Summary
Il protocollo qui riportato permette di valutare l'efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l'ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.
Abstract
Negli ultimi anni, vi è stata la difficoltà di trovare terapie più efficaci contro il cancro con meno effetti collaterali sistemici. Pertanto Terapia Fotodinamica è un nuovo approccio per un trattamento selettivo più del tumore.
La terapia fotodinamica (PDT) che fa uso di un fotosensibilizzatore tossico (PS), il quale, dopo attivazione con luce di una specifica lunghezza d'onda, in presenza di ossigeno, genera radicali dell'ossigeno che suscitano una risposta citotossica 1. Nonostante la sua approvazione quasi vent'anni fa dalla FDA, PDT è oggi utilizzato solo per il trattamento di un numero limitato di tipi di cancro (pelle, della vescica) e le malattie nononcological (psoriasi, cheratosi attinica) 2.
Il principale vantaggio della PDT è la capacità di eseguire un trattamento locale, che previene gli effetti collaterali sistemici. Inoltre, permette il trattamento di tumori in siti delicati (ad esempio attorno nervi o vasi sanguigni). Qui, un intraoperatapplicazione ive di PDT è considerato in osteosarcoma (OS), un tumore dell'osso, per indirizzare satelliti tumorali primari lasciati nel tumore tessuto circostante dopo la resezione chirurgica del tumore. Il trattamento mira a ridurre il numero di recidive e di ridurre il rischio di (postoperatorio) metastasi.
Nel presente studio, presentiamo in vitro procedure PDT stabilire le impostazioni ottimali PDT per il trattamento efficace di linee cellulari OS diffusi che vengono utilizzati per riprodurre la malattia umana in modelli murini OS intratibial consolidate. L'assorbimento del PS mTHPC è stato esaminato con uno spettrofotometro e fototossicità è stato provocato con la luce laser di eccitazione di mTHPC a 652 nm per indurre la morte cellulare valutata con WST-1 test e il conteggio delle cellule sopravvissute. Le tecniche consolidate ci consentono di definire le impostazioni ottimali PDT per futuri studi in modelli animali. Sono uno strumento semplice e rapido per la valutazione dell'efficacia di PDT
Introduction
Lo stato odierno del trattamento arte di osteosarcoma (OS), un tumore osseo primario, comprende una combinazione di chemioterapia neo adiuvante e chirurgia. Questo regime terapeutico rivelato un aumento del tasso di sopravvivenza dei pazienti con malattia localizzata da circa il 20% prima dell'uso della chemioterapia, per attualmente tra 60-70% 3, 4. Tuttavia, negli ultimi due decenni, la sopravvivenza complessiva dei pazienti con malattia del sistema operativo locale ha plateaued 4, 5. Inoltre, il 30-40% di questi pazienti ricaduta entro 3 anni dopo la diagnosi e pazienti con malattia metastatica continuare ad avere una scarsa sopravvivenza del 20-30% 4, 6, 7. Per migliorare l'esito di questi pazienti, nuove strategie terapeutiche devono essere sviluppate.
La terapia fotodinamica (PDT), una terapia antitumorale piuttosto romanzo, utilizza la luce di una specifica lunghezza d'onda di eccitazione di un photosensitizer (PS), che si accumula nelle cellule tumorali dopo l'iniezione nel flusso sanguigno. Luce laser di eccitazione del PS genera radicali dell'ossigeno in presenza di ossigeno, che inducono reazione citotossica nelle cellule tumorali e cellule morte. Oltre a questo meccanismo principale, due ulteriori PDT evocato processi biologici contribuiscono alla crescita del tumore ridotta: PDT provoca vasocostrizione e la formazione di trombi del microcircolo tumore e, di conseguenza, ipossia e anossia locale all'interno del tumore, con conseguente tumore infarto. Infine, PDT ferito e cellule tumorali muoiono innescare una risposta immunitaria locale, una caratteristica piuttosto unica di PDT. Ciò comporta il sistema del complemento e l'attivazione delle cellule presentanti l'antigene dendritiche 8. Così, si creano le condizioni per la presentazione di antigeni tumorali con conseguente attivazione di cellule linfoidi, portando a tumore immunità specifica.
