाव दे, एसजीएस के लिए भर्ती और शाही सेना में बाध्यकारी थे कि पता चला एसजीएस के विधानसभा. विभिन्न मॉडल विट्रो 10-13 में G3BP प्रोटीन के विभिन्न कार्यों से पता चला है.चूहों में G3BP के विघटन विकास विकास और अस्तित्व के 14, साथ ही स्थानिक काम स्मृति 15 में गतिभंग और दोषों के द्वारा होती केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में G3BP के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका में इस प्रोटीन का महत्व पता चला है. G3BP कमी एसजी गठन और neurodegenerative रोगों 15 के बीच सीधा संबंध स्थापित करने, बदल neuronal plasticity और कैल्शियम homeostasis की ओर जाता है. यह न्यूरॉन्स की तरह प्राथमिक कोशिकाओं में एसजीएस की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए सक्षम होने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है.

इस प्रोटोकॉल आर्सेनाइट उपचार के तहत प्राथमिक कोशिकाओं में G3BP1 युक्त एसजीएस के विधानसभा निरीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. यह तनाव का उदाहरण विभिन्न प्रकार के अलग अलग परिस्थितियों में एसजीएस विधानसभा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी एसजीएस के अन्य कणिकाओं या अन्य घटकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. दरअसल, इस प्रोटोकॉल G3BP1 पर केंद्रित है, लेकिन TIA-1 / आर, टीटीपी (tristetraprolin) 2 की तरह अन्य तनाव granules मार्कर कर रहे हैंFMRP (नाजुक एक्स मानसिक मंदता सिंड्रोम प्रोटीन) 16, तेदेपा -43 (transactive प्रतिक्रिया डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन 43) 17 या Staufen 18. विशेष रूप से, TIA-1 / आर की तरह प्रोटीन overexpressed जब अलग गठन एसजीएस समारोह, विनियमन और एसोसिएटेड टेप में अलग कर सकते हैं, भले ही, एसजीएस विधानसभा प्रेरित कर सकते हैं कि शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन nucleating, G3BP तरह, कर रहे हैं. एसजीएस के इन प्रमुख घटकों में से किसी एक या nucleators की fluorophore टैग संस्करण के अभिकर्मक छवि विशेष एसजीएस विधानसभा और गतिशीलता के लिए किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में सभी पशु प्रक्रियाओं 24 नवंबर 1986 (86-609/EEC) के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के दिशा निर्देशों के साथ कड़ाई से पालन कर रहे हैं. भोजन और पानी यथेच्छ की अनुमति समूह में सदन चूहों,. 12 घंटा प्रकाश: अंधेरे चक्र (7:00 बजे पर प्रकाश) एक 12 घंटे के साथ एक नियंत्रित वातावरण (22 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 55 ± 5% नमी) में उन्हें बनाए.

1 Murine प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति:. माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs)

  1. पतली संदंश, साथ ही घुमावदार संदंश और विदारक कैंची आटोक्लेव. एक बाँझ कंटेनर में स्टोर. बाँझ डी पीबीएस (Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा) का प्रयोग करें. पूरा MEFs मध्यम तैयार: 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FBS), 1 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, और 0.5 मिमी 2-mercaptoethanol के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) / F12 और 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म
  2. 13.5 दिनों बाद coïtum (डीपीसी में एक गर्भवती माउस (euthanize)) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से. 90% EtOH के साथ साफ माउस से गर्भाशय सींग निकालें. एक बाँझ और स्वच्छ हुड के तहत, 37 डिग्री सेल्सियस में भ्रूण के साथ सींग जगह डी पीबीएस prewarmed. सींग, जगह खोलें एक 100 मिमी बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश में भ्रूण, गर्भनाल सामग्री से उन्हें साफ और रक्त अतिरिक्त हटाने के लिए गर्म डी पीबीएस के साथ उन्हें धोने. एक दूरबीन के तहत, भ्रूण के अंग, आंतरिक अंगों को निकालने और मस्तिष्क युक्त सिर के ऊपरी भाग.
  3. एक नया पेट्री डिश में, कीमा एक बाँझ शल्य चिकित्सा के साथ बहुत छोटे टुकड़ों में भ्रूण ब्लेड या कैंची (कम से कम 1 मिनट के लिए). अलग जीनोटाइप के भ्रूण के मामले में, व्यक्ति पेट्री डिश में प्रत्येक भ्रूण डाला और जीनोटाइपिंग के लिए तेल या ऊपरी सिर रखने के लिए सावधान रहना होगा.
  4. 1x trypsin EDTA (0.25% trypsin, 1 मिमी EDTA) के साथ भ्रूण को कवर किया. 30 मिनट एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में घंटा 1 करने के लिए सेते हैं. पूरी की 10 मिलीलीटर जोड़ेंTrypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए MEFs मध्यम. Pipet और नीचे सभी समुच्चय को दूर करने के लिए. 10 मिनट के लिए (पूरा मध्यम से भरा) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन बैठते हैं, और कमरे के तापमान पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र. पूरा मध्यम (1 भ्रूण के लिए 6 मिलीग्राम) में गोली Resuspend. व्यवहार्य nucleated कोशिकाओं trypan का उपयोग गिना जा सकता है नीला (लगभग 5 x 10 6 कोशिकाओं एक भ्रूण से उम्मीद की जा सकती). 60 मिमी पेट्री डिश प्रति प्लेट 3 मिलीग्राम.
  5. अगले दिन मध्यम बदलें और कोशिकाओं को विकसित करने की अनुमति बर्तन मिला हुआ हैं जब तक. अनेक सेल प्रकार देखा जा सकता है, लेकिन केवल fibroblasts उपसंस्कृति बच जाएगा.
  6. कोशिकाओं को विभाजित और उन्हें अभिकर्मक के लिए 50-70% confluency तक, गिलास नीचे (समय चूक प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण) के साथ 35 मिमी व्यंजन में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. Mycoplasma और माउस रोगजनकों के लिए टेस्ट.

