Summary
인간과 돼지 : 우리는 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 극저온 전자 현미경, 지질 나노 기술 및 구조 분석의 조합을 제시한다. 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 우리의 실험실에서 개발 된 방법론을 설명한다.
Abstract
극저온 전자 현미경 (cryo 종) (1)는 수화 상태와 막 환경 2 단백질과 복합체의 기능 구조를 조사 할 수있는 강력한 방법입니다.
응고 인자 VIII (FVIII)은 세 다중 도메인 혈장 당 단백질이다. 심각한 출혈 장애 - 결함 또는 FVIII의 결핍은 혈우병 A 형의 원인이다. 단백질 분해 활성화되면, FVIII 정상적인 혈액 응고 4 중요한 부정 청구 혈소판 막에 세린 프로테아제 팩터 IXA에 바인딩합니다. FVIII이 응고에서 수행하는 중추적 인 역할에도 불구하고, 그것의 막 결합 상태에 대한 구조 정보가 불완전 5입니다. 재조합 FVIII 농축 혈우병 타입에 대해 가장 효과적인 약물이며 시판 FVIII는 인간이나 돼지, 인간 팩터 IXA 6,7 모두와 복합체 형성 기능과 같이 표현 될 수있다.
">이 연구에서 우리는 극저온 전자 현미경 (cryo 종)의 조합을 제시, 지질 나노 구조 분석은 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 :. 인간과 돼지의 연구실에서 개발 된 방법론 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 것이 설명되어 있습니다. 대표적인 결과는 우리의 접근 방식은 순서에 매우 상동 두 (86 % 서열 동일성 사이의 나선형 조직의 차이를 정의 할 수있을만큼 충분히 민감하다는 것을 보여 ) 단백질. 헬리컬 조직, 극저온-EM 및 전자 단층 촬영 (ET) 데이터 수집에 대한 상세한 프로토콜. 이차원 (2D 관련) 및 3 차원 (3D) 구조 분석은 인간 및 돼지의 3D 재구성을 구하는인가 FVIII-LNT가 논의된다.되게 인간 및 돼지 FVIII-LNT 구조가 제안 된 방법론의 전위 계산기 계산기하도록 보여높은 해상도에서 혈액 응고 인자 VIII의 전자 기능, 막 결합 조직.Introduction
혈액 응고 인자 VIII (FVIII)는 여섯 도메인이 구성 2,332 아미노산의 많은 당 단백질이다 : A1-A2-B-A3-C1-C2 3. 트롬빈 활성화 FVIII는 막 결합 Tenase 단지 내 팩터 IXA에 보조 인자 역할을시. 막 따라 방식으로 FIXa에 활성화 FVIII (FVIIIa)의 바인딩 FIXa의 단백질 분해 효율에게 효율적인 혈액 응고 4 중요한 10 개 이상의 5 시간을, 강화한다. FVIII이 응고 Tenase 복합체 형성에서 수행하는 중요한 역할에도 불구하고, 기능 막 결합 FVIII 구조를 해결하기 위해 아직있다.
이 문제를 해결하기 위해 높은 친화력 8,9 FVIII과 결합하고 활성화 된 혈소판 표면 닮은 할 세린 (PS)에서 부유 단일 지질 이중층 나노 튜브 (LNT)을 10 개발되었다. LNT에 바인딩 FVIII의 연속 나선 조직은 effecti로 입증되었습니다극저온-EM (5)에 의해 FVIII 막 바인딩 된 상태의 구조 결정에 대한했습니다. 기능화 LNT는 cryo 종 (11, 12)에 의해 단백질 - 단백질 및 나선형으로 조직 막 관련 단백질의 단백질 막 상호 작용을 연구 할 수있는 이상적인 시스템입니다. 시편의 생리적 환경 (버퍼, 막, 산도)에 가장 가까운에서 보존으로 알아내는-EM은 첨가제 및 동위 원소없이, 이러한 X-선 결정학 및 NMR 등 기존의 구조 방법에 비해 장점이 있습니다. LNT의 크기, 형상 및 조성 Tenase 복합체가 생체 내에서 조립 활성화 된 혈소판의 pseudopodia에 의해 방불로 FVIII의 경우,이 기술을 막 결합 구조를 공부하는 것은, 더 많은 생리 학적으로 관련이 있습니다.
