Summary
Den Quellung reaktion er den gyldne standard teknik til serotypning Streptococcus pneumoniae. Denne teknik udnytter et mikroskop og specifik pneumokok antisera og er almindeligt anvendt i reference og forskningslaboratorier verden over.
Abstract
Der er over 90 forskellige kapsulære serotyper af Streptococcus pneumoniae (Pneumokokker). Samt at det er et redskab til at forstå pneumokok-epidemiologi, kan capsular serotypning give nyttige oplysninger til undersøgelser vaccinens effekt og virkning. Den Quellung reaktion er den gyldne standard metode til pneumokok kapsel-serotypning. Fremgangsmåden involverer afprøvning af en pneumokok cellesuspension med poolet og specifikke antisera rettet mod kapselpolysaccharidet. Antigen-antistof-reaktioner observeres mikroskopisk. Protokollen har tre trin: 1) udarbejdelse af en bakteriel celle suspension, 2) blanding af celler og antisera på en glasplade, og 3) med at læse Quellung reaktion ved hjælp af et mikroskop. Den Quellung reaktion er rimelig enkel at udføre og kan anvendes, hvor et egnet mikroskop og antisera er tilgængelige.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker) er ansvarlig for død af en anslået 800.000 børn under fem år årligt med sygdomsbyrden falder overvejende ressourcefattige lande 1. Pneumokoksygdom variere i sværhedsgrad fra lokaliserede infektioner såsom akut otitis media til alvorlige livstruende infektioner, såsom sepsis, meningitis og lungebetændelse 2. Over 90 capsular serotyper af pneumokokker er blevet beskrevet 3, 4. Aktuelle Pneumokokvacciner yde beskyttelse mod de serotyper, der er ansvarlige for størstedelen af invasiv sygdom 5, 6. Imidlertid har udbredt anvendelse af vacciner været forbundet med udskiftning af serotyper i vaccinen ved nonvaccine serotyper, både i nasopharyngealt vogn og invasiv sygdom 7, 8. Dette understreger betydningen af serotypning til epidemiologiskovervågning og langsigtet vaccine konsekvensanalyser 9.
Den gyldne standard metode til pneumokok skrive er kapselåbningen reaktion test, kendt som Quellung reaktion, første gang beskrevet af Neufeld i 1902 (se østrigsk 10). Der er fundet en høj grad af overensstemmelse mellem laboratorier og mellem Quellung reaktion og andre serotypning metoder 11-13. Der er flere variationer af Quellung reaktion 10, 14-16. Den her beskrevne metode kræver ikke brug af en tæller plet eller oliebestandighedsobjektet linse, men snarere, en dråbe af tilberedte prøve er blandet med maskinskrivning serum og undersøges straks under 400X forstørrelse.
Den Quellung Reaktionen udføres sædvanligvis ved anvendelse af kommercielt tilgængelige antisera. Den her beskrevne metode anvender mindre antisera sammenlignet med nogle andre metoder, 16, 17, hvilket gør det mere omkostningseffektivt. Når en isolspiste er identificeret som pneumokok det sekventielt testet med antisera puljer, indtil en positiv reaktion. Hver pulje antiserum indeholder forskellige blandinger af antisera rejst mod 91 pneumokok serotyper 18. Når puljen er etableret, bliver den enkelte type og gruppe antisera, der er inkluderet i den reaktive pulje testet enkeltvis i rækkefølge. Type antisera generelt reagerer med en enkelt serotype (fx type 1 antiserum reagerer med serotype 1), mens gruppe antisera reagere med alle de serotyper i en bestemt gruppe (f.eks Gruppe 22 antiserum reagerer med serotyper 22F og 22A). Nogle serotyper inden for grupper er differentieret yderligere hjælp faktor antisera (f.eks Serotype 22F reagerer med faktor 22b, men ikke 22c). I dette tilfælde test fortsættes med alle relevante faktor antisera indtil serotype bestemmes 19, 20. Den Quellung reaktionen er enkel og hurtig 14 og kan udføres i enhver laboratory der er udstyret med en god kvalitet mikroskop og passende sæt antisera.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Cell suspension Typing
- Ved hjælp af en steril engangs 1 gl loop, tage en lille feje af frisk natten renkultur af pneumokokker dyrket på fast selektive hesteblod agar og vaccinere 100 ul Heart Infusion (HI) bouillon. Suspensionen bør synes at være lige synligt uklar. Omryst forsigtigt røret for at emulgere.
Bemærk: Andre medier såsom Brain Heart Infusion bouillon kan også være egnede. Tilsætning af serum (f.eks en slutkoncentration på 10% (v / v) hesteserum) og inkubation ved 37 ° C i cirka 1 time før brug kan anvendes til at forøge reaktionshastigheden.
