Summary
여기에보고 된 프로토콜은 수 광역 세포주의 치료 (PDT) 및 동물 모델에서 치료를 적용하기 전에 PDT 설정의 최적화의 효과의 평가.
Abstract
최근, 적은 전신 부작용과 암에 대한보다 효과적인 치료법을 찾는데 어려움이있어왔다. 따라서 광 역학 치료보다 종양 선택적 치료에 대한 새로운 접근 방식입니다.
산소의 존재 하에서 특정 파장의 빛을 활성화시에, 세포 독성 반응을 유도 한 산소 라디칼을 생성하고, 비 독성 감광제 (PS)을 이용한다 광 역학 치료 (PDT). FDA에 의해 거의 20 년 전 승인에도 불구하고, PDT가 요즘에만 암 종류 (피부, 방광) 및 nononcological 질환 (건선, 광선 각화증) 2 제한된 수를 치료하는 데 사용됩니다.
PDT의 사용의 중요한 이점은 전신적인 부작용을 방지 지방 치료를 수행 할 수있는 능력이다. 또한, (신경 또는 혈관 주위 예) 민감한 부위에서의 종양의 치료를 허용한다. 여기서, intraoperatPDT의 필자의 응용 프로그램은 골육종 (OS)에서 기본 종양 위성을 대상으로 뼈의 종양이 외과 종양 절제술 후 조직을 둘러싼 종양에 남아 간주됩니다. 치료 재발의 수를 감소시 및 (수술후) 전이에 대한 위험을 감소시키는 것을 목표로한다.
본 연구에서 우리는 잘 확립 intratibial OS 마우스 모델에서 인간의 질병을 재현하기 위해 사용되는 널리 사용되는 OS 세포주의 효과적인 치료를위한 최적의 PDT 설정을 확립하는 체외 PDT 절차에서 제시한다. PS mTHPC의 흡수 분광 광도계 및 광독성는 WST-1 분석으로 살아남은 세포의 계산에 의해 평가 된 세포의 죽음을 유도하기 위해 652 nm에서 mTHPC의 레이저 광 자극으로 유발 된으로 조사 하였다. 기존 기술은 동물 모델에서 미래 연구를위한 최적의 PDT 설정을 정의 할 수있게. 그들은 PDT의 효과의 평가를위한 쉽고 빠른 도구입니다
Introduction
골육종 (OS)의 예술 치료의 오늘의 상태는 기본 뼈 종양, 신 보조 항암 화학 요법 및 수술의 조합을 포함한다. 이 치료 요법은 화학 요법의 사용 전에 약 20 % 내지 국소 질환 환자의 생존율 증가를 밝혀, 현재까지 04 세 사이 60~70%. 그러나 지난 수십 년 동안, 현지 질환 OS 환자의 전체 생존 기간은 5 4 plateaued했다. 또한, 이러한 환자 30 ~ 40 %의 진단 후 3 년 이내에 재발 및 전이성 질환을 가진 환자는 20 ~ 30 % 4의 생존율, 6, 7을 계속합니다. 이들 환자의 결과를 개선하기 위해, 새로운 치료 전략을 개발해야한다.
광 역학 요법 (PDT), 오히려 신규 항암 치료는 photosensi의 여기를 위해 특정 파장의 광을 사용혈류로의 주입 후 종양 세포에 축적 tizer (PS). PS의 레이저 광을 여기에는 종양 세포 및 세포 죽음에서 세포 독성 반응을 유도하는 산소의 존재 하에서 산소 라디칼을 생성한다. PDT는 종양 경색으로 이어지는, 혈관 수축 및 종양 미세 혈관의 혈전 형성을 일으키는 원인이되고, 종양 내부 결과적으로 지역의 저산소증과 산소 결핍이 기본 메커니즘 외에 두 개의 추가 PDT는 생물 학적 과정이 감소 된 종양의 성장에 기여 유발. 마지막으로, PDT 부상 죽어가는 종양 세포는 로컬 면역 반응, PDT의 다소 독특한 기능을 트리거합니다. 이것은 보체 시스템 및 수지상 세포 8 항원 제시의 활성화를 수반한다. 따라서, 조건은 종양 특정 면역에 이르는, 림프 세포의 후속 활성화와 종양 항원의 프레 젠 테이션을위한 생성됩니다.