결함 및 FVIII 원인 혈우병 A, 인구 4, 6의 1 5,000 명의 남성에 영향을 미치는 심각한 출혈 장애의 결핍. 대부분의 전자혈우병에 대한 ffective 치료는 재조합 인간 FVIII (hFVIII)의 평생 관리입니다. 재조합 FVIII 혈우병 치료의 중요한 합병증은 혈우병 환자 (13)의 약 30 %에 영향을 미치는 인간의 모습을 억제 항체의 개발이다. 이 경우, 돼지 FVIII (pFVIII) 농축 인간 FVIII과 인간 FIXa 7 형태의 기능성 복합체에 대한 억제 항체 돼지 FVIII 표시 낮은 교차 반응으로 사용된다. 돼지와 인간 FVIII 양식 모두의 막 결합 조직을 설정하면 FVIII 공동 인자의 기능 및 혈액 지혈에 대한 의미의 구조적 기초를 이해하는 것이 중요합니다.
이 연구에서, 우리는 지질 나노 기술, 극저온-EM, 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 조직을 해결하기 위해 설계 구조 분석의 조합을 설명합니다. 나선형으로 조직 porci의 제공을 알아내는-EM 데이터와 3 차원 구조음으로 대전 된 LNT에 북동 인간 FVIII는 FVIII의 구조 결정 및 막 결합 응고 요인과 생리적 막 환경에서 단지 기초로 제안 된 나노 기술의 잠재력을 보여줍니다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 버퍼 교환 인간 FVIII-BDD (14)과 HBS-CA 버퍼에 돼지 FVIII-BDD 15 (20 mM의 HEPES, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 염화칼슘, 산도 = 7.4)는 1.2 ㎎ / ㎖에 집중한다. -80 ° C에서 단백질 용액을 유지
- 1시 4분 W / 클로로포름의 비율 (W)에 갈 락토 (GC) 및 포스파티딜 세린 (PS)을 혼합하여 지질 나노 튜브 (LNT)을 준비합니다. 아르곤 하에서 클로로포름을 증발시키고, 1 ㎎ / ㎖로 HBS 완충액에서 지질을 용해. 4 ℃에서 LNT 솔루션을 유지
FVIII-LNT의 2. 극저온 전자 현미경
- cryo 종 샘플 준비
- (300)는 50 (W)에 10 초 동안 O 2, H 2 가스의 혼합물에 Quantifoil R2 / 2 구리 그리드 (탄소 사이드)를 메쉬 방전을 글로우
- 1시 1분 w / w 비율에 HBS-CA 버퍼의 FVIII 및 LNT 솔루션을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어.
- 2.5 ㎕의 한 방울을 적용합니다Vitrobot 마크 IV 가습 실 (100 % 습도)에서 친수성 전자 현미경 눈금 FVIII-LNT 샘플.
- 오와 플래시 액체 C 2 H 6 그리드 (3.5 초 동안 한 오점, 얼룩 힘 1) 동결, 비정질 얼음을 얻기 위해 액체 N 2로 냉각.
- 액체 N 2 (LN2)에서 보관 상자에 보관 그리드.
- CRYO-EM 데이터 수집
NOTE : JEM2100-LaB6 (2010 년)는 전자 현미경, 진공 시스템, 조명 시스템, HT, 렌즈 전류 등 온 독서 창문 스크린 및이 연결된 컴퓨터 이루어진 TEMCON 운영체제 탑재 패널 : 왼쪽 및 오른쪽 열의 양쪽에 배치. 빔 이동 X, Y 노브 (SHIFT Y, SIFT Y)와 다기능 (DEF / STIG) 노브가 두 패널에 있습니다. 왼쪽 패널의 조명 (BRIGTHNESS) 노브입니다. 오른쪽 창에 다음과 같습니다 배율 (MAG / CAM 길이)와 포커스 (FOCUS) 노브와 세 걸 보면G (MAG1, MAG2, LOWMAG)과 회절 (DIFF) 모드 버튼. 우리는 알파 2에 MAG1에서 우리의 데이터를 수집. 알아내는-EM 데이터 수집에 필요한 최소량의 조명 조건 (MDS) 오른쪽 패널에 F6 버튼, 맨 윗줄을 통해 F1으로 설정됩니다. 이 프로토콜에서 일반 설정이 사용됩니다 : F1 - 인상 / 낮은 화면, F2 - 검색 모드, F3 - 포커스 모드, F4 - 사진 모드, F5 - MDS OFF / ON 및 F6 - BEAM BLANK, 방사선으로부터 시료를 보호하는 데 사용 빔을 편향에 의해 손상 될 수 있습니다.- 크라이 역에 크라이 홀더를 놓고 홀더와 LN2와 크라이 역의 듀어를 입력합니다. 온도가 -192 ° C, 홀더의 끝에 열려있는 셔터에 도달하면, 장소 이전에 지정된 장소에 알아내는-EM 그리드를 동결 링 클램프로 고정.