Finora, PDT è stato usato per trattare diversi tipi di tumori dei tessuti molli e hyperplasia, quali cheratosi attinica, esofago di Barrett, tumori endobronchiali, cancro della vescica, carcinomi a cellule basali, e il trattamento palliativo della testa e del collo 2. Il trattamento è noto per indurre locale, necrosi larga scala con solo pochi effetti collaterali, e quindi ha il potenziale per eradicare selettivamente tessuto tumorale. Nonostante questi vantaggi, l'applicazione di PDT rimane tecnicamente più impegnativo rispetto alla somministrazione di farmaci chemioterapici. Al fine di raggiungere la massima efficacia, la concentrazione PS, tempo di esposizione alla luce e totale trasferimento di energia luminosa devono essere ottimizzate. Questo può essere fatto in esperimenti in vivo, ma, a causa del gran numero relativo di parametri che devono essere ottimizzate, è più efficiente per determinare inizialmente condizioni ottimali in vitro.
Negli esperimenti descritti di seguito, abbiamo testato l'efficacia in vitro di PDT utilizzando il PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-idrossifenil) chlOrin, abbreviato mTHPC (Figura 1A). mTHPC è il principio attivo contenuto nel medicinale Foscan, che viene attualmente utilizzato in clinica per il trattamento palliativo del carcinoma della testa e del collo. Si tratta di uno dei più potenti PS, inducendo danno cellulare massiccia già a basse concentrazioni, ed è stato dimostrato di essere superiore ad altri PS in termini di penetrazione nel tessuto 9, 10. Il suo spettro di assorbimento della luce (Figura 1B) presenta due picchi prominenti, una a 417 nm ed una seconda a 652 nm, che sono utilizzati per la localizzazione del tessuto di accumulare PS e per l'induzione PDT, rispettivamente.
Attualmente, una formulazione liposomiale per mTHPC è in fase di sviluppo. Qui, descriviamo le procedure per quantificare l'assorbimento di questa formulazione liposomiale, e per eseguire PDT in due linee di cellule del sistema operativo umani, la bassa HOS metastatico e le alte cellule metastatiche 143B. Alcuni dei dati presentati qui sono stati segnalati in precedenza 11. The approccio qui descritto permette di studiare l'effetto di un fenotipo metastatico sul PDT efficacia. 143B cellule, ortotopicamente iniettate nelle arti posteriori del sistema immunitario topi SCID con deficit causano tumori intratibial metastatizzanti primari, un modello mimando la malattia metastasi umana. Così, gli esperimenti proposti in vitro sono perfettamente adatti per valutare le impostazioni ottimali PDT per essere successivamente utilizzati in esperimenti in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Confronto tra l'assorbimento del mTHPC nei rispettivi basso e altamente metastatico HOS e 143B OS Linee Cellulari
- Preparare terreno di coltura contenente DMEM, Ham F12, e siero fetale di vitello inattivato al calore in un rapporto 4.5:4.5:1.
Nota: La formulazione liposomiale del PS mTHPC è stato disciolto in acqua ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml mTHPC. - Tavola 0.2 x 10 6 HOS e cellule 143B / pozzetto in piastre da 6 pozzetti (triplicato per ogni condizione), e lasciare che le cellule aderiscono durante la notte.
Nota: il numero deve essere regolato per linee di cellule singole. Una confluenza del 80-90% è più adatto al momento dell'esperimento. - Il giorno seguente, incubare le cellule con una concentrazione fissa di mTHPC per diversi periodi di tempo (assorbimento dipendente dal tempo), o con concentrazioni crescenti di mTHPC durante un periodo di tempo fisso (dose assorbimento dipendente).
- Incubare le cellule con mTHPC per tempo specifico points o concentrazioni di mTHPC.
Nota: In questo studio, sia l'HOS e linee cellulari 143B sono state incubate con 0,6 ug / ml mTHPC per 0, 2,5, 5 o 10 ore, o con 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC per 5 ore. I periodi di tempo richiesti e dosaggi possono variare a seconda della linea cellulare utilizzata. - Ricordatevi di lavorare sempre al buio o in condizioni di luce soffusa per evitare l'esposizione a luce diretta delle cellule.