지금까지, PDT 연조직 종양 및 hyperpl 여러 종류의 치료를 위해 사용되었다아시아의, 같은 광선 각화증, 바렛 식도, 기관지 종양, 방광 암, 기저 세포 암, 머리와 목 암 2의 완화 치료로. 치료는 단지 적은 부작용과 로컬 대규모 괴사를 유도하는 것으로 알려져, 따라서 선택적으로 종양 조직을 근절 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 이러한 장점에도 불구하고, PDT의 응용 프로그램은 화학 요법 약물의 투여보다 기술적으로 더 까다로운 남아있다. 최대 효능, PS 농도, 노광 시간 및 전체 광 에너지 전달을 달성하기 위해 최적화 될 필요가있다. 이는 생체 내 실험에서 수행 될 수 있지만, 인해 최적화 될 필요가 파라미터의 상대적 다수, 그것은 초기 시험 관내에서 최적 조건을 결정하는 것이 더 효율적이다.
후술하는 실험에서는, PS 5,10,15,20 - 테트라 키스 (메타 - 하이드 록시 페닐) CHL를 사용하여 PDT의 효능을 시험 관내 시험오린은 mTHPC (그림 1A)를 단축. mTHPC는 현재 두 경부암의 완화 치료를위한 병원에서 사용되는 의약품 Foscan있는 활성 물질이다. 그것은 낮은 농도에서 이미 대규모 세포의 손상을 유도하는 가장 유력한 PS 중 하나이며, 이는 조직 침투 (9, 10)의 측면에서 다른 PS 우수한 것으로 입증되었다. 의 광 흡수 스펙트럼 (그림 1B)는 각각 PS를 축적 조직 현지화 및 PDT 유도에 사용되는 두 개의 눈에 띄는 봉우리, 417 nm에서 한 652 nm에서 두 번째를 보여줍니다.
현재 mTHPC의 리포솜 제형은 개발 중입니다. 여기서, 우리는이 리포솜 제형의 흡수를 정량화하고,이 OS 인간 세포주에서 PDT를 수행하는 절차를 설명; 낮은 전이성 HOS 및 높은 전이성 143B 세포. 여기에 제시된 데이터 중 일부는 11 이전에보고 된 바있다. 일여기에 설명 된 전자의 방법은 PDT의 효과에 전이성 표현형의 효과를 공부하기 위해 수 있습니다. orthotopically 면역 결핍 SCID 마우스의 뒷다리에 주입 143B 세포는 intratibial을 전이 차 종양, 밀접하게 인간을 전이 질환을 흉내 낸 모델을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 제안 된 시험 관내 실험은 최적 PDT 설정하기 생체 내 실험에 사용되는 평가할에게도 적합하다.
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Protocol
1. 각각의 로우 mTHPC의 통풍과 높은 전이성 HOS와 143B OS 세포주의 비교
- DMEM, 햄 F12 및 비율 4.5:4.5:1에서 열 불 활성화 된 태아 혈청을 포함하는 세포 배양 매체를 준비합니다.
주 : PS mTHPC의 리포솜 제형은 1.5 ㎎ / ㎖ mTHPC의 최종 농도로 물에 용해시켰다. - 플레이트 0.2 × 10 6 HOS와 143B 세포 / 잘 6 - 웰 플레이트 (각 조건에서 삼중)과 세포가 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
참고 번호가 개별 세포주로 조정되어야한다. 80~90%의 포화 상태는 실험시에 최적이다. - 다음 날에, 다른 기간 (시간 의존적 흡수)에 대한 mTHPC의 고정 농도로 세포를 배양, 또는 고정 된 시간주기 (농도 의존적 흡수) 중에 mTHPC의 농도 증가.
- 특정 시간 P에 mTHPC와 세포를 품어oints 또는 mTHPC의 농도.
주 : 본 연구에서는 HOS와 143B 세포주 모두가 0.6 ㎍ / ㎖의 mTHPC와 함께 배양 0, 2.5, 5 또는 10 시간, 5 시간 동안 0, 0.6, 2.5, 10 ㎍ / ㎖의 mTHPC와. 적용 기간 및 투여 량은 사용되는 세포주에 따라 다를 수 있습니다. - 항상 세포의 직사광선 노출을 방지하기 위해 어둠 속에서 또는 흐리게 조명 조건에서 작동해야합니다.
- 지정된 조건에서 세포를 배양 한 후, 배지를 흡인하고, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 이어서, 0.5 ml의 트립신 / EDTA로 세포를 분리하고 세포를 센다.