- 전자 현미경으로 극저온 홀더를 삽입합니다. 극저온 홀더 및 LN2와 반대로 contaminator 챔버의 듀어 리필. 홀더는 30 ~ 60 분 동안 안정화 될 때까지 기다립니다. 보도 자료에 F6과필라멘트 전원을 켭니다. 격자를 볼 수있는 홀더에 필라멘트가 포화, F6 키를 눌러 끄고 셔터 열기.
- 보도 자료 저배율 / 알파 1 (200X의 잡지에서 설정) 및 그리드에 얇은 얼음으로 영역을 찾습니다.
- 최소 용량 (MDS) 모드를 설정하고 표본을 손상시키지 않고, 낮은 전자 복용에 cryo 종 데이터를 수집하기 위해 MAG의 1/alpha 2로 전환합니다.
- F2 키를 눌러 검색 모드를 설정합니다. 40,000 X에 배율을 설정합니다. / 2 ·의 - 최소한의 전자 량에 BRIGTNESS 노브 ~ 0.04 전자와 빔을 확대합니다. 보도 자료 DIFF 회절 모드로 전환합니다. MAG / CAM의 길이 노브 120 cm에 카메라 길이를 설정합니다. 탄소막의 구멍의 지질 나노 튜브가 LOWMAG에서 미리 선택된 구역 내의 격자 영역을 찾아.
- F4 키를 눌러 40,000 배 확대 한 사진 모드를 설정하고 16-25 E의 복용시 밝기 노브로 조명을 설정 - / 2 ·의. Z-높이를 조정하는 초점 조건을 설정하기 위해 눌러 기본 포커스 버튼Z UP / DOWN 버튼 (오른쪽 컨트롤 패널)와 시편의. -1.5와 -2.5 μm의 사이에 설정 디 포커스.
- 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역에 해당하는 검색 모드에서 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 사각형 그리기로 검색하여 사진 모드를 맞 춥니 다.
- F3 키를 눌러 100,000 X 배율에서 초점 모드를 설정합니다. 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역을 조사하지 않도록 - (5 ㎝ 반경 ~ 4) 및 축 오프 CCD 칩을 충당하기 위해 조명을 초점을 맞 춥니 다. FOCUS 노브 및 DEF / STIG 노브와 이미지의 난시에 대한 올바른와 ~ -1.5과 -2.5 μm의 디 포커스를 조정합니다.
- 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 라이브 영상을 획득하여 검색 모드에서 이미지에 표시 할 FVIII-LNT를 선택합니다. 라이브 뷰 창에 그려진 사각형 FVIII-LNT를 중앙에 배치합니다.
- 사진 모드로 전환하고 ACQUIR을 클릭하여 52,000 X 효과 배율 0.5 초 노출에 CCD 카메라의 디지털 이미지를 기록디지털 현미경 카메라 모니터에서 E 버튼을 누릅니다. 화상 획득 조건은 그러한 화상 PHOTO 모드에서 획득 된 경우에만 개방 빔 블랭크 (셔터)로서 설정된다.
- 고속 푸리에 변환 (FFT)을 구하는 CTRL-F를 눌러 취득 된 화상의 품질 및 디 포커스를 확인한다.
3. 3D 재구성
참고 : 2D 및 3D 분석에 사용 된 이미지 분석 소프트웨어 : EMAN2 및 IHRSR 자유롭게 사용할 수 있습니다. EMAN2는 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install에서 다운로드 할 수 있습니다. egelman@virginia.edu : IHRSR 소프트웨어는 교수 Egelman에서 얻을 수 있습니다. 최종 IHRSR 세목이 텍사스에서 실행하는 센터 클러스터 컴퓨팅 고급 : http://www.tacc.utexas.edu/을 텍사스 대학 오스틴에서. 그림 1에 표시된 3 차원 복원 알고리즘은 두 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다 : 첫 번째 차원 참조 무료 alignme 나선 세그먼트 (입자)의 균일 한 세트를 선택NT (RFA) 알고리즘은 제 IHRSR에 통합 헬리컬 파라미터 및 확대 투영 알고리즘을 기반 3D 재구성을 달성 EMAN이 구현. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 : 첫 번째 단계는 단일 입자 SPA EMAN2이 특별히 개발 및 배포되고있는 (알고리즘)과 3D 재건을 위해 균일 한 입자의 집합을 선택하기 위해 개발 된 프로그램을 사용합니다. 이 단계는 극저온-EM 데이터에 적응되었다. 두 번째 단계는 특히 재조합 인자 VIII 형태로 수득 헬리컬 어셈블리의 분류를 위해 설계 IHRSR 알고리즘으로 이루어진다. 이 알고리즘은 과학 문학 (12)를 통해 광범위하게 설명되어 있습니다.
