Summary
ここで報告されたプロトコルは、細胞株における光線力学療法（PDT）の有効性および動物モデルにおいて治療を適用する前に、PDTの設定の最適化の評価を可能にする。
Abstract
近年では、より少ない全身性副作用、癌に対してより効果的な治療法を見つけることが困難であった。したがって光線力学療法は、それ以上の腫瘍選択的治療のための新規なアプローチである。
酸素の存在下で特定の波長の光で活性化されると、細胞傷害性応答を誘発する1酸素ラジカルを生成し、非毒性の光増感剤（PS）を使用する光線力学療法（PDT）。 FDAによる、ほ ぼ20年前の承認にもかかわらず、PDTは、最近だけのタイプの癌（皮膚、膀胱）とnononcological疾患（乾癬、光線性角化症）2限られた数の治療に使用されます。
PDTの使用の主な利点は、全身性の副作用を防止する局所治療を行うことができることである。また、（神経や血管の周囲などで ）繊細な部位における腫瘍の治療を可能にする。ここでは、intraoperatPDTのIVEアプリケーションは、骨肉腫（OS）で、原発腫瘍の衛星を対象とする骨の腫瘍は、外科的腫瘍切除後に周囲の組織の腫瘍に残さ考えられている。治療は、再発の数を減少時と（術後の）転移のリスクを低減することを目的とする。
本研究では、十分に確立されintratibial OSマウスモデルにおいてヒトの疾患を再現するために使用される広く使用されているOS細胞株の効果的な治療のためのPDTの最適な設定を確立するためにインビトロ PDT処置で提示する。分光光度計や光毒性は、WST-1アッセイを用いて、および生存細胞の計数によって評価し、細胞死を誘導するために652 nmでのmTHPCのレーザー光励起により引き起こされたとPS mTHPCの取り込みを調べた。確立された技術は、動物モデルでの今後の研究のために最適な、PDTの設定を定義するために私達を可能にする。彼らは、PDTの有効性を評価するための簡単かつ迅速なツールです
Introduction
骨肉腫の芸術治療の現在の状態（OS）、原発性骨腫瘍は、ネオアジュバント化学療法と手術との組み合わせを包含する。この治療計画は、現在、60〜70％3、4との間に、化学療法の使用前に約20％からローカライズされた疾患を有する患者の生存率の増加を明らかにした。しかし、過去20年間、地元の疾患を持つOSの患者の全生存期間は4、5を頭打ちしている。さらに、これらの患者の30〜40％は、診断後3年以内に再発および転移性疾患の患者は、20から30パーセント4、6、7の貧しい人々の生存を持ち続ける。これらの患者の転帰を改善するために、新たな治療戦略を開発する必要がある。
光線力学療法（PDT）、むしろ新規な抗癌治療は、photosensiの励起のために特定の波長の光を使用する血流への注入後に腫瘍細胞中に蓄積tizer（PS）。 PSのレーザー光励起は、腫瘍細胞および細胞死を細胞毒性反応を誘発し、酸素の存在下で酸素ラジカルを生成する。この主要なメカニズムに加えて、二つの追加PDTは生物学的プロセスが減少し、腫瘍の成長に寄与する誘発：PDTは、腫瘍の微小血管の血管収縮および血栓形成を引き起こすと、腫瘍内部の結果として、地元の低酸素および無酸素、腫瘍梗塞につながる。最後に、PDTは負傷し、瀕死の腫瘍細胞が局所的免疫応答、PDTのかなりユニークな機能をトリガします。これは、補体系及び樹状細胞の抗原提示8の活性化が関与している。従って、条件は、腫瘍特異的免疫をもたらす、リンパ系細胞のその後の活性化による腫瘍抗原の提示のために作成される。
今のところ、PDTは、軟組織腫瘍及びhyperplのいくつかのタイプを治療するために使用されているアジアの、例えば光線性角化症、バレット食道、気管支内腫瘍、膀胱癌、基底細胞癌、及び頭頸部癌2の姑息的治療として。治療は少しだけ副作用が局所大規模壊死を誘導することが知られ、したがって、選択的に腫瘍組織を根絶する可能性を有している。これらの利点にもかかわらず、PDTの適用は、化学療法薬の投与よりも技術的により厳しいままである。最大効果を達成するために、PS濃度、露光時間、および総光エネルギー伝達を最適化する必要がある。これは、最適化が必要なパラメータの相対的な多数の、それが最初にインビトロで最適な条件を決定する方が効率的であり、in vivo実験で行うことができるが。
下記の実験では、PS 5,10,15,20 -テトラキス（メタ-ヒドロキシフェニル）クロロフィルを用いたPDT のインビトロ効力を試験しおりん、mTHPC（ 図1A）は省略。 mTHPCは現在頭頸部癌の緩和治療のために臨床で使用される医薬品Foscan、活性物質である。これは、低濃度ですでに大量の細胞損傷を誘導し、最も強力なPSの一つであり、それは組織浸透9,10の点で他のPSよりも優れていることが実証された。その光吸収スペクトル（ 図1B）は、それぞれPSを蓄積する組織局在およびPDT誘導のために使用される2つの顕著なピーク、417 nmでのオンおよび652 nmでの第二を示す。