- 박리 한 후, 5 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리하여 배지를 흡인하고 200,000 세포 / ml의 최종 농도로 PBS에 세포를 재현 탁.
- 얻어진 세포 현탁액 피펫 100 μL를 96 웰 플레이트 및 형광 분광 광도계에서 이러한 세포의 형광을 측정한다 (즉, 20,000 세포). 설정mTHPC 형광 측정의는 다음과 같습니다 방출의 여기 및 652 nm의 417 nm의.
- 셀당 내면화 mTHPC의 양을 계산은 다음과 같이 세포 수와 세포 부피에 대한 상대적 형광 단위 (RFU)를 정상화하기 위해 :
- 0-4 ㎍ / ㎖ (사용 세중의 측정)에서 PBS에 mTHPC의 서로 다른 농도를 사용하여 표준 곡선을 준비합니다. 96 - 웰 플레이트에 각 희석 100 μl를 피펫 단계 1.6에 설명 된 설정을 사용하여 우물의 형광을 측정합니다.
- 우물에서 (㎍ / ml 중) mTHPC의 농도를 제공 mTHPC의 선형 표준 곡선의 기울기가 (20,000 세포 얻은) RFU를 나눈다.
- (세포 현탁액 100 μl를 나타내는 μg에서) 하나의 잘 mTHPC의 총량을하고 20,000 세포의 양이 값을 나누는 10이 mTHPC 농도를 나눈다.
- X (4 / 3 개의 x π) 구에 대한 공식으로 볼륨을 계산R 3. 현미경 하에서 20 트립신 세포의 직경을 측정하고, (2)에 의해이 값을 나눔으로써 반경 (r)을 구하는.
- 마지막으로, 10 배양 (농도 의존적 흡수)의 시간 또는 100 %로 설정 한 10 ㎍ / ㎖의 mTHPC (시간 의존 흡수), 치료 후 HOS 세포를 얻은 것과 모든 값을 정상화.
2. PS 체외의 광독성 측정
- 96 - 웰 플레이트 (mTHPC의 각 농도에 대한 삼중 사용)에 3,000 세포 / 웰 씨와 그 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. 마찬가지로 추가로 96 - 웰 플레이트를 준비하고 아래에 설명 된대로 세포를 치료하지만 위상 콘트라스트 이미지 따로 넣어.
주 : 숫자는 각각의 세포주에 따라 조정되어야한다. 실험시의 50 ~ 60 %의 컨 플루가 이상적이다.- mTHPC 농도의 각 셀의 해당 어두운 독성 컨트롤을 추가하기 위해 염두에 두십시오.SE는 mTHPC의 선택 농도의 부재 또는 존재 배양 할 세포하지만 조명되지 않습니다.
- 다음 날, 세포주에 따라 mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍ / ㎖)을 다양한 농도로 세포를 배양하고 5 시간 동안 어둠에 보관하십시오.
- 1.3.2 절을 참조하십시오
주 : 배양 시간을 조명 세포주에 사용 된 PS에 따라 달라집니다 전에, 따라서 별도의 실험에서 서로 다른 농도와 서로 다른 시간의 포인트를 테스트하는 것이 좋습니다.
- 1.3.2 절을 참조하십시오
- 지정된 시간 동안 배양 한 다음, PBS로 두 번 세포를 씻어 mTHPC없이 새로운 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다.
- mTHPC 흡수 스펙트럼에 대한 구체적인 652 nm의 다이오드 레이저 (도 1 참조)와 함께 세포를 밝히는.
- 13.5 cm의 dista의 높이에 21.88 ㎿가 / cm 2 전원에 레이저를 설정5 J / cm 2의 에너지 량을 얻기 위하여 세포 NCE. 230 초 동안 세포를 조명. (함께하고 mTHPC없이) 어두운 독성 제어 세포를 조명하지 마십시오.
참고 : 항상 PS의 여기에 사용되는 레이저 빛으로부터 눈을 보호하는 안경을 착용.
- 13.5 cm의 dista의 높이에 21.88 ㎿가 / cm 2 전원에 레이저를 설정5 J / cm 2의 에너지 량을 얻기 위하여 세포 NCE. 230 초 동안 세포를 조명. (함께하고 mTHPC없이) 어두운 독성 제어 세포를 조명하지 마십시오.
- 조명 한 후, 24 시간 동안 37 º C에서 어둠 속에서 세포를 유지. 그 후, 수용성 테트라 졸 (WST-1) 시약 (매체의 10 μl/100 μL)를 추가합니다.