2. Kontrol Density cellesuspension
Cellesuspensionen forberedt i trin 1.1 vil også blive brugt som negativ kontrol, og skal kontrolleres for celletæthed, før du tilføjer skrive sera.
- Ved hjælp af en 1 gl loop, overføre en dråbe af inoculum forberedt i trin 1.1 på et glass objektglas.
- Ved hjælp af en pincet, placere en lille cirkulær dækglas om suspension.
- Brug fasekontrast-indstilling, observere forberedelse mikroskopisk under 400X forstørrelse, for at kontrollere tætheden af suspensionen (figur 1A).
- Hvis inokulum er for tung (figur 2A), tilføje mere bouillon til cellesuspensionen i trin 1.1 for at fortynde den. Bland forsigtigt igen.
- Hvis inokulum er for lys, for eksempel, er der <50 celler synlige i det mikroskopiske område (figur 2B), tilføje flere bakterier til fremstilling cellesuspension fremstillet i trin 1.1 og bland forsigtigt.
Bemærk: Med erfaring, kan tætheden af cellesuspensionen bedømmes ved at ryste og holde op mod lyset, hvor det skal vises at være lige synligt uklar.
- Gentag trin 2.1-2.3, indtil et passende antal celler er synlige i det mikroskopiske område.
Bemærk: Glas dias og coverslips præsentere en affaldsbeholder fare. Efter brug, er dias og dækglas forurenet med smittefarligt materiale og skal bortskaffes i en af laboratoriet.
3. Typing
- Overfør ~ 1 pi af den fremstillede inokulum (fx anvendelse af en 1 ul loop) på objektglas. Kassér løkken ind for biologisk betinget fare affaldsbeholder.
- Tilføj en tilsvarende mængde (1 ul øskenfuld) af stuetemperatur antiserum på dias og bland begge falder godt med sløjfen.
- Ved hjælp af en pincet, placere en lille cirkulær dækglas om suspension, pas på ikke at røre ved dråbe. Placer dækglas om suspension umiddelbart efter tilsætning af antisera for at forhindre væsken på objektglasset tørrer ud.
- Ved hjælp af et mikroskop, observere suspension i henhold til fase-kontrast med 400X forstørrelse. Der observeres en negativ Quellung reaktion, når lidt eller ingen "hævelse" af pneumokok-celler kan ses ved 400X forstørrelse, svarende til hvad der er observeret i pneumokok cellesuspensionen uden antisera tilsat (negativ kontrol). En positiv Quellung reaktion iagttages, når cellerne vises forstørret eller "hævede" og mere synlige i forhold til cellerne i den negative kontrol.
Bemærk: Tvetydige reaktioner bør undersøges yderligere, for eksempel ved at undersøge reaktionen efter 5-10 minutters inkubation ved stuetemperatur eller ved at gentage reaktionen med mere antiserum. - Gennemføre pneumokok serotypning med successiv testning af individuelle antisera puljer indtil en positiv reaktion. Alternativt kan puljer anvendes på »runder« afhængig lokal forekomst af serotyper.
Bemærk: Afprøvning i 'runder «sikrer, at puljer, der indeholder antistoffer mod de mest almindelige serotyper testes først, minimerer indsats og omkostninger. Samtidig afprøvning af flere puljer indeholder yderligere negative kontroller, som kan være nyttige i interpretation. Hvis alle puljer i en bestemt »runde« er negative, teste isolatet med efterfølgende runder af puljer. - Test isolatet ved hjælp af den passende type eller gruppe antiserum indeholdt i den reaktive pool. Hvor det er relevant, brug faktor antisera til yderligere at differentiere serotype.
Bemærk: Nøgler til pneumokok antisera leveres af producenten anvendes i udvælgelsen af passende pool, type, gruppe eller faktor antisera og fortolkning af resultater (herunder eventuelle krydsreaktioner). - Hvis der fås negative resultater med alle puljer, teste isolatet med Omniserum reagens (indeholder antistoffer mod 91 serotyper 21). Hvis en positiv Quellung reaktion stadig ikke overholdes ved test af en pneumokok isolere med Omniserum reagens, kan det være fordi isolatet udtrykker lidt eller ingen kapsel, eller at antistoffer mod serotype er ikke repræsenteret i Omniserum. Sidstnævnte kategori kan indeholde nye serotyper. </ Ol>
Representative Results
En positiv Quellung reaktion opstår, når typespecifikke antistoffet binder til kapslen af pneumokokker, der fører til en ændring i dets brydningsindeks 10. Når den ses under et mikroskop, bakterierne forekomme 'hævede' og mere synlig 14. Figur 1A viser pneumokok celler i HI bouillon. Når typespecifikke anti-serum tilsættes til bakteriesuspensionen pneumokokker forekomme 'hævede ", brydningsindeks og mere afrundet (figur 1B).