- Dopo incubazione delle cellule alle condizioni indicate, aspirare il terreno e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, staccare le cellule con 0,5 ml di tripsina / EDTA e contare le cellule.
- Dopo distacco, centrifugare le cellule a 400 xg per 5 min, aspirare il terreno e risospendere le cellule in PBS ad una densità finale di 200.000 cellule / ml.
- Pipettare 100 ml di sospensione cellulare ottenuta (ossia 20.000 cellule) in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza di queste cellule in uno spettrofotometro a fluorescenza. L'impostaziones per mTHPC misure di fluorescenza sono: 417 nm per l'eccitazione e 652 nm per l'emissione.
- Per calcolare la quantità di mTHPC internalizzato per cella, normalizzare l'unità di fluorescenza relativa (RFU) per il numero di cellule e volume cellulare come segue:
- Preparare una curva standard utilizzando diverse concentrazioni di mTHPC in PBS 0-4 mcg / ml (misure uso triplice copia). Pipettare 100 ml di ogni diluizione in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza dei pozzetti usando le impostazioni descritte sotto passo 1.6.
- Dividere la RFU (ottenuto per 20.000 cellule) dalla pendenza della curva standard lineare di mTHPC, che rappresenta la concentrazione di mTHPC (in mg / ml) nel pozzo.
- Dividere questa concentrazione mTHPC per 10 per ottenere la quantità totale di mTHPC in un pozzetto (in mg, che rappresenta 100 microlitri di sospensione cellulare) e dividere questo valore per il volume di 20.000 cellule.
- Calcolare il volume con la formula per una sfera: (4/3 x π) xr 3. Ottenere il raggio r misurando il diametro di 20 cellule trypsinized al microscopio, e dividendo questo valore per 2.
- Infine, normalizzare tutti i valori a quelli ottenuti con cellule HOS dopo 10 ore di incubazione (dose assorbimento dipendente) o trattati con 10 mg / ml mTHPC (uptake funzione del tempo), che sono stati fissati al 100%.
2. Misurazione della fototossicità di PS In Vitro
- Seed 3.000 cellule / pozzetto in una piastra a 96 pozzetti (triplicato per ciascuna concentrazione di mTHPC usati) e farli aderire durante la notte. Analogamente preparare una piastra da 96 pozzetti supplementari e trattare le cellule come descritto di seguito, ma poi messo da parte per l'imaging a contrasto di fase.
Nota: il numero deve essere regolata per ogni linea singola cella. Una confluenza del 50-60% al momento dell'esperimento è ideale.- Tenere a mente per aggiungere il corrispondente controllo di tossicità scuro di cellule per ciascuna delle concentrazioni mTHPC. Ilse sono cellule che saranno incubate in assenza o in presenza di concentrazioni selezionati di mTHPC, ma non si illuminerà.
- Il giorno seguente, incubare le cellule con differenti concentrazioni di mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg / ml) a seconda delle linee cellulari e tenerli al buio per 5 ore.
- Fare riferimento alla sezione 1.3.2
Nota: Il tempo di incubazione prima illuminazione dipende dalla linea cellulare e del PS usato, quindi è consigliabile per testare diverse concentrazioni e tempi diversi in esperimenti separati.
- Fare riferimento alla sezione 1.3.2
- Dopo l'incubazione per il periodo di tempo indicato, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere nuovo terreno fresco, senza mTHPC.
- Illuminare le cellule con un diodo laser 652 nm, specifico per lo spettro di assorbimento mTHPC (vedi Figura 1).
- Impostare il laser a 21.88 mW / cm 2 potenza ad una altezza di 13,5 centimetri distaSNO dalle cellule, al fine di ottenere una dose di energia 5 J / cm 2. Illuminare le cellule per 230 sec. Non illuminare le cellule di controllo tossicità scuri (con e senza mTHPC).
Nota: indossare sempre occhiali per proteggere gli occhi dalla luce laser utilizzato per l'eccitazione del PS.
- Impostare il laser a 21.88 mW / cm 2 potenza ad una altezza di 13,5 centimetri distaSNO dalle cellule, al fine di ottenere una dose di energia 5 J / cm 2. Illuminare le cellule per 230 sec. Non illuminare le cellule di controllo tossicità scuri (con e senza mTHPC).