- 균일 한 입자 나선형 재건 (나선형 세그먼트) 세트를 선택 http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 : EMAN2 과학 이미지 프로세싱 제품군과 2D 이미지 분석을 수행합니다.
- 똑 바른과 극저온-EM의 현미경 사진을 선택HT 디지털 카메라 소프트웨어 및 시각화 도구를 나선형 튜브를 잘 조직.
- 반전, 정상화하고 e2workflow.py GUI에서 X-선 픽셀, 단일 입자의 재구성 (SPR) 옵션을 필터링 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
- e2helixboxer.py의 GUI에서, 역 정규화 및 X-선 픽셀이 필터링 된 이미지를 가져옵니다. 사용하여 90 % 정도 겹쳐 256 X 256 픽셀 (2.9 A / PIX)에 FVIII-LNT의 나선형 튜브와 세그먼트를 선택 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
- 원래의 현미경 사진에서 디 포커스를 평가하고 e2workflow.py에 통합 e2ctf.py 옵션과 같은 현미경에서 나선형 세그먼트에 대비 전송 기능 (CTF) 보정 (만 위상 보정)를 적용 http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf.
- 초기 입자 (나선형 세그먼트)를 생성 e2workflow.py GUI에서 설정 - SPR 옵션 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow.
- ITER = 8 - 'e2refine2d.py : e2refine2d.py 알고리즘 스크립트 다음과 같은 직경의 LNT와 나선형의 주문도 (그림 2)와 균일 한 데이터 세트를 선택하는 기준 무료 K-평균 등급을 적용하기로 2D 수준의 평균을 계산 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - 경로 = r2d_001 - 입력 = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = 도트 - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = 도트 - classraligncmp = 상 - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = 평균 - normproj-classkeepsig ', 그에 따라 ncls 값을 변경.
- 클래스 평균 80 % 이하의 유사성 입자가 주어진 클래스에서 제외되는 것을 의미한다 'classkeep = 0.8'8 반복을 통해 150 클래스 '= 151 ncls'에서 설정 한 초기 데이터를 분류. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
- 클래스의 평균에서 입자를 병합중간 데이터 세트를 생성하는 e2display.py의 발음 나선 회절.
- 순서의 동일한 직경과 정도 클래스를 구분하기 위해 50 클래스 '= 51 ncls'에서 설정 한 중간 데이터를 분류.
- http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector : 입체 재건에 대한 최종 데이터 세트를 생성하는 e2display.py 주문의 동일한 직경과 정도 클래스에서 입자를 병합합니다.
- Egelman (17, 18)에 설명 된대로 반복 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 알고리즘으로 나선형 재건을 수행합니다.
- 상승을 추정 결합 푸리에에서 FVIII-LNT 나선 ΔZ (A)는 최종 데이터 세트에서 입자의 변형.
- 5에서 ΔΦ 증가, 일정한 ΔZ와 병렬 IHRSR 세목을 실행하여 방위각 ΔΦ (º)를 정의76; 5 ° 씩 60 °에.
- 초기 볼륨으로 특색이없는 실린더와 3.2.1에 정의 된 초기 나선 매개 변수 ΔZ 및 ΔΦ로 설정 한 각 최종 데이터 100 연속 IHRSR주기를 실행합니다. 3.2.2.
- 클래스 최종 데이터 세트의 2 차원 분류에서 평균과 최종 IHRSR 재건의 돌기 사이의 나선형 매개 변수와 대응의 융합의 최종 볼륨을 검사합니다.
- 최종 비대칭 3D 볼륨에서 관찰 된 비대칭 단위 분포에 해당하는 최종 3 차원 복원에 대칭을 부과 : 인간 FVIII-LNT 4 배와 돼지 FVIII-LNT에 대한 5 배. 최종 대칭 된 3D 재구성을 생성하는 또 다른 100 정제 사이클을 실행합니다.
- 'e2proc2d.py <infile> <outfil : 첫 번째 홀수 및 짝수에 해당 데이터 셋을 분리하여 두 볼륨에 대한 푸리에 쉘의 상관 관계 곡선을 계산전자> - 분할 = 2 '. 3.2.3에 설명 된대로 100 IHRSR 연속 분류 실행합니다. 홀수 및 짝수 데이터 세트에서 생성 된 3D 볼륨의 FSC를 계산 'e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc'.