- 세 시간 WST-1 시약을 첨가 후, 415 nm에서 96 - 웰 플레이트의 각각의 웰의 흡광도를 측정한다.
- 생존 세포의 비율을 계산하기 위해서, (즉 mTHPC없이 mTHPC와 nonilluminated없이 조명) 100 %의 각 조건에 대해 mTHPC 비 처리 된 세포에 대해 얻어진 값의 평균치를 설정한다.
3. 셀 계산하여 세포 수의 추정
- 종자 20,000 세포 / 우리24 웰 플레이트에 LL하고 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
- mTHPC과 5 시간 (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, 1.25 ㎍ / ml)에 대한 세포를 품어 전술 한 바와 같이 그들을 조명.
- 매체를 수집, 5 분 400 XG에서 원심 분리하여 PBS로 한 번 세포를 씻어 그들을를 Trypsinize 그들을 수집합니다.
- 원심 분리 후, 배지를 흡인하고, 신선한 배지 200 μL에 세포를 재현 탁.
- 네우 바우 실에서 세포를 계산합니다.
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Representative Results
여기에보고 된 기술로, 우리는 인간의 OS 세포에서 mTHPC 기반 PDT를 조사 하였다. 먼저, mTHPC의 시간 및 농도 의존적 흡수는 낮은 전이성 HOS 및 고도로 전이성 143B OS 세포주에서 조사 하였다. mTHPC 흡수는 형광 분광 광도계 mTHPC의 형광 (Reidy 등. (11)로부터 허가를 재현 그림 2) 측정에 의해 평가 될 수있다. 그림 2A는 시간 의존적으로 mTHPC의 이해를 보여줍니다. 세포 현탁액의 형광 강도가.도 2B는 5 시간 배양 한 후 HOS 및 143B 세포에서 농도 의존적 mTHPC 흡수를 나타낸다 mTHPC의 세포 내 농도를 나타낸다. 전이성이 높은 세포주 143B에서 흡수가 낮은 전이성 부모 HOS 세포주에서보다 높은 경향.
어둡고 143B 세포에서의 광독성 mTHPC는 셀 metaboli을 결정함으로써 평가 하였다(WST-1 분석 포함) 및 mTHPC, 230 초와 어둠 속에서 24 시간 동안 더 배양을위한 레이저 빛으로 어둡거나 치료 이후의 배양과 배양 5 시간 후 잔여 세포의 수를 세어 C 작업.
농도 의존적 어두운 독성 (Reidy 등. (11)로부터 허가를 재생) 그림 3에서 볼 수 있습니다. 도 3a에서, 143B 세포는 상이한 mTHPC 투약량으로 처리하고, 처리되지 않은 세포와 비교 하였다. 세포 수 및 대사 활성의 용량 의존적 감소가 관찰되었다. 감소 세포 생존 능력은 동일하고, 2.5 ㎍ / ㎖의보다 높은 mTHPC의 농도로 인식되었다. mTHPC의 농도 의존적 광독성는도 3b에 도시되어있다. 세포는 다른 mTHPC 복용과 이후의 조명 (5 J / cm 2)로 처리 하였다. 세포 뉴의 감소뿐만 아니라, (WST 분석으로 측정) 세포 대사 활동의 결과적인 감소mber가 관찰되었다. PDT를 적용한 후 세포 수의 감소 결과는 그림 4에 시각화된다.