2. संस्कृति एकन्यूरॉन्स के प्रकरण में daptations

  1. संस्कृति के पहले दिन, पाली एल lysine एक बाँझ और स्वच्छ हुड के नीचे (0.1 मिलीग्राम / एमएल के 200 μl), और साथ कोट 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश रात भर छोड़ दें.
  2. अगली सुबह में, दो बार 45 मिनट घंटा 1 करने के लिए एक बार 5 मिनट के लिए, बाँझ शुद्ध पानी से कुल्ला. 2 DMEM के मिलीलीटर प्लस 10% FBS के माध्यम के साथ बदलें और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने के लिए.
  3. 18.5 डीपीसी में भ्रूण काटना. एक बाँझ और स्वच्छ हुड के तहत, 100 मिमी पेट्री डिश में ठंड बाँझ HBSS (हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) में भ्रूण के साथ सींग जगह है. नवजात पिल्ले भी बांध के जीवन की रक्षा और विशेष रूप से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है जो ट्रांसजेनिक जानवरों के मामले में, अधिक संतान उत्पन्न करने के लिए सक्षम करने के क्रम में बजाय भ्रूण का इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यक्तिगत पेट्री डिश में, प्रत्येक भ्रूण या नवजात ले और कैंची से सिर काट दिया. , आँखों में घुमावदार संदंश डालने से सिर पकड़ त्वचा में कटौती और सावधानी से पीछे से नरम खोपड़ी खोलनेसिर की आंखों तक, सिर के प्रत्येक पक्ष पर. ऑप्टिक नसों और ब्रेन स्टेम काटें, मस्तिष्क को हटा दें, और HBSS युक्त एक नया पेट्री डिश में डाल दिया. एक त्रिविमेक्ष के तहत, दो पतली संदंश का उपयोग सभी तानिका हटा दें. हिप्पोकाम्पी, प्रांतस्था या अध्ययन करने के लिए संरचना के आधार पर मस्तिष्क के किसी अन्य भाग से अलग करें.
  4. ठंड HBSS के 4.5 मिलीलीटर में विच्छेदित मस्तिष्क संरचना विसर्जित 15 मिलीलीटर ट्यूब में पहले से तैयार और trypsin के साथ पाचन तक बर्फ पर रहते हैं. 2.5% trypsin के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 20 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. पच मस्तिष्क भागों त्यागने नहीं करने के लिए अत्यंत सावधान किया जा रहा है, HBSS के साथ trypsin 3x कुल्ला.
  5. जब तक वहाँ एक 1 मिलीलीटर टिप से सुसज्जित एक 1 मिलीलीटर micropipette के साथ 1 मिलीलीटर (प्रांतस्था) DMEM प्लस 10% FBS और ऊपर pipet और नीचे कई बार करने के लिए 500 μl (हिप्पोकाम्पी) में Resuspend, तो, 1 मिलीग्राम से अधिक 200 μl सुझावों से लैस कोई दिखाई कुल.
  6. प्रत्येक 35 मिमी कांच Botto के लिए सेल निलंबन के 100-200 μl वितरितDMEM प्लस 10% FBS युक्त और न्यूरॉन्स कम से कम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पालन जाने एम पकवान. Prewarmed न्यूरॉन पूरा माध्यम से बदलें (Neurobasal मध्यम, 250 माइक्रोन एल glutamine और NS21 के साथ पूरक चेन एट अल. 19 में वर्णित के रूप में तैयार) और neuronal विकास अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें. (Div) (अभिकर्मक की दक्षता div लेकिन synaptic कनेक्शन के एक जोड़े को बेहतर 7-10 div से स्थापित कर रहे हैं के बाद अधिक है) इन विट्रो में 5 से 14 दिनों में न्यूरॉन्स Transfect.