現在、mTHPCためのリポソーム製剤を開発中である。ここでは、このリポソーム製剤の取り込みを定量化するための手順を記述し、2人のOSの細胞株でPDTを行うために、低転移HOSと高転移性の143B細胞。ここに提示されたデータの中には、11以前に報告されている。目ここで説明するEアプローチは、PDTの有効性に転移性表現型の効果を研究することを可能にします。同所免疫不全SCIDマウスの後肢に注入された143B細胞は、intratibial転移原発腫瘍、密接に人間の転移性疾患を模倣したモデルを引き起こす。したがって、提案されたin vitro実験は、最適なPDT設定が保存インビボ実験で使用するための完全に評価するのに適している。
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Protocol
1。それぞれの低および高転移性HOSおよび143B、OSの細胞株におけるmTHPCの取り込みを比較する
- DMEM、ハムF12、及び比4.5:4.5:1の熱不活性化ウシ胎児血清を含む細胞培養培地を調製する。
注：PS mTHPCのリポソーム製剤を1.5 mg / mlのmTHPCの最終濃度で水に溶解した。 - プレート0.2×10 6 HOSおよび143B細胞/ 6ウェルプレート（各条件について三重）での、細胞を一晩接着してみましょう。
注：番号は個々の細胞株に調整しなければならない。 80から90までパーセントの集密度は、実験時に最適です。 - 次の日に、異なる期間（時間依存性の取り込み）用、又は一定時間（用量依存性の取り込み）の間mTHPCの濃度を増加させてmTHPCの固定濃度で細胞をインキュベートする。
- 特定の時間PのためmTHPCで細胞を培養するointsまたはmTHPCの濃度。
注：本研究では、HOSおよび143B細胞株の両方が5時間0.6μg/ mlの0のためmTHPC、2.5、5、または10時間、または0で、0.6、2.5、および10μg/ mlのmTHPCとインキュベートした。印加される期間及び投与量は、使用される細胞株に依存して変化し得る。 - 常に細胞の直接露光を防ぐために、暗闇の中、または淡色表示光の状態で動作するように覚えている。
- 指示された条件での細胞のインキュベーション後、培地を吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。次に、0.5ミリリットルのトリプシン/ EDTAで細胞を剥離し、細胞をカウントします。
- 剥離した後、5分間400×gで細胞を遠心分離培地を吸引し、200,000細胞/ mlの最終濃度にPBSで細胞を再懸濁。
- 得られた細胞懸濁液をピペットで100μlを96ウェルプレート中、蛍光分光光度計におけるこれらの細胞の蛍光を測定する（ すなわち、20,000細胞）。設定mTHPC蛍光測定用のSは、次のとおりです。励起用417 nmおよび発光のための652 nmの。
- 次のように細胞あたり内部移行mTHPCの量を算出するために、細胞数および細胞容積相対蛍光単位（RFU）を正規化する。
- 0-4μg/ mlの（使用3回の測定）からPBSにmTHPCの異なる濃度を用いて標準曲線を作成。 96ウェルプレートの各希釈液100μlをピペットステップ1.6で説明した設定を使用して、ウェルの蛍光を測定する。
- ウェル内（μg/ mlで）mTHPCの濃度を与えmTHPC、線形標準曲線の傾きによって（20,000細胞のために取得した）RFUを分割。
- 1ウェル内mTHPCの総量（μgの中で、細胞懸濁液100μlを表す）を取得し、20,000細胞の体積で、この値を分割するために10でこのmTHPC濃度を分割します。
- X（4/3×π）：球の計算式で体積を計算するR 3。顕微鏡下で20トリプシン処理した細胞の直径を測定し、この値を2で割ることにより、半径rを得る。
- 最後に、インキュベーションの10時間後（用量依存性の取り込み）の後HOS細胞について得られた又は100％に設定した10μg/ mlのmTHPC（時間依存性の取り込み）で処理したものにすべての値を正規化する。
2。 in vitroでの PSの光毒性の測定
- 96ウェルプレート中の種子3,000細胞/ウェル（mTHPCの各濃度三重が使用される）、それらを一晩接着してみましょう。同様に、付加的な96ウェルプレートを調製し、下記のように細胞を処理するが、その後、位相コントラスト撮影のために取ってそれらを置く。