- UCSF 키메라의 FVIII-LNT 볼륨을 시각화하고 세그먼트.
- 단계 3.2.5에서 최종 볼륨을 엽니 다. UCSF 키메라와 도구> 볼륨 데이터> VOLUME 뷰어 옵션에서 0.005로 윤곽 레벨을 설정합니다.
- 툴> VOLUME 자료> 세그먼트 MAP, 세그먼트 MAP 탭을 선택 볼륨 및 세그먼트 볼륨에 세그먼트를 클릭합니다.
- 그룹 세그먼트는 CTRL +의 SHIFT 및 클릭기로 선택하여 하나의 단위 셀에 대응.
- 단위 세포에 의해 세그먼트를 색상과 구조적 특징을 강조하기 위해 작업> COLOR 옵션으로 나선.
4. 전자 단층 촬영
- 부정적인 스테인드 FVIII-LNT 샘플 준비
- <리> cryo 종의 실험으로 FVIII-LNT 샘플을 준비합니다.
- cryo 종의 실험로에서 서쪽으로 50에서 O 2, 10 초 동안 H 2 가스의 혼합물에 탄소 코팅 300 메쉬 구리 그리드 (탄소 사이드)를 배출 노을.
- 그리드 6 나노 콜로이드 금 나노 입자와 2.5 ㎕의 FVIII-LNT 서스펜션의 드롭을 적용, 초과 액체를 얼룩 부정적인 2 분 5 ㎕의 1 % 우라 닐 아세테이트 용액을 적용하여 얼룩. 그리드를 건조 과잉 액체와 공기를 더 럽히.
- 하나의 경사 홀더에 격자를 전송합니다.
- 전자 현미경에 홀더를 전송합니다.
- 52,000 X 효과적인 배율 CCD 카메라와 +60 ° 및 이미지 촬영시 -60 °의 각도 범위에서 2 ° 씩의 SerialEM 소프트웨어 (19) 자동 기울기 시리즈를 수집, -6 -10 μm의 디 포커스 (150)의 전자 량에 - 170 ELEctrons / 2 ·의 단층 당.
참고 : 4.2에서 획득 한 pFVIII-LNT와 hFVIII-LNT 경 시리즈를 재구성. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html : 튜토리얼 다음 IMOD 소프트웨어의 ETomo 옵션
- 터미널 창을 사용하여, 3DMOD의 단층 촬영을 엽니 다. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html.
- 빈은 IMOD BINVOL 4에 의한 단층은 단층의 크기를 감소시키는 명령.
- IMOD ROTATEVOL 명령을 사용 비닝 단층에서 Y 축을 따라 지질 나노 튜브를 회전 시키도록 적절한 각도를 선택한다.
- IMOD ROTATEVOL 명령을 사용하여 전체 단층 촬영을 돌립니다.
- IMOD CLIP 크기 변경 명령을 사용하여 Y 축을 따라 중심 선택한 지질 나노 튜브를 자릅니다.
- 3DMOD로 자른 하위 단층 촬영을 엽니 다.
- 따라서 인자 VIII 분자의 배열을 시각화하기 위해 단층 촬영을 클릭Z-축 및 부 단층 체적 Y-축을 따라 분할.
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Representative Results
재조합 인간과 돼지 FVIII은 성공적으로 부정적으로 활성화 된 혈소판 표면을 닮은, 단일 이중층 LNT 청구 나선형으로 조직되었다. 인간과 돼지 FVIII-LNT의 나선형 조직 (그림 2) 수집 된 디지털 현미경을 통해 일치했다. 제어 LNT와 인간과 돼지 FVIII-LNT 나선형 튜브를 선택 e2helixboxer.py의 GUI 및 e2workflow.py의 GUI, 단일 입자 옵션 (표 1)로 만든 초기 데이터 세트로 분할되었다.