- Dopo l'illuminazione, mantenere le celle al buio a 37 ° C per 24 ore. Successivamente, aggiungere acqua tetrazolio solubile (WST-1) reattivo (10 μl/100 ml di media).
- Tre ore dopo l'aggiunta del reagente WST-1, misurare l'assorbanza dei singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti a 415 nm.
- Per calcolare la percentuale di cellule sopravvissute, impostare la media dei valori ottenuti per le cellule trattate mTHPC non per ciascuna condizione al 100% (cioè illuminati, senza mTHPC e nonilluminated senza mTHPC).
3. Stima del numero di cellule contando cellulare
- Seed 20.000 cellule / noill in una piastra a 24 pozzetti e farli aderire durante la notte.
- Incubare le cellule per 5 ore con mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, e 1,25 mg / ml) e illuminare come descritto sopra.
- Raccogliere il mezzo, lavare le cellule una volta con PBS, li trypsinize e alla loro raccolta per centrifugazione a 400 xg per 5 min.
- Dopo centrifugazione, aspirare il terreno e risospendere le cellule in 200 ml di terreno fresco.
- Contare le cellule in una camera di Neubauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con le tecniche qui riportate, abbiamo studiato a base di mTHPC PDT in cellule umane del sistema operativo. In primo luogo, l'assorbimento dipendente dal tempo e dose di mTHPC è stato studiato nel partire HOS metastatico e nelle linee cellulari 143B OS altamente metastatiche. mTHPC assorbimento può essere valutata misurando la fluorescenza di mTHPC con uno spettrofotometro a fluorescenza (Figura 2, riprodotto con il permesso Reidy et al. 11). Figura 2A illustra l'assorbimento di mTHPC in un modo dipendente dal tempo. L'intensità di fluorescenza della sospensione cellulare rappresenta i livelli intracellulari di mTHPC. Figura 2B illustra la dose dipendente assorbimento mTHPC in cellule HOS 143B e dopo 5 ore di incubazione. L'assorbimento in alta linea di cellule metastatico 143B tendeva ad essere superiore a quello della linea di bassa metastatico parentale cellule HOS.
Buio e fototossicità di mTHPC in 143B cellule è stato valutato determinando la Metaboli cellulareAttività C (con un WST-1 test) e contando il numero di cellule residue dopo 5 ore di incubazione con mTHPC, successiva incubazione al buio o trattamento con luce laser per 230 sec e ulteriore incubazione per 24 ore al buio.
Tossicità dose-dipendente scuro è illustrato nella Figura 3 (riprodotto con il permesso Reidy et al. 11). Nella Figura 3A, 143B cellule sono state trattate con differenti dosaggi mTHPC e rispetto a cellule non trattate. È stata osservata una riduzione dose-dipendente del numero di cellule e attività metabolica. Vitalità cellulare Diminuzione è stato riconosciuto ad una concentrazione mTHPC uguale e superiore a 2,5 mg / ml. Dose fototossicità dipendente mTHPC è illustrata nella Figura 3B. Le cellule sono state trattate con dosi diverse mTHPC e con successiva illuminazione (5 J / cm 2). Una diminuzione consequenziale dell'attività metabolica cellulare (misurata con il test WST), nonché una diminuzione nu cellamber è stata osservata. La conseguente diminuzione del numero di cellule dopo l'applicazione PDT viene visualizzato nella Figura 4.
