Summary
Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.
Abstract
SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.
Introduction
Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral 1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de 2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación eucariota 2 α). SG son estructuras dinámicas que intercambian los componentes con los polisomas y otros gránulos como los P-cuerpos. Constituyen un "centro de triage", donde los ARNm se clasifican y procesan, ya sea para la traducción, el reinicio, la degradación o el paquete en mRNPs no polysomal estables 3. El conjunto de SGS es rápido but es un proceso gradual con numerosos pequeños agregados iniciales, que se unen en gránulos más grandes. El uso de inhibidores químicos que interrumpen o estabilizar los microtúbulos muestra que se requiere la red de microtúbulos para la dinámica de SG incluyendo los procesos de montaje, coalescencia y desmontaje.
El ensamblado dinámico de SGS también es promovida por la agregación de proteínas de unión de ARN-específicos (ARN-BP) como TIA-1 (de células T antígeno interna-1) y TIAR (proteína relacionada con el TIA-1), que son capaces de dimerizar y promover polysome desmontaje y el encaminamiento de los ARNm en SGS 4. G3BP (proteína de unión a dominio SH3 de RasGAP) es una ARN-BP tales que localiza a SGS cuando las células están estresados con arsenito o alta temperatura, y la sobreexpresión de G3BP desfosforilado pueden inducir conjunto de SG 5.
G3BP es un conservadas evolutivamente ARN-BP que se caracterizó inicialmente a través de su interacción con una proteína activadora de GTPasa Ras-(p RasGAP120 6); pero esta interacción ha sido recientemente revisada 7. La familia G3BP incluye dos miembros en los mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) y G3BP2 8. Ambas proteínas colocalize en SG, cuando las células son sometidas a estrés 9. G3BPs comprenden un dominio N-terminal NTF2 sugerido para influir en su localización y oligomerización, seguido de prolina ricos (PxxP) los motivos, a continuación, los motivos C-terminales asociados con RNA vinculante: la canónica ARN-Reconocimiento Motif (RRM) con RNP1 y RNP2 motivos conservados , seguido de una rica cuadro de arginina-glicina (RGG). Curiosamente, el análisis de diferentes partes de la proteína mediante la construcción de diferentes dominios fusionados a EGFP mostró que el dominio NTF2-y el dominio de unión al ARN fueron la reclutó más eficiente a SGS, lo que sugiere la importancia de las propiedades de la dimerización y de unión al ARN en la asamblea de SGS. Diversos modelos han revelado diferentes funciones de las proteínas G3BP in vitro 10-13.La interrupción de la G3BP en ratones han demostrado la importancia de esta proteína en el desarrollo del crecimiento y la supervivencia 14, así como un papel importante para G3BP en el Sistema Nervioso Central (SNC), caracterizado por ataxia y defectos en memoria de trabajo espacial 15. Deficiencia G3BP conduce a la alteración neuronal plasticidad y calcio homeostasis, estableciendo un vínculo directo entre la formación de SG y enfermedades neurodegenerativas 15. Es por lo tanto importante ser capaz de estudiar la dinámica de SG en células primarias como las neuronas.
Este protocolo proporciona una manera simple de observar el conjunto de contener G3BP1-SG en células primarias bajo tratamiento arsenito. Se puede utilizar para estudiar el montaje SG bajo diferentes condiciones, por ejemplo, diferentes tipos de tensiones. También se puede adaptar a otros gránulos u otros constituyentes de SGS. De hecho, este protocolo se centra en G3BP1, pero hay otros marcadores de gránulos de estrés como TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (proteína X Frágil Retraso Mental Síndrome) 16, (proteína de unión a DNA respuesta transactivo 43) TDP-43 17 o Staufen 18. En particular, las proteínas como TIA-1 / R son, como G3BP, nucleación proteínas de unión de ARN que pueden inducir conjunto de SG cuando se sobreexpresa, incluso si los diferentes SG formados pueden diferir en función, regulación y transcripciones asociadas. La transfección de versión fluoróforo de etiquetado de cualquiera de estos componentes clave o nucleadores de SGS se puede realizar para la imagen de montaje y la dinámica particular, SGS.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales en este protocolo son, en estricto apego a las directrices de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 24 de noviembre de 1986 (86-609/EEC). La casa de los ratones del grupo, permitiendo que los alimentos y el agua ad libitum. Mantener en un ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) con un 12 hr: 12 horas de luz: oscuridad ciclo (la luz a las 7:00 de la mañana).