막 - 결합 인간 및 돼지 FVIII-LNT의 헬리컬 순서 e2display.py GUI (EMAN2) (도 3)와 클래스 평균의 푸리에 변환에서 평가 하였다. 유용한 제어 LNT 2D 클래스 평균의 지질 이중층은 잘 정의된다. 내부 및 외부 전단지와 막 소수성 코어의 낮은 밀도 (명확하게 볼 수 있습니다
인간과 돼지 FVIII-LNT의 초기 3D 복원은 최종 인간과 돼지 FVIII-LNT 데이터 세트에서 1,000 대표 입자를 실시 하였다. 백 연속 IHRSR 반복은 초기 볼륨과 같은 특색이 실린더 (160 내부 및 500 외경) 각 3D 재건을 위해 실행되었다. 결합 푸리에에서 계산 된 축 상승 (ΔZ)는 나선형 세그먼트 (입자 세트)의 변형 돼지 FVIII-LNT 인간 FVIII-LNT와 (36)에 대한 (41)와 동일하다 (그림 4a 및도 4b). 반복적 인 검색에서 정의 된 초기 방위각 (ΔΦ)는 인간 FVIII-LNT에 대한 40.0 °에서와 돼지 FVIII-LNT에 대한 35.0 °로 추정된다. 최종 볼륨은 최종 reconstr에서 클래스의 평균과 예측 사이의 나선형 매개 변수와 대응의 융합에 대해 검사된다uction,도 5에 기재된 조건에 따라. 선택한 3D 복원 및 나선형 매개 변수를 대응하는 초기 볼륨과 ΔZ = 41.1 A와 ΔΦ와 인간 FVIII-LNT에 대한 네 시작 나선 조직에 통합 100 사이클의 두 번째 IHRSR 정제의 초기 나선 매개 변수로 부과 = 42.0 ° 및 ΔZ = 35.5 A와 ΔΦ = 34.8 °와 돼지 FVIII-LNT의 다섯 시작 나선 조직. 4 배와 인간과 돼지 FVIII-LNT의 재건을위한 5 배 나선형 대칭을 부과 최종 100 IHRSR 반복은 각각 초기 볼륨과 마지막 비대칭 IHRSR 세목 (그림 4C와 4D)에서 해당 나선형 매개 변수를 사용하여 수행됩니다. 최종 볼륨은 8 인간 FVIII하고 나선 축 (그림 5A)을 중심으로 구성 10 돼지 FVIII의 막 결합 분자를 보여줍니다. 각 사람의FVIII 분자는 41.2 Å 번역 및 이전에서 42.0 ° 회전 각 돼지 FVIII 분자는 35.9 Å를 번역되고 최종 3D 재구성 (도 5b)의 헬리컬 파라미터에 대응하는, 이전부터 35.2 º를 회전한다.
재구성 된 전자 단층 촬영 동일한 실험 조건에서 얻어진 인간 및 돼지 FVIII-LNT 사이 나선형 조직의 차이를 확인한다. 나선 축에 수직 인 방향에서 본 헬리컬 재구성에서 재구성 된 단층 촬영 및 3D 이미지 볼륨에서 상면의 비교는, 상기 헬리컬 IHRSR 파라미터 (도 6)로 정제 3D 재구성의 정확성을 검증한다. 인간 FVIII-LNT 3D 재건의 비대칭 2 차원 단위 셀의 크기는 다음과 같습니다 = 17.8 nm의, B = 8.2, γ = 84 °, 돼지 FVIII-LNT 차원의 재건 : =18.4, B = 7.2 γ는 = 70 ° (그림 6). 막 바인딩 차원의 결정으로 조직 인간 FVIII의 단위 셀의 크기는 다음과 같습니다 = 8.1, B = 막 표면 (20)을 향해 볼 하나 FVIII 분자에 의해 덮여 표면에 해당 = 67 º 7.0 γ. 2D 및 나선형 크리스탈로 구성 FVIII의 단위 셀의 크기를 비교하는 것은 나선형으로 LNT 표면에 구성 할 때 인간과 돼지 FVIII 분자 모두가 이합체를 형성 함을 나타냅니다.
도 1. 구조 분석 흐름도. 단계 EMAN2 (16)에서 구현 참조 자유롭게 정렬 알고리즘에 기초하여 2D 종별 분석에 따라 파란색으로 선회된다. 3D 이미지 분석을 반복 헬리컬 진짜로 수행하는 단계는 다음 공간의 재구성 알고리즘 (IHRSR)는 빨간색으로 동그라미 있습니다. 반복 IHRSR주기는 점선 화살표로 표시된다.
