脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

サマリー

ヒトおよびブタ：我々は、2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合構造を解決するために適用クライオ電子顕微鏡法、脂質ナノテクノロジー、および構造解析の組み合わせを提示する。螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）上の二つの機能の​​組換えFVIIIフォームを整理するために私たちの研究室で開発された方法論が記載されている。

要約

低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡^）1は、水和状態と膜環境²内のタンパク質との複合体の機能的な構造を調査するための強力なアプローチである。

凝固因子^{VIII（FVIII）3は、}マルチドメイン血漿糖タンパク質である。重度の出血性疾患 - FVIIIの欠損または欠乏が血友病A型の原因である。タンパク質分解活性化されると、FVIIIは正常な血液凝固⁴のために重要である、負に帯電した血小板膜上のセリンプロテアーゼIXa因子に結合する。 FVIII凝固で果たす重要な役割にもかかわらず、その膜結合状態の構造情報は^、5不完全です。組換えFVIII濃縮物は、血友病A型に対する最も有効な薬物であり、市販のFVIIIは、ヒト又はブタ、ヒト第IXa因子^6,7の両方の機能的複合体を形成するように表すことができる。 ">本研究では、低温電子顕微鏡法（低温電子顕微鏡）の組み合わせを提示し、脂質ナノテクノロジー、構造解析は、2つの高度に相同的FVIII形の膜結合構造を解決するために適用される：ヒトとブタの研究室で開発された方法論螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）に二つの機能の​​組換えFVIIIフォームを整理することは記載されている。代表的な結果は、我々のアプローチは、シーケンス内の高度に相同性2（86％の配列同一性との間に螺旋状の組織の違いを定義するのに十分に敏感であることを証明している）タンパク質ヘリカル組織、低温電子顕微鏡と電子断層撮影（ET）データ取得のための詳細なプロトコールは、二次元（2D）所与の三次元（3D）構造解析は、ヒトおよびブタの3次元再構成を得るために適用されるFVIII-LNTが議論されている。提示、ヒトとブタFVIII-LNT構造はcalculatするために提案手法の可能性を示す高解像度での血液凝固因子VIIIのe機能、膜結合組織。

概要

血液凝固第VIII因子（FVIII）は、6つの領域で編成2,332アミノ酸の大きな糖タンパク質である：A1-A2-B-A3-C1-C2 ^3。トロンビンの活性化FVIIIは膜結合テナーゼ複合体中の第IXa因子の補因子として機能したら。膜に依存した方法でのFIXaに活性化FVIII（FVIIIaの）の結合は、効率的な血液凝固⁴のために重要である、FIXaのタンパク質分解効率を10以上の⁵倍を強化します。 FVIIIは、凝固およびテナーゼ複合体形成に果たす重要な役割にもかかわらず、機能的な膜結合FVIII構造が解決されていている。

これに対処するために、高親和^8,9とFVIIIと結合し、活性化血小板表面に似ていることが可能なホスファチジルセリン（PS）に富む単一脂質二重層ナノチューブ（LNT）は^、10が開発されている。 LNTにバインドされたFVIIIの連続した​​螺旋状の組織がeffectiであることが証明されました低温電子顕微鏡⁵によるFVIII膜結合状態の構造決定のためのVEの。官能化されたLNTは低温電子顕微鏡^11、12によって螺旋状に編成膜関連タンパク質のタンパク質-タンパク質及びタンパク質-膜の相互作用を研究するために理想的なシステムです。試料を添加し、同位体なしで生理的環境（バッファ、膜、pH）で、最も近いで保存され....

プロトコル

1。サンプルの調製

1. HBS-CA緩衝液に対する緩衝為替ヒトFVIII-BDD ¹⁴とブタFVIII-BDD ^15（20のHEPES、150mMのNaCl、5mMのCaCl _2、pH値= 7.4）および1.2 mg / mlのに集中する。 -80℃でタンパク質溶液を保持
2. 1：04 W /クロロホルム中w比でガラクトシルセラミド（GC）およびホスファチジルセリン（PS）を混合することによって、脂質​​ナノチューブ（LNT）を準備します。アルゴン下でクロロホルムを蒸発させ、1 mg / mlのにHBS緩衝液中の脂質を可溶化する。 4℃でLNT溶液を保つ

FVIII-LNTの2。低温電子顕微鏡

1. 低温電子顕微鏡サンプル調製
   1. 300は、50 W.で10秒間のO ₂とH ₂ガスの混合物中のQuantifoil R2 / 2銅グリッド（炭素側アップ）メッシュグロー放電
   2. のw / w比1:1のCa-HBS緩衝液中のFVIIIおよびLNT溶液を混合し、室温で15分間インキュベートする。
   3. 2.5μLのドロップを適用VitrobotマークIV加湿チャンバー（100％湿度）における親水電子顕微鏡グリッドにFVIII-LNTサンプル。
   4. ブロットおよびFlas....