그림 1. mTHPC (A)의 화학 구조와 광 흡수 스펙트럼 (B). 숫자는 biolitec 연구 GmbH에 의해 제공되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 인간 OS 세포주 HOS와 143B로 mTHPC의 시간과 농도 의존적 흡수. (A). HOS (GRE에 Y)와 143B (블랙)은 (0.2 × 20 6 세포 / 웰) 6 - 웰 플레이트에 접종 하였다. 밤새 배양 한 후, 세포를 0, 2.5, 4.0, 7.5, 및 10 시간 (A)을 위해 0.6 ㎍ / ㎖의 mTHPC 함께 배양 또는 하였다 함께 5 시간 동안 0, 0.6, 2.5 및 10 ㎍ / ㎖의 mTHPC (B) . 형광 강도는 417 ㎚에서 여기에 652 ㎚에서 20,000 세포의 형광을 측정하여 결정 하였다. 밸류가 계산 된 세포 부피 및 10 시간 (A)에서 10 μg / ㎖ (B)과 배양 후 HOS 세포 mTHPC 흡수 정규화되었습니다는 100 %로 설정 하였다. 값은 세 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM 있습니다. Reidy 등. 11에서 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3. 어둡고 143B 세포 mTHPC의 광독성. 세포 밤새 처리하기 전에 접종 및 성장했다. mTHPC 도즈 종속 어두운 독성을 결정하기 위하여, 143B 세포를 지시 mTHPC 농도 (A)의 부재 또는 존재하에 어둠 속에서 5 시간 동안 인큐베이션 하였다. mTHPC의 농도 의존적 사진 독성을 결정하기 위해, 143B 세포는 표시 농도에서 5 시간 동안이나 mTHPC하지 않고 배양 한 후 230 초 동안 21.88 mW의 / ㎠의 힘으로 5 J / ㎠으로 조사되었다 (B). WST-1 분석과 신진 대사 활동 (●)의 측정의 경우, 143B 세포는 3,000 세포 / 웰의 밀도로 96 - 웰 플레이트에 접종 하였다. 휴대폰 번호 (○)를 24 - 웰 플레이트에 잘 20,000 세포 /에 씨앗을 품고 세포 계수 하였다. 값은 세 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM 있습니다. 적응 FR톰 Reidy 등. 11 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. PDT. 셀 전후 143B 세포의 위상 콘트라스트 이미지는 씨딩 및 프로토콜에 설명 된대로 밤새 부착하는 왼쪽. 농도 의존적를 시각화하기 위해, mTHPC 빛 독성을 매개, 143B 세포는, 0으로 어둠 속에서 5 시간 동안 0.6, 2.5을 배양하고, 10 ㎍ / ㎖의 mTHPC (패널 AD, 각각). 세포는 다음 230 초 동안 652 nm 파장의 5 J / ㎠ 빛으로 조명하고, 24 시간 후 촬영 하였다. 스케일 바 :. 100 μm의 경기 수이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 쉽게 할 수 있습니다.
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Discussion
PDT에 응답하여 최적의 세포 독성을 달성하기 위해, 오른쪽 레이저 광 설정과 배양 시간을 선택하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 절차는 PS의 이해를 확인하고 체외에서 PDT 유도 된 세포 독성을 정량화하기 위해 일관되고 효율적입니다. PS mTHPC의 특정 흡수 파장을 사용하여, 셀룰러 PS 흡수는 직접적으로 측정 될 수 있고, PS는 세포 독성 활성 산소 종을 생성하기 위해 활성화 될 수있다.
이 시험 관내 셋업을 사용하여, 예컨대 PS 농도, 약물 등 간격과 레이저 광 강도 다양한 파라미터 간단 PS의 특성으로 조절 될 수 있고, 세포주가 사용. 세포 수를 함께 WST-1 분석 (신진 대사 활동을 모니터링)으로 세포의 생존에 대한 좋은 평가를주는, 살아 부착 된 세포 밖으로 직접 읽기를 제공합니다. 그러나, 제시된 방법은 세포 독성, 즉 "제 히트"를 모델링 할 수있다즉시 PS의 활성화 이후의 반응 산소 종. 생체 후속 혈관 수축 및 전체 종양 퇴치에 필요한 면역 체계의 활성화를 관찰 만 동물에서 조사 할 수 있습니다.
그림 2는 부모의 낮은 전이성 HOS 세포 라인에 비해 높은 전이성 (143B)에서 더 높은 수준으로 mTHPC의 시간과 농도 의존적 이해를 보여 주었다. 143B의 OS 세포에서 mTHPC 다크 독성은 높은 농도에서 5 시간 동안 배양 (그림 3) 후 관찰되었다. 143B 세포 mTHPC으로 표시 PDT 높은 감도, 빛의 농도 의존적 광독성 효과를 발휘합니다. 광독성 효과는 0.075 ㎍ / ㎖의 최저 mTHPC 농도에서 이미 관찰되고, 0.022 ± 0.006 ㎍ / ml의 절반 최대 치사 농도 (그림 3)이 관찰되었다.