1 Cultura de células murinas primarias:. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Autoclave pinzas delgadas, así como pinzas curvas y tijeras de disección. Almacene en un recipiente estéril. Utilice estéril D-PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco). Preparar medio completo MEFs: medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% de aminoácidos no esenciales, y 0,5 mM de 2-mercaptoetanol y caliente a 37 ° C.
- La eutanasia a un ratón embarazadas (13,5 días post-coito (dpc)) Por dislocación cervical. Retire los cuernos uterinos del ratón desinfectado con un 90% de EtOH. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en 37 ° C precalentado D-PBS. Abra el cuernos, el lugar los embriones en un 100 mm placa Petri de plástico estéril, limpiarlos a partir del material del cordón umbilical y lavarlos con agua tibia D-PBS para eliminar el exceso de sangre. En virtud de un binocular, retire las extremidades del embrión, los órganos internos y la parte superior de la cabeza que contiene el cerebro.
- En una nueva placa de Petri, picar el embriones en piezas muy pequeñas con una estéril quirúrgica cuchilla o tijeras (por lo menos durante 1 min). En el caso de los embriones de diferentes genotipos, tenga cuidado de poner cada embrión en platos individuales de Petri y mantener la cola o la cabeza superior para el genotipado.
- Cubrir el embrión con 1x tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 h en una incubadora a 37 °. Añadir 10 ml de completaMEFs medio para detener la reacción con tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todos los agregados. Dejar reposar la suspensión de células en un tubo de 50 ml (llenado con medio completo) durante 10 min, y se centrifuga el sobrenadante durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en medio completo (6 ml para 1 embrión). Células nucleadas viables pueden contarse utilizando tripano azul (Alrededor de 5 x 10 6 células se puede esperar de un embrión). Placa 3 ml por 60 mm placa de Petri.
- Cambie el medio al día siguiente y permiten que las células crezcan hasta que son confluentes los platos. Muchos tipos de células se pueden ver, pero sólo fibroblastos sobrevivirán subcultivo.
- Dividir las células y les permiten crecer en placas de 35 mm con fondo de cristal (importante para el experimento lapso de tiempo), hasta el 50-70% de confluencia para la transfección. Prueba para Mycoplasma y patógenos del ratón.
2. Cultura Adaptations en el Caso de las neuronas
- El día anterior a la cultura, la capa 35 mm con fondo de cristal cajas de Petri con poli-L-lisina (200 l de 0,1 mg / ml) en una campana estéril y limpio, y dejar toda la noche.
- En la mañana siguiente, enjuagar con agua pura estéril, dos veces por 5 min y una vez durante 45 minutos a 1 hora. Reemplace con 2 ml de DMEM más 10% de medio FBS y manténgalo en un incubador a 37 ° C.
- Diseccionar embriones en el 18,5 dpc. Bajo una campana estéril y limpia, colocar los cuernos con los embriones en frío HBSS estéril (solución salina equilibrada de Hank) en 100 mm de placa de Petri. Cachorros neonatales también se pueden utilizar en lugar de embriones con el fin de preservar la vida de la presa y le permiten producir más descendencia, especialmente en el caso de animales transgénicos que pueden ser difíciles de obtener. En platos individuales Petri, tome cada embrión o el recién nacido y cortar la cabeza con unas tijeras. Sostenga la cabeza mediante la inserción de pinzas curvas en los ojos, cortar la piel y con cuidado abra el cráneo blando de la parte posteriorde la cabeza hasta los ojos, a cada lado de la cabeza. Cortar los nervios ópticos y el tronco cerebral, retire el cerebro, y lo puso en una nueva placa de Petri que contiene HBSS. En virtud de un estereoscopio, quite todas las meninges utilizando dos pinzas finas. Separar el hipocampo, la corteza o cualquier otra parte del cerebro dependiendo de la estructura a estudiar.
- Sumerja la estructura del cerebro disecado en 4,5 ml de HBSS frío preparado previamente en tubos de 15 ml y mantener en hielo hasta que la digestión con tripsina. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Enjuague el 3x tripsina con HBSS, siendo extremadamente cuidadoso para no descartar las partes del cerebro digeridos.
- Resuspender en 500 l (hipocampos) hasta 1 ml (corteza) DMEM más 10% de SFB y pipetear hacia arriba y abajo varias veces con una micropipeta 1 ml equipado con una punta de 1 ml, a continuación, equipada con 1 ml en 200 l consejos, hasta que haya sin agregado visible.