結果

組換えヒトとブタFVIIIが正常に悪影響を活性化した血小板表面に似た、単一の二層LNTを請求螺旋状に組織された。人間とブタFVIII-LNTのらせん組織は（ 図2）収集したデジタル顕微鏡写真を通じて一貫していた。制御LNTと人間とブタFVIII-LNTヘリカルチューブはe2helixboxer.py GUIとe2workflow.py GUI、単一粒子のオプション（ 表1）で作成した初期データセットを選択し、セグメント化された。

膜結合型ヒト及びブタFVIII-LNTの螺旋順序はe2display.py GUI（EMAN2）（ 図3）を使用してクラス平均像のフーリエ変換から評価した。最高の制御LNTの2Dクラス平均での脂質二重層はよく定義されています。内側と外側のリーフレットと膜の疎水性コアの低密度が（はっきりと見える図3A）。に向かって、膜表面に対して垂直方向に配向膜結合ヒトおよびブタFVIII分子の投影された密度は、十分に.......

ディスカッション

人間とブタFVIIIの自己組織化、人体に遭遇する条件で脂質ナノチューブ上：この作品では方法論は、高度に相同タンパク質の2膜結合組織を区別するために提示されている。

記載されている手順では、ヒトとブタFVIIIが正常に最も重要なステップである、脂質ナノチューブに螺旋状に整理されています。次の重要なステップは、近い液体N ₂温度で瞬間冷凍により薄いアモルファス氷中に試料を保存することです。アモルファス氷と液体窒素温度でサンプルを保存することで水和ヘリカルチューブとタンパク質 - 脂質巨大分子集合体は、生理活性保ちます。最後の重要なステップは、近LN2温度で高解像度の3D構造のために十分な量及び質のクライオEMデータを取得する。近い液体窒素温度でのデータを収集すると、さらに高いV試料の脱水を防ぐ電子ビームから顕微鏡や放射線損傷のacuum。

FVIIIの膜結合構造を計算するには最初の重要なステップは.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LaB6	JEOL株式会社	JEM-2100
日本電子(株)	TEMCONソフトウェアで
Gatan626 クライオホルダー	ガタン株式会社	626.DH	-175 °C
温度調節器付き	ガタン
Gatan社 4K×4K CCDカメラ	Gatan, Inc.	US4000	4,096 x 4,096 ピクセル (15 μ;m/pixel 物理解像度
Solarus Model 950 プラズマクリーナー	Gatan, Inc.
Vitrobot Mark IV	FEI
カーボンコーティング 300 メッシュ 3 mm 銅グリッド	Ted Pella	01821	プラズマ 高出力
Quantifoil R2/2 300 メッシュ	電子顕微鏡科学	Q225-CR2	カーボンコーティング 300 メッシュ Cu グリッド、直径 2 mm の穴
酢酸ウラニル二水和物	テッドペラ	19481	1% 溶液、ろ過
されたガラクトシル セラミド	Avanti Polar Lipids Inc.
ジオレオイル-sn-グリセロ-ホスホ-L-セリン	アバンティポーラーリピッズ株式会社
EMソフト デジタルマイクログラフ	ガタン株式会社		http://www.gatan.com/DM/
>EMソフトウェアEMAN	無料ダウンロード		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/
EMソフトウェア Spider	無料ダウンロード		http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
EMソフトウェア IHRSR	無料ダウンロード		エドワード・H・エゲルマンから入手可能なプログラム http://people.virginia.edu/~ehe2n/
EMソフトウェア（IMOD)	無料ダウンロード		http://bio3d.colorado.edu/imod/
EMソフトウェア(SerialEM)	無料ダウンロード		ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera	無料ダウンロード		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

とJEM2100は、製200kVで運転860546840035