그림 2.을 알아내는-EM 디지털 현미경. (4,096 X 4,096 픽셀, 2.9 A / PIX) 지질 나노 튜브 (LNT)의. A. 제어 LNT. B. 인간 FVIII-LNT. C. 돼지 FVIII-LNT와 바운드 FVIII없이 . FVIII-LNT 비정질 얼음 현탁되는 탄소막의 구멍의 가장자리에 위치한 백색으로 표시된다. 단백질과 지질 농도는 검은 색이다. X 512 (512)의 확대 전망 (인 세트)을 (흰색 사각형 점선) 각각 인간과 돼지 FVIII의 나선형 조직의 차이를 설명 부분을 잘립니다. 스케일 바는 100 ㎚이다.ig2highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표 2D 클래스의 평균 (맨 윗줄)와 중간 입자 세트 (표 1)에서 해당 푸리에 변환은 (맨 아래 줄) 50 클래스. A. 제어 LNT B. 인간 FVIII-LNT C. 돼지 FVIII-LNT로 분류. 클래스의 수와 각 클래스에 포함 된 입자의 수는 표시됩니다. 인간과 돼지 FVIII 사이에 나선형 순서의 차이가 명확하게 이미지를 볼 수 있으며 이러한 이미지의 변환 푸리에에서 얻은 회절 패턴에 의해 확인된다. 를 보려면 여기를 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전.
그림 4. 인간과 돼지 FVIII-LNT. A. 결합 푸리에의 3D 나선형 재건 1000 나선형 세그먼트에서 변환 할 수 있습니다. 제 1 및 제 2 층 라인은 82분의 1 Å를 중심으로 -1 1 / (41) -1 인간 FVIII-LNT, 그리고 1 / 72에서 -1 1 / (36) -1 돼지 FVIII-LNT (흰색위한 것입니다 화살표). B. 표면 핑크 인간의 표현 (ΔZ = 41.1 A, ΔΦ = 42.0 º)과 파란색 (ΔZ = 35.9 A, ΔΦ = 35.2 º) FVIII-LNT 3D 나선형 재건에 돼지. 두 볼륨 (최소 밀도는 UCSF 차임 계산으로 0이며, 최대 농도 0.02 0.005 윤곽 수준에서 제시라, 볼륨 뷰어 옵션 21). FVIII-LNT 관의 길이는 2.9 Å / PIX 256 픽셀. C. 푸리에 쉘의 상관 관계 (FSC) 인간과 돼지 FVIII-LNT는 FSC에서 20.5 Å의 해상도를 보여주는 = 0.5에 대한 그래프입니다.
그림 5. 그림 (b)에 나타낸 인간과 돼지 FVIII-LNT 나선 복원, 인간과 돼지 FVIII-LNT. 세그먼트 표면 표현의 나선형 조직. 볼륨은 인간 FVIII-LNT와 돼지 FVIII-LNT 5 배 대칭 4 배 대칭을 부과 한 후 분할된다. 비대칭 단위는 색 인간 FVIII-LNT와 인간의 사각형으로 표시 나선 축을 따라하고 돼지 FVIII-LNT. A. 조회수 파란색 녹색 노란색 - 빨간색으로 구분됩니다돼지 FVIII-LNT의 국방부. 인간 FVIII-LNT 구조는 외측 LNT 막 주위에 편성 8 분자를 도시하고 돼지 FVIII 구조는 외측 LNT 막 주위에 편성 열 분자가 숫자로 나타내었다. B. 재생수 헬리컬 축에 수직이다. 인간 FVIII-LNT는 4 - 시작 나선 구조이고 돼지 FVIII-LNT는 5 - 시작 나선형 구조이다. 각각의 하나를 시작 나선은 숫자로 표시하고 색상으로 구분됩니다. 우리는 (*)과 녹색 선으로 각각의 구조에서 나선 중 하나를 강조했다. 스케일 바는 20 ㎚이다.
그림 6. 나선형 단층 촬영과 3D 재구성. 인간 FVIII-LNT (A)와 돼지 FVIII-LNT (C) 나선형 3D 복원 자료의 비교는 perpe에게 표시됩니다나선 축에 ndicular. 각각의 단위 셀 및 개별 나선 색상 코딩 그림과 같이 5. B입니다. 및 D. 나선 축에 수직으로 본 3D 단층 촬영 재구성, 밀도의 표현입니다. FVIII 분자의 나선 배열을 반영하는 2 차원 격자가 녹색 라인으로 도시된다.
| 샘플 | CLNT | hFVIII-LNT | pFVIII-LNT |
| 초기 현미경 사진 | 61 | 474 | (542) |
| 초기 입자 세트 | 29113 | 60395 | 64665 |
| 디 포커스 (NM) | -4,051 ± 502 | -3,643 ± 737 | -3,443 ± 1,086 |
| 중간 입자 세트 | 25907 | 27305 | 22773 |
| 최종 입자 세트 | 25907 | 10,455 | 10,430 |
표 1.도 3의 흐름도에 제시된 알고리즘을 다음 2D 분석 통계.