Alt for mange bakterieceller tilsættes bouillon, kan resultere i en sammenlægning af celler, eller en falsk negativ reaktion. Figur 2 viser inokulum af pneumokok-celler i HI bouillon, der er "for tung" (figur 2A) eller "for let" (figur 2B).
08fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg "/>
Figur 1. Negative og positive Quellung reaktion. Tilberedninger af serotype 9V pneumokok isolere uden antiserum (1A) og med gruppe 9 antiserum (1B), blev set under 400X forstørrelse. Sidstnævnte viser "hævelse" og afrunding af bakterieceller typisk ses i en positiv Quellung reaktion.
Figur 2. For tunge og for lette inocula. Tilberedninger af pneumokok cellesuspensioner, der er for tung (2A) eller for lys (2B), set under 400X forstørrelse.
Discussion
Et kritisk trin i denne teknik er at sikre en ren kultur anvendes til at fremstille suspensionen sammen med tilsætning af et passende antal af bakterieceller til suppen. Det skal bemærkes, at kolonivækst og morfologi på agarplader varierer mellem forskellige pneumokok isolater. Nogle producerer tørre og ru kolonier, som kan være svært at vælge med en løkke og ikke emulgere godt i bouillon. Af denne grund kan en større feje af bakterier kræves ved udarbejdelsen af celle suspension. Under alle omstændigheder er det nødvendigt, at de enkelte celler og ikke aggregater, er indlysende i den negative kontrol, så deres relative størrelse kan sammenlignes med celler med antisera tilsat. Derudover kan for mange bakterieceller resultere i en falsk negativ reaktion, hvor et overskud af kapselantigenet kan hæmme Quellung reaktion 10. Af denne grund er det vigtigt at skabe en bakteriesuspension med en egnet celledensitet (figur 1). SUSpensionen kan konserveres i adskillige måneder ved tilsætning af nogle dråber koncentreret formalin. Dette gør det lettere at batch test og også steriliserer bouillon reducerer risikoen for laboratorie-infektioner, selv om dette skal afvejes mod risikoen for håndtering af formalin sikkerhed, som er giftigt, ætsende, kræftfremkaldende, sensibiliserende og brandfarlig. Derudover har vi observeret, at nogle isolater viser svagere reaktioner i nærvær af formalin (data ikke vist).
Quellung reaktioner er undersøgt ved hjælp af et mikroskop. Anvendelsen af fasekontrast øger synligheden af kapslen. I nogle laboratorier reaktionen ses ved hjælp olieimmersionsobjektiv ved 1.000 x forstørrelse 14, 16. Desuden er nogle laboratorier bruge en tæller plet (methylenblåt) for yderligere at øge synligheden af en positiv reaktion 10, 16, 22. Metoden præsenteres her ses uden olie-immersion og under 400X forstørrelse 15, 17. Denne metode er hurtig, enkel og relativt let at læse 23.
Det er vigtigt at opretholde en god intern kontrol kvalitet procedurer for at sikre antisera og testprocedurer er i orden. Deltagelse i en ekstern kvalitetssikring program er ofte gavnligt.
En væsentlig begrænsning af Quellung reaktion til serotypning af pneumokokker er de høje omkostninger af antiseraene påkrævet. Imidlertid er minimeret i den ovennævnte protokol, på grund af den lille mængde af antiserum anvendt til hver reaktion. Er blevet beskrevet flere andre fremgangsmåder til serotypning pneumokokker 23, 24. Men Quellung fortsat guldstandarden og udvikling af nye metoder kræver standardisering mod Quellung reaktion 23. Ved hjælp af passende antisera kan Quellung reaktion også bruges til at identificere og skrive andre hætterule producerende bakterier 25. Den Quellung reaktion er medvirkende til karakterisering af nuværende og kommende pneumokok serotyper, samt give oplysninger om vaccinens effekt og virkningen af vaccination mod transport og sygdom på lang sigt.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation (PneuCarriage projekt, Grant 52099), og den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program. Takket være Eileen Dunne, Janet Strachan, og Kim Hare for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
| Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
| Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
| Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
| Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
| *Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
| *Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |
References
- O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
- Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
- Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
- Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
- Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
- Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
- Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
- Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
- Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
- Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
- Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
- Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
- Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
- Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
- Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
- SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
- Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
- Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
- Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
- Lund, E.
- Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
- Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
- Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).