注：数は、各々のセルラインについて調整しなければならない。実験時の百分の50から60までの集密度が理想的です。- mTHPC濃度ごとに、セルの対応する暗い毒性コントロールを追加するために覚えておいてください。ザ·SEはmTHPCの選択された濃度の存在下または非存在下でインキュベートされる細胞であるが、点灯しません。
- 翌日、細胞株に応じてmTHPC（0、0.0001、0.001、0.01、0.03、0.075、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、および10μg/ ml）を異なる濃度で細胞をインキュベートし5時間暗所に保管してください。
- 第1.3.2項を参照してください。
注意：インキュベーション時間の照明が細胞株および使用されるPSに依存する前に、したがって、それは別々の実験において、異なる濃度および異なる時点を試験することが望ましい。
- 第1.3.2項を参照してください。
- 指示された時間の間インキュベートした後、PBSで2回細胞を洗浄し、mTHPCずに新しい新鮮な培地を追加します。
- mTHPC吸収スペクトルに特異的な652 nmのダイオードレーザ（ 図1参照）で細胞を照らす。
- 13.5センチメートルのDISTAの高さ21.88 MW / cm 2とパワーにレーザーを設定5 J / cm 2のエネルギー量を得るために細胞からのNCE。 230秒のセルを照らす。 （ととmTHPCなしで）ダーク毒性対照細胞に照射しないでください。
注意：必ずPSの励起に用いられるレーザ光 から目を保護するメガネを着用してください。
- 13.5センチメートルのDISTAの高さ21.88 MW / cm 2とパワーにレーザーを設定5 J / cm 2のエネルギー量を得るために細胞からのNCE。 230秒のセルを照らす。 （ととmTHPCなしで）ダーク毒性対照細胞に照射しないでください。
- 照明の後、24時間37℃の暗所で細胞を維持する。その後、水溶性のテトラゾリウム（WST-1）試薬（培地10μl/100μL）を追加します。
- 三時間WST-1試薬の添加後、415nmで96 - ウェルプレートの各ウェルの吸光度を測定する。
- 生存細胞のパーセンテージを計算するために、（ すなわち mTHPCことなく、mTHPCとnonilluminatedことなく、照明）を100％に各条件についてmTHPC非処理細胞について得られた値の平均値を設定する。
3。細胞計数による細胞数の推定
- シード20,000細胞/ WE24ウェルプレート中のLL、彼らが一晩を密着させ。
- mTHPC（0.001、0.003、0.15、0.6、及び/ mlの1.25μgの）で5時間細胞をインキュベートし、上記のように、それらを照らす。
- メディアを集め、5分間400×gで遠心分離することにより、PBSで細胞を1回洗浄してトリプシン処理し、それらを収集します。
- 遠心分離後、培地を吸引し、新鮮な培地200μl中に細胞を懸濁します。
- ノイバウアー室で細胞を数える。
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Representative Results
ここで報告された技術では、我々人間のOS細胞内mTHPCベースのPDTを調査した。まず、mTHPCの時間および用量依存的取り込みは、低転移HOSおよび高転移143B OS細胞株で調べた。 mTHPC取り込みは、蛍光分光光度計でmTHPCの蛍光を測定することによって評価することができる（レイディらからの許可を得て複製、 図2、 図11）。 図2Aは、時間依存的にmTHPCの取り込みを示す。細胞懸濁液の蛍光強度は、mTHPCの細胞内レベルを表す。 図2Bは、5時間のインキュベーション後HOSの用量依存mTHPC取り込みおよび143B細胞を示す。高転移性細胞株143Bでの取り込みは、低転移親HOS細胞株に比べて高い傾向にあった。
暗い143B細胞におけるmTHPCの光毒性は、細胞metaboliを測定することによって評価した（WST-1アッセイと）とmTHPC、230秒、暗所で24時間、さらにインキュベーションのためのレーザー光で暗いまたは治療におけるその後のインキュベーションとのインキュベーションの5時間後に残留する細胞の数をカウントすることによりC活性。
用量依存性の濃い毒性は（レイディらの許可を得て再現しました。11） を図3に示します。 図3Aに、143Bの細胞は、異なるmTHPC用量で処理し、未処理の細胞と比較した。細胞数および代謝活性の用量依存的減少が観察された。減少した細胞生存率は等しく、2.5μg/ mlのmTHPCよりも高い濃度で認められた。 mTHPCの用量依存性の毒性を、 図3Bに示されている。細胞を、異なるmTHPC用量で、後続の照明（5 J / cm 2）を用いて処理した。 （WSTアッセイを用いて測定された）細胞の代謝活性の結果的な減少、ならびに細胞νの減少mberが観察された。 PDTを適用した後の細胞数の減少が得られ、図4に視覚化される。