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Discussion
이 연구에서 방법론은 매우 상동 단백질의 두 개의 막 결합 조직을 구별하기 위해 제시된다 : 인간과 돼지 FVIII 자기 조립 인체에서 발생하는 조건에서 지질 나노 튜브.
설명 과정에서, 인간과 돼지 FVIII 성공적으로 가장 중요한 단계로, 지질 나노 튜브에 나선형으로 구성되어 있습니다. 다음 중요한 단계는 주변의 액체 N 2 온도에서 플래시 냉동으로 얇은 비정질 얼음 샘플을 보존하는 것입니다. 비정질 얼음과 LN2 온도에서 샘플을 보존하는 것은 수화 나선 튜브 및 단백질 지질 거대 어셈블리 생리 활성 유지합니다. 마지막 중요 단계는 근처 LN2 온도에서 고해상도 3D 구조에 충분한 양 및 품질의 극저온-EM 데이터를 취득한다. 근처 액화 질소 온도에서 데이터를 수집하는 것은 더 높은 V에서 샘플의 탈수를 방지전자빔으로부터 현미경 및 방사선 손상의 최고 진공.
FVIII의 막 결합 구조를 계산하는 중요한 첫 단계는 2D 참고 무료 분류를 적용하고 순서의 동일한 직경과 정도 클래스에서 입자를 결합하여 균일 한 입자 (나선형 세그먼트) 세트를 획득하는 것입니다. 두 번째 중요한 단계는 나선형 재건에 적합한 초기 볼륨과 나선형 매개 변수 (상승 및 방위각)를 부과하는 것입니다. 마지막 세 번째 중요한 단계는 (부과 대칭 제외) 나선형 및 전자 단층 촬영 같은 시편의 재구성하여 얻은 3D 맵을 비교하여 나선 구조의 유효성을 검사하는 것입니다.
제시된 방법은 근처의 생리 학적 조건에서 막 관련 단백질의 기능 구조를 해결하는 능력에 고유합니다. 우리의 실험실에서 개발 된 LNT가 될 수 있습니다성공적으로 기능 막 바인딩 된 혈액 응고 인자의 나선형 조직을위한 플랫폼으로 사용하고 막 결합 2D 결정과 하나의 입자로 구성 FVIII보다 더 좋은 해상도를 얻을 수 있습니다. 우리의 목표는 상기 최종 입자 세트의 균질성과 품질을 향상시킴으로써 우리 헬리컬 복원의 해상도를 증가시키는 것이다. 2 차원의 재건을 위해 큰 초기 입자의 집합을 포함, 따라서 더 나은 곳을 알아내는-EM 조건 (전계 방출 총, 에너지 필터, DE 카메라 감지기) FVIII-LNT 나선형 필라멘트의과에서 더 많은 곳을 알아내는-EM의 현미경 사진을 수집하는 것은이 작업을 수행합니다. FVIII-LNT의 나선형 조립 및 3D 재구성 알고리즘을 개선하는 것은 우리가 나노 미터 이하와 명확하게 혈액 응고 단백질이 중요한의 막 결합 조직을 정의합니다 원자 해상도, 근처를 얻을 수 있습니다.
나선형으로 동종 FVIII의 형태를 구성하는 것은 또한 우리에게 기회로부터를 제공타이 순서의 차이는 구조와 기능의 차이에 상관 관계 수있는 방법을 특성화합니다. 이 문서에서 설명하는 방법으로 인간과 돼지 FVIII의 막 결합 구조를 해결하는 것은 수정 때하는 재조합 FVIII의 기능을 향상시킬 시퀀스를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 지식은 모두 혈전증과 지혈 분야에서 신약 개발을위한 중요한 임상 적 의미가있을 것이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다 그들이이 원고에 발표 된 절차에 대해 직접 연락 할 수 있다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
10SDG3500034 및 UTMB-NCB SSM에 자금을 시작 :이 작품은 미국 심장 협회에서 국가 과학자 개발 교부금에 의해 지원됩니다. 저자는 실리 UTMB에서 구조 생물학 센터 (에 알아내는-EM과 과학 컴퓨팅 시설을 인정 www.scsb.utmb.edu )뿐만 아니라 박사 부부. 2D 및 3D 나선형 재건 알고리즘에 대한 도움말 스티브 Ludtke 에드 Egelman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4,096 x 4,096 pixel at 15 μm/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Carbon coated 300-mesh 3 mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 sec on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300-mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R.
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N.
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M.
- Pipe, S. W.
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