Figura 1. Struttura chimica di mTHPC (A) e lo spettro di assorbimento della luce (B). I dati sono stati forniti da biolitec Research GmbH. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Tempo e la dose assorbimento dipendente mTHPC dalle linee cellulari umane OS HOS e 143B. (A). HOS (in gre y) e 143B (in nero) sono state seminate in piastre da 6 pozzetti (0,2 x 20 6 cellule / pozzetto). Dopo coltura durante la notte, le cellule sono state incubate con 0,6 ug / ml mTHPC per 0, 2,5, 5, 7,5, e 10 ore (A), o per 5 ore con 0, 0,6, 2,5, e 10 ug / ml mTHPC (B) . Intensità di fluorescenza è stata determinata misurando la fluorescenza di 20.000 cellule a 652 nm su di eccitazione a 417 nm. I valori sono stati normalizzati al volume di cella calcolato e l'assorbimento mTHPC di cellule HOS a 10 ore (A) o dopo incubazione con 10 pg / ml (B) è stato impostato a 100%. I valori sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Adattato da Reidy et al 11. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
Figura 3. Buio e fototossicità di mTHPC in 143B cellule. Le cellule sono state seminate e coltivate durante la notte prima del trattamento. Per determinare la dose mTHPC dipendente tossicità scuro, le cellule 143B sono state incubate per 5 ore al buio in assenza o in presenza di concentrazioni mTHPC indicati (A). Per determinare la dose mTHPC tossicità photo dipendente, 143B cellule sono state incubate con o senza mTHPC per 5 ore a concentrazioni indicate e poi illuminate con 5 J / cm 2 con una potenza di 21.88 mW / cm 2 per 230 sec (B). Per la misura di attività metabolica (●) con il WST-1 saggio, cellule 143B sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 3000 cellule / pozzetto. Il numero di cellule (○) sono stati contati da cellule seminate a 20.000 cellule / pozzetto in piastre da 24 pozzetti. I valori sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. Fr Adattatoom Reidy et al 11. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagini fase di contrasto 143B cellule prima e dopo PDT. Cellule sono state seminate e lasciate aderire durante la notte come descritto nel protocollo. Per visualizzare dose-dipendente, mTHPC mediata tossicità luce, le cellule 143B sono state incubate per 5 ore al buio con 0, 0,6, 2,5 e 10 mcg / ml mTHPC (pannelli dC, rispettivamente). Le cellule sono state poi illuminati con 5 J / cm 2 luce di 652 nm di lunghezza d'onda di 230 sec, e fotografati dopo 24 ore. Barra della scala:. 100 micron PlFacilità clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Per ottenere citotossicità ottimale in risposta a PDT, è fondamentale scegliere le impostazioni di luce laser destra e tempi di incubazione. Le procedure qui descritte sono coerenti ed efficienti per determinare PS assorbimento e quantificare citotossicità PDT indotta in vitro. Utilizzando le specifiche lunghezze d'onda di assorbimento della PS mTHPC, il PS assorbimento cellulare può essere determinato in modo diretto, e il PS può essere attivato per generare citotossici specie reattive dell'ossigeno.
Usando questa configurazione in vitro, tutti i parametri quali la concentrazione PS, intervallo luce farmaco e l'intensità della luce laser può essere facilmente adattati alle caratteristiche del PS e le linee cellulari utilizzate. Conteggio delle cellule dà una lettura diretta di sopravvissuti cellule attaccate, che insieme con il WST-1 test (monitoraggio dell'attività metabolica) dà una buona stima per la sopravvivenza delle cellule. Tuttavia, il metodo presentato può modellare solo il "primo colpo", cioè la tossicità cellularespecie di ossigeno reattivo subito dopo l'attivazione del PS. In vivo osservato a seguito vasocostrizione e l'attivazione del sistema immunitario, necessario per l'eradicazione completa del tumore, può essere indagata solo negli animali.
Figura 2 ha dimostrato un assorbimento dipendente dal tempo e dose di mTHPC ad un livello superiore nella 143B altamente metastatico rispetto al suo basso linea cellulare parentale HOS metastatico. Tossicità scuro di mTHPC in cellule OS 143B è stata osservata dopo incubazione per 5 ore solo ad alte concentrazioni (Figura 3). 143B cellule mostrano una elevata sensibilità alla PDT, mostrato dal mTHPC e la dose di luce dipendente effetto fototossico. Un effetto fototossico stato osservato già ad una concentrazione mTHPC partire da 0,075 mcg / ml, e mezzo massima concentrazione letale di 0,022 ± 0,006 g / ml è stato osservato (Figura 3).
Anche se PDT è minimamente invasiva ed efficace contro molti tipi di tumores, minori effetti collaterali possono verificarsi quando si applica la tecnica in pazienti (ad es. gonfiore, eritema). Ciò indica che il PS non è solo assorbito dalle cellule tumorali, come mostrato qui, ma anche da cellule non tumorali, causando tossicità dopo PDT anche in queste cellule. Triesscheijn et al. Era in grado di mostrare una maggiore fotosensibilità delle cellule tumorali rispetto a fibroblasti umani. Al contrario, le cellule endoteliali microvascolari umane hanno mostrato una maggiore diffusione delle mTHPC rispetto alle altre linee cellulari testate, che ha portato ad un alto fotosensibilità 12. Questi risultati sono correlati anche con effetti vascolari anti-PDT associati, che sono frequentemente osservate 2.