図1。 mTHPC（A）と光吸収スペクトル（B）の化学構造 。数値はbiolitecリサーチ社によって提供された。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。時間およびヒトOS細胞株HOS及び143BによってmTHPCの用量依存的取り込み。（A）。 HOS（GRE中 y）と143B（黒）を、（0.2×20 6細胞/ウェル）を6ウェルプレートに播種した。一晩培養後、細胞を0、2.5、5、7.5、および10時間（A）0.6μg/ mlのmTHPCと共にインキュベートし、又はしながら5時間、0、0.6、2.5、および10μg/ mlのmTHPC（B） 。蛍光強度を、417 nmでの励起で652 nmで20,000細胞の蛍光を測定することにより決定した。値が算出されたセル容積と10時間（A）におけるまたは10μg/ mlの（B）とのインキュベーション後HOS細胞のmTHPCの取り込みに対して標準化した、100％に設定した。値は、3つの独立した実験の平均±SEMである。レイディら 11から適応この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図3。 143B細胞中の暗くてmTHPCの光毒性。細胞は、治療前に播種し、一晩増殖させた。 mTHPCの用量依存性の濃い毒性を決定するために、143B細胞が示さmTHPC濃度（A）の非存在下または存在下で暗闇の中で5時間インキュベートした。 mTHPCの用量依存的な写真の毒性を測定するために、143B細胞は、指示された濃度で5時間、またはmTHPCなしでインキュベートし、次いで230秒間21.88 MW / cm 2のパワーで5 J / cm 2とで照明された （B）。 WST-1アッセイで代謝活性（●）の測定のために、143B細胞を3,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。細胞数（○）は、24ウェルプレート中のウェルに20,000細胞/ウェルで播種した細胞から計数した。値は、3つの独立した実験の平均±SEMである。適応FROMレイディら 11 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。 143Bの細胞の位相コントラスト画像の前およびPDT後の細胞を播種し、プロトコルに記載のように一晩接着さ放置した。用量依存性、mTHPC媒介光毒性を可視化するために、143B細胞は0、0.6、2.5と暗闇の中で5時間インキュベートし、10μg/ mlのmTHPC（それぞれのパネルAD）。次に、細胞を230秒間652 nmの波長の5 J / cm 2の光で照射し、24時間後に撮影した。スケールバー：100μmである。 Plをこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックして使いやすさ。
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Discussion
PDTに応じて最適な細胞毒性を達成するためには、右のレーザ光設定およびインキュベーション時間を選択することが重要である。ここで説明する手順は、PSの取り込みを決定し、in vitroで 、PDT誘導される細胞毒性を定量化するために一貫性があり、効率的です。 PS mTHPCの特定の吸収波長を用いて、PSの細胞取り込みは、直接的に決定することができ、PSは、細胞傷害性活性酸素種を生成するために活性化することができる。
このインビトロセットアップを使用して、例えばPS濃度、薬物光間隔とレーザ光 の強度などのすべてのパラメータが容易にPSと使用した細胞株の特性に調整することができる。細胞数は一緒に、WST-1アッセイ（代謝活性をモニターする）で、細胞の生存のための良好な推定値を与える、生き残っ付着した細胞から直接読み取りができます。しかし、提示された方法は、細胞毒性すなわち 、「最初のヒット"をモデル化することができますすぐにPSの活性化後の活性酸素種。 in vivoでのその後の血管収縮を観察し、完全な腫瘍根絶のために必要な免疫系の活性化は、動物だけで調べることができる。
図2は 、その親の低転移HOS細胞株に比べて高転移性143Bの上位レベルにmTHPCの時間と用量依存性の取り込みを示した。 143BのOS細胞におけるmTHPCの暗毒性は唯一の高濃度（ 図3）で5時間のインキュベーション後に観察された。 143B細胞は、mTHPC光用量依存性毒性効果により示さPDTに対して高い感度を示す。光毒性効果は、0.075μg/ mlの程度の低いmTHPC濃度ですでに観察され、0.022±0.006μg/ mlの最大の半分の致死濃度（ 図3）が観察された。