EGFP-G3BP1 निर्माण के 3. अभिकर्मक

35 मिमी पकवान प्रति शुद्ध प्लाज्मिड की 3 ग्राम का उपयोग कर, एक फ्लोरोसेंट मार्कर (आदि GFP, YFP,) से जुड़े हुए अपने हित के प्रोटीन की सीडीएनए (एसजीएस के किसी भी घटक) युक्त एक सदिश के साथ कोशिकाओं Transfect.

  1. निर्माता प्रोटोकॉल (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें) के बाद, एक वाणिज्यिक विधि का उपयोग MEFs Transfect.
  2. एक कैल्शियम के साथ न्यूरॉन्स Transfect. ज़िया एट अल 20 संक्षेप से अनुकूलित फॉस्फेट विधि:
    1. समाधान तैयार: DMEM धोने: 25 मिमी KCl युक्त DMEM; अभिकर्मक समाधान: 1x DMKY (HEPES 5 मिमी, 2 MgCl 10 मिमी, फिनोल लाल) युक्त DMEM धोने; और सदमे समाधान: HeBS 1x, DMKY 1x, और DMSO 2% (v / v); और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए उन्हें
    2. न्यूरॉन्स, छानना से मीडिया निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना DMEM धोने के साथ धोएं तो अभिकर्मक मध्यम के साथ की जगह है और कैल्शियम फॉस्फेट प्लास्मिड डीएनए अवक्षेप की तैयारी के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना.
    3. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में, (इस क्रम में) ब्रौन पानी (अंतिम मात्रा 50 μl), 2 CaCl 2.5 एम के 5 μl, और प्लास्मिड डीएनए के 3 ग्राम जोड़ें. पहले से ही एक गोल नीचे polypropylene ट्यूब में पेश HeBS 2x के 50 μl पर इस मिश्रण गिरा. छोड़ने के साथ रोटेशन से ट्यूब मिलाएं. 30 मिनट के दौरान कमरे के तापमान पर वेग फार्म करते हैं.
    4. Precipitat जोड़ेंई न्यूरॉन्स पर dropwise और 30 से 50 मिनट के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें.
    5. 1 मिनट के लिए झटका समाधान के साथ बदलें, तो DMEM धोने से कुल्ला और अंत में preconditioned मध्यम reintroduce. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखें

एसजीएस विधानसभा और डायनेमिक्स युक्त G3BP के 4. विज़ुअलाइज़ेशन

  1. फिनोल लाल मुक्त माध्यम से फिनोल लाल होता है जो कोशिकाओं के माध्यम से बदलें.
  2. अधिग्रहण के लिए प्रतिदीप्ति से लैस एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें: पारा दीपक, कंप्यूटर, और पराबैंगनीकिरण. कम से कम 20 मिनट अधिग्रहण की शुरुआत से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए कक्ष को गर्म.
  3. G3BP की अधिक अभिव्यक्ति एसजीएस के एक प्रकार का सहज गठन लाती है. कोशिकाओं इस प्रकार तनाव प्रेरण बिना अभिकर्मक के बाद एसजीएस 24 घंटा अधिकार की विधानसभा के लिए मनाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, तनाव आगे एसजीएस के विधानसभा प्रेरित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. 0.5 मिमी सोडियम आर्सेनाइट और सितारा जोड़ेंसही यौगिक (कणिकाओं अच्छी तरह से 1 घंटे के भीतर का गठन किया जाएगा) के बाद इसके अलावा अधिग्रहण के लिए टी.
  4. विसर्जन उद्देश्य के लिए तेल जोड़ें (40x या 63X उद्देश्यों का उपयोग) और अनुकूलित 35 मिमी खुर्दबीन धारक में उद्देश्य अधिक पेट्री डिश स्थापित, मंच धारक पर स्थिर हो. डिश अधिग्रहण बदल दिया जाएगा अन्यथा फ्लैट है कि जाँच करें. प्रासंगिक फ्लोरोफोरे के अनुसार प्रतिदीप्ति प्रकाश पर मुड़ें और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कल्पना. ब्याज की एक सेल विरंजन और cytotoxicity कम करने के लिए क्षेत्र में एक बार प्रतिदीप्ति बंद करें.
  5. "हासिल" टैब में, टैग फ्लोरोफोरे (EGFP टैग G3BP का उपयोग करता है जो हमारे प्रोटोकॉल में 488 एनएम) की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के आधार पर लेसरों का चयन करें और पीएमटी के लिए अनुकूलित उत्सर्जन लम्बाई (photomultiplier ट्यूब) का चयन करें. शोर और oversaturation के साथ ही विषाक्तता को कम करने के लिए लेजर पावर (आमतौर पर नहीं 10% से अधिक) को समायोजित करें, और लाभ सेट और शोर अनुपात संकेत को संशोधित करने के लिए ऑफसेट.लेजर प्रदर्शनी की अवधि (रेखा औसत 2, फ्रेम औसत 1) कम करने के लिए (1000 हर्ट्ज) तेजी से स्कैन. अगर वांछित, जेड ढेर के लिए मापदंडों 3 डी में छवि (1 माइक्रोन की एक जेड कदम कोशिकाओं के साथ आम तौर पर ठीक है) को फिर से संगठित करने के लिए सक्षम होने के लिए निर्धारित किया है. प्रत्येक अधिग्रहण के बीच अंतराल समय का निर्धारण: छोटे अंतराल में एक और अधिक सुसंगत फिल्म प्राप्त करने की अनुमति है, लेकिन इस photobleaching और विषाक्तता (20 सेकंड के अंतराल वर्णित प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था) उत्पन्न हो सकता है. कुल अधिग्रहण की अवधि तनाव प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. कई G3BP युक्त एसजीएस आर्सेनाइट उपचार के तहत बहुत तेजी से गठन किया गया और उपचार के 1 घंटे के बाद अच्छी तरह से दिखाई दे रहे हैं कर रहे हैं: उस मामले में, 15 के अधिग्रहण की कुल अवधि के साथ, सही तनाव के बाद अधिग्रहण फिल्म और शुरू करने के लिए तेजी से कोशिकाओं को चुन - 20 मिनट कई एसजीएस के विधानसभा निरीक्षण करने के लिए काफी हद तक पर्याप्त.
  6. चित्र सहेजें और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के ढेर और फिल्म का पुनर्निर्माण किया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

तनाव दाना गठन तनाव apoptosis की रोकथाम के लिए जुड़े, मंजूरी दे दी है, जब तक ठप अनुवाद के साथ एक सेलुलर अनुकूलन की अनुमति, तनाव को कोशिकाओं की प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण है. यह परख परमिट कुंजी एसजीएस प्रोटीन घटकों के स्थानीयकरण (चित्रा 1) का पालन करते हुए, प्राथमिक कोशिकाओं में एसजीएस अध्ययन करने के लिए. G3BP, एसजीएस विधानसभा का एक महत्वपूर्ण कारक, सुसंस्कृत MEFs या न्यूरॉन्स (चित्रा 2A ए और सी) के cytoplasm में बल्कि विकीर्ण करते हुए मौजूद है, और स्पष्ट रूप से MEFs में आर्सेनाइट उपचार के साथ ही न्यूरॉन्स (चित्रा 2A बी के तहत असतत कणिकाओं में मौजूद है और है घ). प्राथमिक कोशिकाओं उदाहरण के लिए उनके घटकों में से एक के अभाव में तनाव granules के अध्ययन की अनुमति, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से प्राप्त किया जा सकता है. दिलचस्प है, माउस में G3BP1 की कमी, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की गंभीर दोषों को विशेष रूप से एक अनियमित पी ओर जाता हैऔर स्थानिक काम स्मृति की एक परिवर्तन (एक अंग clasping परीक्षण, चित्रा 2B में देखा है) सही ढंग से आंदोलनों का समन्वय करने के लिए अक्षमता के द्वारा होती henotype. G3BP1 न्यूरॉन्स में तनाव granules में मौजूद है, और यह एसजीएस अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative रोगों की शुरुआत में फार्म दिखाया गया है कि सभी को और अधिक रोचक है.