PDT는 많은 종양 유형에 대한 최소 침습 및 효율적이지만환자의 기술 (예를 들면. 부종, 홍반)을 적용 할 때의 경미한 부작용이 발생할 수 있습니다. 이 PS가 이들 세포에서 또한 PDT 후 독성을 일으키는 원인이 nontumor 세포에 의해 다음과 같이 종양 세포에 의해 납치, 또한되지 않았 음을 나타냅니다. Triesscheijn 등 알. 인간 섬유 아 세포에 비해 종양 세포의 증가 된 광감도를 표시 할 수 있었다. 대조적으로, 사람의 미세 혈관 내피 세포는 높은 감광성 12 주도 다른 시험 세포주보다 mTHPC의 높은 흡수를 보였다. 이러한 연구 결과는 자주 2를 관찰 PDT 관련 항 혈관 효과와 상관 관계.
기술 된 방법은 다른 PS에 대해 적용될 수있다. 배양 시간과 레이저 광 강도는 PS의 특성에 적응 될 필요가있다. 또한, PDT 판매용 설정 방법 자체 세포주 의존적이지만 아니므 OS 세포 이외에서 유도 될 수있다. 등의 추가 연구EAD 밖은, 세포 사멸 메카니즘은 예를 들면, 분석 될 수있다. 세포 사멸, 괴사에 autophagy에 관련된 단백질의 웨스턴 블롯 분석에 의해. 또한 PS의 세포 내 현지화 공 초점 레이저 주사 현미경으로 예를 가시화 할 수 있습니다.
시험관, 레이저 빛으로 PS와 PDT의 유도와 세포, 즉 배양에 PDT에 대해 기술 된 다른 단계는 밀접하게 임상 상황과 유사. 환자는 (IV 또는 SC가. 적용) PS와 별개의 약물 빛 간격 후, 관심 (예. 종양 조직)의 영역이 레이저 광 (13)에 불이 나타납니다. 아무런 OS에 적용되지 않았지만, 그 잠재적 인 장점은 명백하다; PDT 자주 차 종양의 메인 림 부근 일차 종양 세포 클러스터로서 성장 종양 위성의 수술 치료에 특히 매력적인 것으로 간주되고 재발을 개시 할 수있다 의 동안하지 못한 경우기본 종양의 절제 urgical. 비록 큰 골 종양은이 기술로 처리 될 수있다. 이 개 14 유망 연구에 의해 밝혀졌다. 또, 수술로 절제 될 수없는 종양 세포의 박멸 (예 체류 전이 주로 폐에서 발생), 또한 OS 전이성 질환을 가진 환자에 PDT의 가능한 미래의 응용을 나타낼 수있다.
이 실험을 수행하는 동안, 치료는 보통 일광도 mTHPC을 활성화하는 데 필요한 파장을 포함로 모든 작업 단계, 세포에 PS를 추가 한 후 최소한의 빛의 노출에 따라 수행되는 것을주의해야한다,하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 전임상 모델에서 생체 내 응용 프로그램에 대한주의를 mTHPC를 주입 한 후 직접 빛으로부터 동물을 보호하기 위해 수행 할 필요가있다. 또한, WST-1 분석은 세포 사멸의 간접적 인 지표가 종양 세포의 대사 활성을 평가하는 것을주의해야한다. 따라서, 총 세포 수와의 콤비는 여기에 제시된 좋습니다.
결론적으로, 설명 된 방법 (PS 흡수 및 PDT - 유도 세포 독성)의 조합은 시험관 내에서 PS의 독성 성질을 특성화하기 위해 신속하고 비용 효과적인 절차를 제공한다. 이러한 생체 외 결과, 최적의 광 강도와 약물 등 간격의 범위는 PDT가 생체 내에서 어떻게 적용될 수 있는지의 좋은 표시를 제공하는, 추정 될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이해 관계의 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 친절하게 자신의 도움말 및 기술 전문 지식에 대한 수산나 Gräfe과 아르노 WIEHE 특별 감사와 함께, 리포좀 mTHPC 제형으로 우리를 제공 biolitec 연구 GmbH의 (예나, 독일) 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 결과의 많은 부분을 생성 및 출판 (11)에 대해 coresponsible했다 케르 스틴 Reidy을, 감사의 말씀을 전합니다.
이 작품은 Schweizerischer Verein에 Balgrist, 취리히 대학, Krebsliga 취리히뿐만 아니라 월터 L.와 요한 울프 재단, 취리히, 스위스에서 부여 및 EuroNanoMed ERA-NET / SNF 스위스에서 부여로에서 교부금에 의해 지원되었다 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 31NM30-1분의 131,004. 이 작품은 또한 HSM Kanton 취리히의 근골격계 종양학 (고도로 전문화 된 의학) 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
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