I metodi descritti possono essere applicati anche per altre PS. Tempo di incubazione e laser intensità luminosa devono essere adattate alle caratteristiche della PS. Inoltre, PDT può anche essere indotta in diversi dalle cellule del sistema operativo, poiché soltanto le impostazioni sono linea cellulare dipendente, ma non il metodo stesso. R come ulterioreouts EAD, meccanismi di morte cellulare possono essere analizzati, per esempio. mediante analisi Western Blot delle proteine coinvolte nella apoptosi, necrosi o autofagia. Anche la localizzazione subcellulare di PS può essere visualizzata ad esempio mediante microscopio confocale a scansione laser.
Le diverse fasi che sono state descritte per PDT in vitro, cioè incubazione delle cellule con il PS e induzione di PDT con luce laser, assomigliano situazione clinica. I pazienti ricevono (iv o sc. Applicati) PS, e dopo un intervallo di luce farmaco distinto, l'area di interesse (ad es. Tessuto tumorale) è illuminato con luce laser 13. Anche se non ancora applicata in OS, le sue potenziali vantaggi sono evidenti; PDT è considerato particolarmente attraente per il trattamento intraoperatorio di satelliti tumorali, che spesso crescere come gruppi di cellule tumorali primario vicino al bordo principale del tumore primario e può presentare una recidiva quando perse durante la sLa resezione urgical del tumore primario. Anche i grandi tumori ossei possono essere trattati con questa tecnica. Ciò è stato dimostrato da uno studio promettente nel cane 14. Inoltre, l'eradicazione delle cellule tumorali che non possono essere asportate chirurgicamente (es metastasi multiple che si verificano soprattutto nei polmoni), può anche rappresentare una possibile applicazione futura di PDT in pazienti con malattia metastatica OS.
È importante notare che, mentre l'esecuzione degli esperimenti, occorre prestare attenzione che tutte le fasi di lavorazione sono eseguite sotto esposizione alla luce minima dopo l'aggiunta del PS alle cellule, come luce normale contiene anche la lunghezza d'onda necessaria per attivare mTHPC. Allo stesso modo, in applicazione vivo in modelli preclinici, la cura deve essere presa per proteggere gli animali dalla luce diretta dopo l'iniezione mTHPC. Deve anche essere notato che il WST-1 test valuta soltanto l'attività metabolica delle cellule tumorali, che è un indicatore indiretto di morte cellulare. Pertanto, Una combinazione con una conta cellulare totale, come presentato qui, è raccomandato.
In conclusione, la combinazione dei metodi descritti (PS-assorbimento e la tossicità cellulare indotta PDT) fornisce una procedura veloce e conveniente per caratterizzare le proprietà di tossicità di un PS in vitro. Con questi risultati in vitro, la gamma di intensità luminosa ottimale e l'intervallo di luce farmaco può essere stimata, che dà una buona indicazione di come PDT può essere applicato in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare biolitec Research GmbH (Jena, Germania) per averci gentilmente fornito con la formulazione liposomiale mTHPC, con un ringraziamento speciale a Susanna Gräfe e Arno Wiehe per il loro aiuto e la competenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare Kerstin Reidy, che ha generato una gran parte dei risultati ed è stato corresponsabile per la sua pubblicazione 11.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Schweizerischer Verein Balgrist, dell'Università di Zurigo, il Krebsliga Zurigo così come da una sovvenzione da Walter L. e Johanna Lupo Foundation, Zurigo, Svizzera e una sovvenzione da EuroNanoMed ERA-NET / SNF svizzera National Science Foundation 31NM30-131004/1. Questo lavoro è stato supportato anche dal programma (altamente specializzati Medicina) per muscoloscheletrico Oncologia del Canton Zurigo HSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
- D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
- Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
- Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
- Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
- Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
- Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
- Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
- Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
- Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
- Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
- Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A.
- Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).