यह परख (चित्रा 1) इस प्रकार परमिट vivo में उनकी संरचना और विधानसभा अध्ययन करने के लिए अनिवार्य प्राथमिक कोशिकाओं, में एसजीएस अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, यह जीवित कोशिकाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और इस तरह एक या वास्तविक समय में अपने overexpressed घटकों के कई visualizing द्वारा, एसजीएस की गतिशीलता का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 चित्रा विधानसभा और गतिशीलता का पालन करने के लिए अनुमति देने के प्रतिनिधि समय चूक छवियों से पता चलता है G3BP1 युक्त आर्सेनाइट उपचार के बाद MEFs में एसजीएस. चित्रा -4 ए में, एक ही प्रयोग पंथ में murine hippocampal न्यूरॉन्स के साथ किया जाता हैure. EGFP-G3BP1 स्थानीयकरण आर्सेनाइट उपचार के बाद, बड़े subcellular बारीक संरचनाओं को और अधिक परिभाषित और छोटे granules, एसजीएस से चला जाता है. एसजीएस अधिक थे और अधिग्रहण जारी रखा () नहीं दिखाया लेकिन सेल आकारिकी बदलना शुरू कर दिया गया है अगर अधिक शायद की वजह से लेजर उत्तेजना से प्रेरित गर्मी और विषाक्तता को परिभाषित किया.

समय चूक सीधे एसजीएस गतिशीलता का पालन करने के लिए एक वीडियो का कब्जा परमिट. इसके अलावा, एक confocal खुर्दबीन का उपयोग जेड ढेर में एक छवि को फिर से संगठित करने और इस प्रकार (चित्रा 4 बी में एक निर्धारित समय में एक न्यूरॉन के लिए सचित्र) 3 आयामों में सेल भर शव का पूरी तरह से गतिशीलता का पालन करने के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल के मुख्य चरण के विवरणात्मक. प्राथमिक कोशिकाओं सुसंस्कृत हैंभ्रूण से (न्यूरॉन्स (एक) के लिए 18.5 डीपीसी (दिनों के बाद coitum) (या नवजात पिल्ले), MEFs के लिए 13.5 डीपीसी (ख)). EGFP-G3BP1 सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड के अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं जोर दिया जाता है और एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के साथ imaged. G3BP1 युक्त एसजीएस के गतिशीलता मनाया जाता है. न्यूरॉन्स MAP2 (ख) में G3BP1 धुंधला द्वारा (एक), MEFs में (Microtubule जुड़े प्रोटीन 2) धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे हैं. वे इनका तस्वीर है, साथ ही EGFP-G3BP1 स्वतंत्र तस्वीरें हैं और (एक) और में दी गई कोशिकाओं के अनुरूप नहीं है जो murine न्यूरॉन (ग) और fibroblast (डी), ट्रांसफ़ेक्ट के रूप में दिया जाता है (ख).

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए). सुसंस्कृत MEFs और hippocampal न्यूरॉन्स में G3BP स्थानीयकरण, इलाज या सोडियम आर्सेनाइट के साथ जोर दिया. G3BP, मुख्य रूप से cytoplasmic है MEFs (एक) में एक फैलाना धुंधला के साथ या न्यूरॉन्स कोशिकाओं पर बल दिया नहीं कर रहे हैं जब (ग) के सोमा में बड़ी बारीक संरचनाओं में. सोडियम आर्सेनाइट उपचार के 1 घंटे बाद, G3BP असतत cytoplasmic कणिकाओं में स्थानीयकृत हो जाता है (ख MEFs, और न्यूरॉन्स, घ). इधर, कोशिकाओं तय की और एक विरोधी G3BP1 एंटीबॉडी के साथ immunostained गया. MAP2 धुंधला सी में न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए परमिट) और घ). डीएनए Hoechst के साथ नीले रंग में काउंटर से सना हुआ था. स्केल सलाखों 2 माइक्रोन (ए और बी) का प्रतिनिधित्व करते हैं और 10 माइक्रोन (सी और डी). (बी). मंजिल (अंग clasping परीक्षण) की ओर पूंछ से उठा लिया जब G3BP1 को चूहों एक बल्ले की तरह आसन के करीब एक असामान्य पंजा-clasping पलटा दर्शाती हैं, WT चूहों (बाएं) अपने पैरों का विस्तार. एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की.

fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 3. एक Leica SP5 लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन (488 एनएम के तरंग दैर्ध्य में उत्तेजना) का उपयोग EGFP-G3BP1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट MEFs प्राप्त के साथ समय चूक प्रयोग में लगातार अधिग्रहण. अधिग्रहण सोडियम आर्सेनाइट के अलावा के बाद 10 मिनट के शुरू कर दिया, और 20 सेकंड के अंतराल के साथ 10 मिनट के दौरान प्राप्त किया गया. छह प्रतिनिधि चित्रों सोडियम आर्सेनाइट (0.5 मिमी) के अलावा के बाद सेकंड में समय टी के साथ दिया जाता है. तीर हम एसजीएस के विधानसभा देख सकते हैं जहां दो क्षेत्रों को दिखाते हैं. स्केल बार = 2 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. (ए). समय चूक प्रयोग में लगातार अधिग्रहण एक Leica SP5 लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन (उत्तेजना का उपयोग कर, EGFP-G3BP1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट murine hippocampal न्यूरॉन्स के साथ प्राप्त488 एनएम के तरंग दैर्ध्य में). अधिग्रहण सोडियम आर्सेनाइट के अलावा के बाद 5 मिनट शुरू कर दिया है, और 20 सेकंड के अंतराल के साथ 40 मिनट के दौरान प्राप्त किया गया. छह प्रतिनिधि चित्रों सोडियम आर्सेनाइट (0.5 मिमी) के अलावा के बाद सेकंड में समय टी के साथ दिया जाता है. तीर हम एसजीएस के विधानसभा देख सकते हैं जहां दो क्षेत्रों को दिखाते हैं. . स्केल बार 5 माइक्रोन डी का प्रतिनिधित्व करता है: डेन्ड्राइट; एक: अक्षतंतु. (बी). EGFP-G3BP1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट और सोडियम आर्सेनाइट के साथ इलाज एक न्यूरॉन की जेड ढेर (10 माइक्रोन की कुल से अधिक Z अक्ष में 5 अधिग्रहण) से 3 आयाम पुनर्निर्माण N:. Neurite (डेन्ड्राइट या अक्षतंतु). एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल चिंता अभिकर्मक और ध्यान से cytotoxicity नीचे कम करने के क्रम में निरीक्षण किया जा रहा है जो अधिक विशेष रूप से समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण में सबसे महत्वपूर्ण कदम है.

प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति के रूप में लंबे समय बाँझ शर्तों बनाए रखा है और सावधानी विच्छेदन और सेल हदबंदी चरणों के दौरान नुकसान को रोकने के क्रम में लिया जाता है, के रूप में एक कठिन हिस्सा नहीं है. MEFs जल्दी मार्ग पर जमी रखा जा सकता है. कैल्शियम फॉस्फेट के साथ न्यूरॉन अभिकर्मक अच्छी तरह से 21 काम करने के लिए दिखाया गया है और इस प्रोटोकॉल एट अल ज़िया से रूपांतरित किया. 20 अभिकर्मक का अच्छा स्तर में सक्षम बनाता है, लेकिन यह एक निश्चित कोशिका मृत्यु को उत्पन्न कर सकते हैं. यह समाधान के पीएच की जाँच करने और 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए, जो कैल्शियम फॉस्फेट प्लाज्मिड वेग, साथ न्यूरॉन्स की ऊष्मायन नजर रखने के लिए, संस्कृति के बाद कुछ दिनों के भीतर न्यूरॉन्स transfect करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें और ट्रॅन हटानेsfection मध्यम समुच्चय मनाया जाता है. DMEM के साथ washes की संख्या बढ़ाई जा सकती है.