- Distribuir 100-200 l de suspensión celular a cada 35 mm de vidrio Bottom plato que contiene DMEM más 10% de SFB y dejar que las neuronas se adhieren a 37 ° C durante al menos 3 horas. Reemplazar por medio completo neurona precalentado (medio Neurobasal suplementado con 250 mM de L-glutamina y NS21, preparado como se describe en Chen et al. 19) y dejar a 37 ° C para permitir el crecimiento neuronal. Transfectar las neuronas en 5 a 14 días in vitro (div) (la eficiencia de transfección es mayor después de un par de conexiones sinápticas div pero son mejores estableció 7-10 div).
3. La transfección de los Constructos EGFP-G3BP1
Transfectar las células con un vector que contiene el ADNc de la proteína de interés (cualquier componente de SGS) fusionado a un marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 g de plásmido purificado por placa de 35 mm.
- Transfectar las MEFs utilizando un método comercial, siguiendo el protocolo del fabricante (Véase la Tabla de Materiales / Reactivos).
- Transfectar las neuronas con un calciométodo del fosfato adaptado de Xia et al 20 Brevemente.:
- Preparar las soluciones: DMEM-wash: DMEM que contiene 25 mM KCl; solución de transfección: DMEM-lavado que contiene 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, rojo fenol); y la solución de choque: HeBS 1x, 1x DMKY, y DMSO al 2% (v / v); y mantenerlos a 37 ° C.
- Retire el papel de las neuronas, filtrado, y la mantendrá a 37 ° C. Lavar con DMEM-wash luego vuelva a colocar con medio de transfección y mantenerse a 37 ° C durante la preparación de los precipitados de calcio en el ADN plásmido de fosfato.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir (en este orden) de agua Braun (volumen final 50 l), 5 l de CaCl2 2,5 M, y 3 g de ADN plásmido. Deja esta mezcla en 50 l de HeBS 2x ya introducidos en un tubo de polipropileno de fondo redondo. Mezclar el tubo por rotación junto con la caída. Que la forma precipitado a temperatura ambiente durante 30 min.
- Añadir el precipitantee gota a gota sobre las neuronas y dejar a 37 ° C durante 30 a 50 min.
- Reemplace con una solución de choque durante 1 minuto y luego enjuague con DMEM-lavado y finalmente reintroducir el medio preacondicionado. Mantener las células a 37 ° C.
4. Visualización de G3BP Contiene Asamblea SG y Dinámica
- Sustituya el medio de las células que contiene rojo fenol por medio libre de rojo fenol.
- Utilice un microscopio confocal equipado con fluorescencia para las adquisiciones. Encienda los sistemas de microscopios: lámpara de mercurio, el ordenador y los láseres. Calentar la cámara a 37 ° C al menos 20 min antes del comienzo de las adquisiciones.
- La expresión más de G3BP induce la formación espontánea de un tipo de SGS. Las células pueden por lo tanto ser observadas para el montaje de SG de 24 horas después de la transfección sin inducción de estrés. Alternativamente, la tensión puede ser inducida para inducir aún más el montaje de SGS. Añadir arsenito de sodio 0,5 mM y la estrellat la adquisición justo después de la adición del compuesto (gránulos serán bien formadas dentro de 1 hora).
- Añadir aceite al objetivo de inmersión (40X o 63X utilizar objetivos) e instale la placa de Petri sobre el objetivo en el soporte de microscopio adaptado 35 mm, estabilizado en el soporte de la platina. Compruebe que el plato es plana lo contrario las adquisiciones serán alterados. Encienda la luz de fluorescencia de acuerdo con el fluoróforo relevante y visualizar las células transfectadas. Apagar la fluorescencia una vez una célula de interés está en el campo con el fin de minimizar la decoloración y la citotoxicidad.