PDTは多くの腫瘍タイプに対する最小侵襲的かつ効率的ではあるがS、患者の技術を適用する際に、マイナーな副作用が発生する可能性がある（ 例えば 。腫脹、紅斑）。これは、PSは、ここに示されているように、腫瘍細胞によって取り込まれ、また非腫瘍細胞により、これらの細胞においても、PDT後に毒性を引き起こすだけでなくことを示している。 Triesscheijn らは、ヒト線維芽細胞と比較して、腫瘍細胞の増加した感光性を示すことができた。対照的に、ヒト微小血管内皮細胞は、高い光感度12に導かれ、他の試験した細胞株よりmTHPCの高い取り込みを示した。これらの知見はまた、しばしば2を観察しているのPDTに関連する抗血管作用、と相関する。
記載された方法は、他のPSに適用することができる。インキュベーション時間及びレーザ光強度は、PSの特性に適合させる必要がある。さらに、PDTはまた、唯一の設定は方法自体に依存する細胞株ではないがあるため、OS細胞以外において誘導することができる。などの追加READ欠き、細胞死のメカニズムは、例えば 、分析することができる。アポトーシス、ネクローシスまたはオートファジーに関与するタンパク質のウェスタンブロット分析による。また、PSの細胞内局在を共焦点レーザー走査顕微鏡などによって視覚化することができる。
インビトロでの PDTのために記載されている異なる工程、レーザ光 をPSとPDTの誘導による細胞のインキュベーションは、 すなわち 、臨床的状況に密接に似ている。患者は、（適用した。静脈内または皮下）、PSを受信し、別個の薬物光間隔の後、関心のある領域（ 例えば 、腫瘍組織）レーザ光13で照明される。まだOSに適用されていないが、その潜在的な利点は明白であり、PDTは、しばしば原発腫瘍の主なリムに近い原発腫瘍細胞クラスターとして成長する腫瘍衛星の手術処置のために特に魅力的であるとみなされており、再発を開始することができるS中にミスしたとき、原発腫瘍の切除urgical。でも大きな骨腫瘍がこの技術で処理することができる。これは、イヌ14において有望な研究によって示されている。また、手術によって切除することができない腫瘍細胞の根絶（ 例えば 、複数の転移は主に肺に存在する）、またOS転移性疾患を有する患者におけるPDTの可能な将来の応用を表すことができる。
これは、実験を行いながら、ケアが通常の昼光でもmTHPCを活性化するのに必要な波長を含んでいるように、すべての作業工程は、細胞へのPSを添加した後、最小の光照射下で実行されることに注意すべきであることに留意することが重要である。同様に、前臨床モデルにおけるin vivo適用のため、注意がmTHPCを注入した後、直接光から動物を保護するため注意が必要です。また、WST-1アッセイでのみ細胞死の間接的な指標である腫瘍細胞の代謝活性を評価することに留意する必要がある。従って、全細胞数との組み合わせは、ここで紹介するように、お勧めします。
結論として、記載された方法（PS取り込みとPDT誘導される細胞毒性）の組み合わせは、in vitroでの PSの毒性の性質を特徴づけるために迅速かつコスト効率の手順について説明します。これらのin vitroの結果と、最適な光強度及び薬物光間隔の範囲は、PDTがインビボで適用することができる方法の良い指標を与える、推定することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益や利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
作者は親切に彼らの助けのためのスザンナグレーフェとアルノWieheに感謝し、技術的な専門知識と、リポソームmTHPC製剤を私たちに提供するためbiolitecリサーチ社（イエナ、ドイツ）に感謝したいと思います。また、結果の大部分を生成し、その出版11 coresponsibleたカースティンレイディを、感謝したいと思います。
この作品は、Schweizerischerの法令に基づく連合組織体Balgrist、チューリッヒ大学、チューリッヒKrebsligaだけでなく、ウォルター·L.とヨハンナウルフ財団、チューリッヒ、スイス、EuroNanoMed ERA-NET / SNFスイスからの助成金からの助成金によってからの補助金によって支えられて国立科学財団31NM30-1分の131004。この作品はまた、カントンチューリッヒの筋骨格系の腫瘍学のためのHSM（高度専門医療）プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
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