कुछ एसजीएस प्रोटीन घटकों के अधिक अभिव्यक्ति TIA-1/4 आर या G3BP 5 के मामले में, इन प्रोटीनों की संपत्तियों बाध्यकारी oligomerization और शाही सेना को शामिल करने लगता है जो कणिकाओं का सहज विधानसभा की ओर जाता है. इस प्रकार, यह आप समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण शुरू कर सकते हैं, जिस पर समय को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है. कुछ एसजीएस जैसे ही प्रोटीन व्यक्त किया है जब EGFP-G3BP अभिकर्मक के बाद 24 घंटे के रूप में दिखाई दे रहे हैं. हालांकि, एक अतिरिक्त तनाव उत्प्रेरण विभिन्न प्रमुख घटकों के साथ एसजीएस के रूप में विभिन्न प्रकार के अलग हो सकता है जो अतिरिक्त कणिकाओं, के गठन की ओर विभिन्न तनावों 1,22,23 के तहत पहचान की गई है. एसजीएस के विधानसभा (उपवास के रूप में 10-20 मिनट के रूप में) जीवित कोशिकाओं में तेजी है, और कई कणिकाओं पूरी तरह से आर्सेनाइट उपचार के 1 घंटे के भीतर बनते हैं, इसे जल्द से जल्द पिछाड़ी के रूप में अधिग्रहण शुरू करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण हैईआर तनाव की प्रेरण विधानसभा का अध्ययन करना है तो. हालांकि बाद के चरणों में छोटे granules व्यापक ढांचे में सम्मिलित कर सकते हैं, एसजीएस की गतिशीलता भी अध्ययन किया जा सकता है, और इन संरचनाओं निश्चित नहीं होते: उनके घटकों पी निकायों, साइटों की तरह कणिकाओं की कोशिका द्रव्य या अन्य प्रकार के साथ विमर्श किया जा सकता है शाही सेना क्षय 3 की. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का तेजी से आँख का पता लगाने और अधिग्रहण के मानकों (विशेष रूप से एक्स, वाई, जेड और निर्देशांक) के तेजी से निगरानी photobleaching और अन्य है जो लेजर प्रेरित cytotoxicity, सीमित करने के लिए कणिकाओं के विधानसभा सहित एक फिल्म प्राप्त करने की अनुमति है, साथ ही लाइव इमेजिंग में महत्वपूर्ण कदम है. अधिग्रहण एक लंबे समय (आर्सेनाइट उपचार के साथ oxydative तनाव के शामिल होने के बाद अधिक से अधिक 1 घंटा) के लिए प्रदर्शन किया गया है यदि वास्तव में, कुछ मामलों में, हम महत्वपूर्ण सेल आकारिकी में परिवर्तन और कुछ कोशिकाओं की मौत भी निरीक्षण कर सकता. इन घटनाओं को रोकने के क्रम में, यह स्कैन दृढ़ करने के लिए और अंतराल में वृद्धि संभव हैप्रत्येक अधिग्रहण के बीच की अवधि. हालांकि, एक छोटा अंतराल परमिट बेहतर कल्पना की प्रोटीन युक्त एसजीएस के गतिशीलता का पालन करने के लिए, और एक और पूरी फिल्म प्राप्त करने के लिए. इस प्रकार, एक के बाद है जो दाना घटक पर, प्राथमिक सेल प्रकार पर निर्भर करता है, सीमित photobleaching और विषाक्तता के साथ सर्वश्रेष्ठ फिल्म प्राप्त करने के लिए एक प्रयोग करने के लिए पैरामीटर अनुकूलन, और जुड़े फ्लोरोफोरे अणु पर करना चाहिए.

फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग आम तौर पर प्रयोग की अवधि के लिए imaged किया जा पर्याप्त photostable हैं. अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में वे एक मजबूत संकेत उत्पादन ब्लीच करने के लिए धीमी गति से और nontoxic हैं, के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात है, वे कोशिकाओं के autofluorescence ऊपर संकेत देने के लिए काफी उज्ज्वल होना चाहिए और इस तरह मज़बूती से पता लगाया जा जा. दरअसल, प्राथमिक कोशिकाओं के कारण (mitochondria और लाइसोसोम) की तरह organelles के autofluorescence के लिए एक पृष्ठभूमि संकेत पैदा कर सकते हैं. हालांकि हमारे हाथ में, autofluorescence थाEGFP-G3BP की चमक के लिए बहुत कम की तुलना में, और यह ट्रांसफ़ेक्ट नहीं कोशिकाओं की तुलना में कोशिकाओं की EGFP संकेत भेद करना आसान था. कुल मिलाकर, इष्टतम फिल्टर और लेजर प्रकाश तीव्रता के स्तर के चुनाव कम विषाक्तता से जुड़े सही संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण होगा. छवियों मात्रात्मक अध्ययन किया जाना है, तो अंत में, यह प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता संस्कृति के माध्यम से घटकों जैसे पर्यावरणीय कारकों के प्रति संवेदनशील नहीं है कि यकीन होना जरूरी है.