- En el "adquirir ficha", seleccione los láseres en función de la longitud de onda de excitación del fluoróforo tag (488 nm en el protocolo que utiliza G3BP etiquetados-EGFP) y seleccionar la longitud de emisión adaptado al PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar la potencia del láser (por lo general no más de 10%) para minimizar el ruido y la sobresaturación, así como la toxicidad, y establecer la ganancia y el desplazamiento para modificar la relación señal a ruido.Escaneado rápido (1000 Hz) con el fin de reducir al mínimo la duración de la exposición láser (línea media 2, promedio cuadro 1). Si lo desea, configure los parámetros de la pila de Z a ser capaz de reconstruir la imagen en 3D (un paso Z de 1 micra es generalmente muy bien con las células). Determinar el tiempo de intervalo entre cada adquisición: intervalos más pequeños permiten obtener una película más coherente pero esto puede inducir fotoblanqueo y la toxicidad (un intervalo de 20 seg se usó en los experimentos descritos). Duración de adquisición total puede variar dependiendo del tipo de estrés. Muchos SGS contiene G3BP-se forman muy rápidamente bajo tratamiento arsenito y son bien visibles después de 1 hora de tratamiento: en ese caso, elegir rápidamente las células para filmar y comenzar las adquisiciones justo después del estrés, con una duración total de las adquisiciones de 15 - 20 min más que suficiente para observar el montaje de varias Comisiones de Estudio.
- Guardar las imágenes y la reconstrucción de las pilas y la película utilizando el software ImageJ.
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Representative Results
La formación de estrés gránulo es importante en la respuesta de las células al estrés, lo que permite una adaptación celular con traducción estancado, hasta que la tensión ha despejado, asociado a la prevención de la apoptosis. Permisos de este ensayo para estudiar los SG en células primarias, siguiendo la localización de los componentes clave de proteínas SGs (Figura 1). G3BP, un factor clave de reunión SG, está presente en lugar de modo difuso en el citoplasma de neuronas o MEFs (Figura 2A A y C) cultivadas, y está claramente presente en gránulos discretos en tratamiento arsenito en MEFs, así como las neuronas (Figura 2A y B d). Las células primarias se pueden obtener a partir de modelos de ratones transgénicos, lo que permite por ejemplo el estudio de gránulos de estrés en la ausencia de uno de sus componentes. Curiosamente, la deficiencia de G3BP1 en ratón conduce a graves defectos del sistema nervioso central, en particular un p atáxicahenotype caracterizado por la incapacidad para coordinar los movimientos correctamente (como se ve en una prueba de abrazadera extremidad, la Figura 2B) y una alteración de la memoria de trabajo espacial. G3BP1 está presente en gránulos de estrés en neuronas, y esto es tanto más interesante que la SGS se ha demostrado que formar en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.
Este ensayo (Figura 1) por lo tanto permite estudiar SG en células primarias, indispensables para estudiar su composición y el montaje in vivo. Además, permite el estudio de células vivas y por lo tanto se puede utilizar para seguir la dinámica de SG, mediante la visualización de uno o varios de sus componentes sobreexpresa en tiempo real. La Figura 3 muestra imágenes con lapso de tiempo representativos que permiten seguir el montaje y la dinámica de los SG en MEFs después del tratamiento arsenito contiene G3BP1-. En la figura 4A, el mismo experimento se realiza con las neuronas del hipocampo murinos en el cultoUre. Localización EGFP-G3BP1 va desde grandes estructuras granulares subcelulares a gránulos más definidos y más pequeños, el SGS, después del tratamiento arsenito. SG eran más y más define si se continuaron las adquisiciones (no se muestra), pero la morfología de las células empezaron a cambiar, probablemente debido al calor y la toxicidad inducida por el láser de excitación.
Lapso de tiempo permite la captura de un vídeo de observar directamente la dinámica SGS. Además, el uso de un microscopio confocal permite reconstruir una imagen en Z pila y por lo tanto a seguir completamente la dinámica de los órganos en toda la célula en 3 dimensiones (como se ilustra para una neurona en un momento definido en la Figura 4B).
Figura 1. Descriptivo de las principales etapas del protocolo. Las células primarias se cultivana partir de embriones (18,5 dpc (días post-coito) (o cachorros neonatales) para las neuronas (a), 13.5 dpc para MEFs (b)). Después de la transfección de un plásmido que contiene ADNc de EGFP-G3BP1, las células se subrayaron y la imagen con un microscopio confocal de barrido láser. Se observan Dinámica de SGS contiene G3BP1-. Las neuronas se visualizaron por MAP2 (proteína asociada a microtúbulos 2) tinción en (a), MEFs por tinción G3BP1 en (b). Ellos se ofrecen como ilustrativos imágenes, así como EGFP-G3BP1 transfectadas neurona murino (c) y fibroblastos (d), que son imágenes independientes y no corresponden a las células dadas en (a) y (b).
Figura 2. (A). G3BP localización en MEFs cultivadas y las neuronas del hipocampo, sin tratar o estresado con arsenito de sodio. G3BP es principalmente citoplasmática, con una tinción difusa en MEFs (A) o en grandes estructuras granulares en el soma de las neuronas (c) cuando las células no están estresados. Después de 1 h de tratamiento arsenito de sodio, G3BP se convierte localizada en gránulos discretos citoplasmáticos (MEFs, B y neuronas, d). Aquí, las células se fijaron y se inmunotiñeron con un anticuerpo anti-G3BP1. Permisos de tinción MAP2 para identificar neuronas en c) yd). ADN se tiñó de venta libre en azul con Hoechst. Las barras de escala representan 2 micras (A y B) y 10 micras (C y D). (B). Cuando levantó la cola hacia el suelo (prueba extremidad juntando), los ratones WT extienden sus piernas (a la izquierda) mientras que los ratones KO G3BP1 muestran un reflejo anormal pata-juntando cerca de una postura de murciélago. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Figura 3. Adquisiciones sucesivas en el experimento de lapso de tiempo obtenidos con MEFs transfectadas con EGFP-G3BP1, utilizando un microscopio confocal de barrido con láser Leica SP5 (excitación a una longitud de onda de 488 nm). Las adquisiciones se iniciaron 10 minutos después de la adición de arsenito de sodio, y obtuvieron durante 10 minutos con intervalos de 20 seg. Seis imágenes representativas se dan, con t el tiempo en segundos después de la adición de arsenito de sodio (0,5 mM). Las flechas muestran dos áreas en las que podemos ver el conjunto de SGS. Barra de escala = 2 m.
Figura 4. (A). Adquisiciones sucesivas en experimentos de lapso de tiempo obtenidos con las neuronas del hipocampo murino transfectadas con EGFP-G3BP1, utilizando un escaneo láser Leica SP5 microscopio confocal (excitacióna una longitud de onda de 488 nm). Las adquisiciones se iniciaron 5 minutos después de la adición de arsenito de sodio, y obtuvieron durante 40 minutos con intervalos de 20 seg. Seis imágenes representativas se dan, con t el tiempo en segundos después de la adición de arsenito de sodio (0,5 mM). Las flechas muestran dos áreas en las que podemos ver el conjunto de SGS. La barra de escala representa 5 micras d:. Dendrita; a: axón. (B). Reconstrucción 3-dimensión de pila Z (5 adquisiciones en el eje Z más de un total de 10 micras) de una neurona transfectadas con EGFP-G3BP1 y tratados con arsenito sódico n:. Neuritas (dendrita o axón). Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
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Discussion
Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad.
Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los pasajes. Transfección neurona con fosfato de calcio se ha demostrado que funciona bien 21 y este protocolo adaptado de Xia et al. 20 permite buen nivel de transfección, sin embargo, puede inducir un cierto muerte celular. Es importante para transfectar las neuronas dentro de unos pocos días después de la cultura, para comprobar el pH de las soluciones y para controlar la incubación de las neuronas con el precipitado plásmido con fosfato de calcio, que no debe ser superior a 1 hora. Revise debajo de un microscopio de luz y retire la tranmedio sfection si se observan agregados. El número de lavados con DMEM que se puede aumentar.
La expresión de algunos componentes de la proteína SGs conduce a la asamblea espontánea de gránulos, que parece implicar la oligomerización y ARN propiedades de estas proteínas de unión, como en el caso de TIA-1 / R 4 o G3BP 5. Por lo tanto, es importante definir el momento en que usted puede comenzar a las adquisiciones de lapso de tiempo. Unos SG son visibles tan pronto como 24 horas después de la transfección EGFP-G3BP, cuando se expresa la proteína. Sin embargo, la inducción de una tensión adicional conduce a la formación de gránulos adicionales, que pueden variar según los diferentes tipos de SG con diferentes componentes claves han sido identificados bajo diferentes tensiones 1,22,23. Asamblea de SGS es rápido en las células vivas (tan rápido como 10 a 20 min), y muchos gránulos se forman por completo dentro de 1 hora de tratamiento arsenito, por lo que es importante iniciar las adquisiciones tan pronto como sea posible a popaer la inducción de estrés si el conjunto tiene que ser estudiado. En etapas posteriores sin embargo, la dinámica de SGS también pueden ser estudiados, como pequeños gránulos pueden unirse en estructuras más grandes, y estas estructuras no son fijos: sus componentes se pueden intercambiar con el citoplasma o otros tipos de gránulos como los P-cuerpos, sitios ARN de decaimiento 3. Ojo-La detección rápida de las células transfectadas rápida y control de los parámetros de adquisiciones (especialmente X, Y, y Z coordenadas) permiten obtener una película, incluido el montaje de gránulos, así como para limitar fotoblanqueo y la citotoxicidad inducida por láser, que es el otro paso crítico en la formación de imágenes en directo. De hecho, en algunos casos, podríamos observar cambios importantes en la morfología celular e incluso la muerte de algunas células, si se llevaron a cabo las adquisiciones durante mucho tiempo (más de 1 hora después de la inducción de estrés oxidativo con el tratamiento arsenito). Con el fin de prevenir estos fenómenos, es posible fijar la exploración y para aumentar los intervalosduración entre cada adquisición. Sin embargo, unos más cortos permisos de intervalo para seguir mejor la dinámica de SG que contienen la proteína visualizado, y para obtener una película más completa. Por lo tanto, uno debe adaptar los parámetros para cada experimento para obtener la mejor película con fotoblanqueo y la toxicidad limitada, dependiendo del tipo de célula primaria, en el componente de gránulo que es seguido, y en la molécula de fluoróforo asociado.
Etiquetas de proteínas fluorescentes son generalmente suficientemente fotoestables en ser fotografiado para la duración del experimento. Diferentes proteínas fluorescentes pueden funcionar bien, siempre y cuando produzcan una señal fuerte, son lentos para blanquear y no tóxico. Es importante destacar, que debe ser lo suficientemente brillante como para dar la señal por encima de la autofluorescencia de las células y pueden ser detectadas por tanto fiable. De hecho, las células primarias pueden inducir una señal de fondo debido a la autofluorescencia de los orgánulos (como las mitocondrias y lisosomas). Sin embargo, en nuestras manos, autofluorescencia eramuy bajo en comparación con el brillo de EGFP-G3BP, y era fácil de distinguir la señal de EGFP de células transfectadas en comparación con las células no transfectadas. En general, la elección de filtros óptimos y niveles de intensidad de luz láser será fundamental para obtener la relación correcta entre señal y ruido, asociado a una baja toxicidad. Finalmente, si las imágenes tienen que ser estudiado cuantitativamente, es importante estar seguro de que la intensidad de fluorescencia de la proteína no es sensible a los factores ambientales como componentes del medio de cultivo.
Dinámica SGs de hecho se pueden comparar (rapidez de montaje, el tamaño y número de gránulos) entre diferentes condiciones (células de tipo salvaje y los animales knock-out, por ejemplo). Con el fin de obtener resultados estadísticamente significativos, se debe células de cultivo de al menos tres animales diferentes de cada genotipo o condición (a partir de tres camadas diferentes), y la imagen de entre 10 y 50 células en cada experimento independiente. Es posible marcar varias posicionesen el software de adquisiciones y por lo tanto a la imagen varias células transfectadas al mismo tiempo, que permitan aumentar los datos obtenidos en un tiempo relativamente corto. Imaging varias celdas al mismo tiempo es interesante, ya que será difícil de usar más la misma placa de Petri una vez que las células están estresadas y la imagen (en los casos en que se estudia el conjunto de SGS, o si las condiciones experimentales en las adquisiciones largas inducen citotoxicidad). Sin embargo, cuando la cuantificación de los parámetros "número" y el "tamaño" de SGS - y con el fin de aumentar el número de células fotografiados para obtener más relevancia estadística (más de 50 células de cada individuo) - células se pueden fijar después del tratamiento arsenito, por lo que más células en la misma placa de Petri pueden ser estudiados. Vídeos Todavía se utilizarán como los resultados cualitativos en este caso.
El protocolo descrito aquí permite estudiar contiene G3BP-SG en células vivas primarios, y puede ser adaptado a otros cuerpos celulares y otros borrador proteínasonents de estos órganos (como TIA-1 / R para la SG, FRMP y Staufen de Comisiones de Estudio y gránulos de transporte neuronales). El uso de células primarias es particularmente interesante en el contexto de estudios fisiológicos, que implica por ejemplo animales transgénicos. De hecho, los ratones KO G3BP1 revelan, por ejemplo, la función esencial de un factor de SG en la supervivencia y el desarrollo de un organismo, así como en el SNC funcionamiento 14,15.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer la plataforma Montpellier Rio Imaging (MRI) en la que se realizaron las adquisiciones. Agradecen a Isabel Cristina López Mejía, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot y Virginie Georget por su ayuda en diferentes partes del protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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