एसजीएस गतिशीलता वास्तव में विभिन्न स्थितियों (उदाहरण के लिए जंगली प्रकार और नाक आउट जानवरों से कोशिकाओं) के बीच (granules के विधानसभा, आकार और संख्या की गति) तुलना की जा सकती. सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए, एक चाहिए प्रत्येक जीनोटाइप या (तीन अलग litters से) शर्त के कम से कम तीन विभिन्न जानवरों, और प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग में छवि के बीच 10 और 50 कक्षों से संस्कृति कोशिकाओं. यह कई पदों को चिह्नित करने के लिए संभव हैअधिग्रहण सॉफ्टवेयर में है और इस तरह एक अपेक्षाकृत कम समय में प्राप्त आंकड़ों में वृद्धि करने की अनुमति एक ही समय में छवि कई ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, के लिए. यह कोशिकाओं (एसजीएस की विधानसभा का अध्ययन किया जाता है जहां मामलों में, या लंबे अधिग्रहण में प्रयोगात्मक शर्तों cytotoxicity प्रेरित हो) पर बल दिया और imaged हैं एक बार आगे वही पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए मुश्किल हो जाएगा के रूप में एक साथ कई कोशिकाओं इमेजिंग दिलचस्प है. और (प्रत्येक व्यक्ति के 50 से अधिक कोशिकाओं) अधिक सांख्यिकीय प्रासंगिकता प्राप्त करने के लिए imaged कोशिकाओं की संख्या को बढ़ाने के लिए - - पैरामीटर "संख्या" और "आकार" एसजीएस के बढ़ाता हालांकि, जब कोशिकाओं को इतना, आर्सेनाइट उपचार के बाद तय किया जा सकता है एक ही पेट्री डिश पर अधिक कोशिकाओं का अध्ययन किया जा सकता है. वीडियो अभी भी इस मामले में गुणात्मक परिणाम के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्राथमिक जीवित कोशिकाओं में G3BP युक्त एसजीएस अध्ययन करने के लिए परमिट, और अन्य सेलुलर निकायों और अन्य प्रोटीन COMP करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता(एसजीएस और neuronal परिवहन कणिकाओं के लिए एसजीएस, FRMP और Staufen के लिए TIA-1 / आर) की तरह इन निकायों के onents. प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग उदाहरण ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए शामिल है, शारीरिक पढ़ाई के संदर्भ में विशेष रूप से दिलचस्प है. दरअसल, G3BP1 को चूहों उदाहरण के लिए 14,15 कामकाज एक एसजीएस एक जीव के अस्तित्व और विकास में कारक है, साथ ही सीएनएस में के आवश्यक कार्य से पता चलता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों अधिग्रहण प्रदर्शन किया गया जहां मोंटपेलियर रियो इमेजिंग (एमआरआई) मंच स्वीकार करना चाहते हैं. वे प्रोटोकॉल के विभिन्न भागों में उनकी मदद के लिए इसाबेल क्रिस्टीना लोपेज Mejia, एलेक्जेंड्रा मेट्ज़, इरीना Lassot, Solange Desagher, फेबियन Loustalot, और वर्जीनी Georget धन्यवाद. इस काम ला Recherche médicale (एफ आर) (Equipe एफ आर एम 2011-n ° DEQ20111223745) Fondation से बहना का समर्थन किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Gibco 21331 Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate Gibco 11360
Nonessential amino acids Gibco 11140
L-Glutamine Gibco 25030
Trypsin Gibco 15096
Glass bottom B-35 Greiner 627860/627861 Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
DMEM Gibco 31966 Prewarm at 37 °C
HeBS Sigma-Aldrich 51558
Neurobasal Gibco 21103 Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol Gibco 31350
Forceps Biotek DU-110-A Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps Biotek P-110-BUF Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors Biotek CM-85-BS Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent  Ozyme 101-10 MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
  2. Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
  3. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  4. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
  5. Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
  6. Parker, F., et al. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).
  7. Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
  8. Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
  9. Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
  10. Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
  11. Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
  12. Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
  13. Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
  14. Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
  15. Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
  16. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  17. Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
  18. Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
  19. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
  20. Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
  21. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
  22. Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
  23. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 87 तनाव दाना (एसजी) G3BP प्राथमिक कोशिकाओं न्यूरॉन्स
लाइव प्राथमिक कोशिकाओं में G3BP तनाव granules गतिशीलता के दृश्य
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, S., Tazi, J. Visualization… More

Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells. J. Vis. Exp. (87), e51197, doi:10.3791/51197 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter