Summary
我们提出了选择性的一个新的荧光技术在主动吞噬细胞原位标记，它明确了在中风细胞的尸体。该方法对于评估脑反应缺血重要的，因为目前在缺血性脑吞噬细胞的只有一小部分参与细胞死亡的间隙。
Abstract
我们描述局灶性脑缺血的吞噬细胞清除的可视化一个新的组织化学方法。该方法允许消除死细胞的行程中任何细胞谱系的废物管理吞噬细胞的研究。虽然不同的起源，有能力吞噬了无数的细胞存在于脑缺血，其中只有一部分积极吞噬和消化细胞的尸体。选择性可视化，量化和这种积极的吞噬废物管理的分析是评估大脑反应缺血帮助。高效的细胞死亡的间隙是由缺血性脑损伤的恢复很重要，因为它开辟了道路，为后续的再生过程。未能清理尸体会导致因使用非降解的DNA和蛋白质毒性反应。所描述的过程使用的荧光探针由病毒拓扑异构酶选择性地连接到吞噬过程中所有的吞噬细胞产生的特征DNA断裂和细胞消化缺血不可逆的损坏。该方法用于脑反应缺血性损伤的调查的新工具。
Introduction
缺血性中风引起的影响脑组织的深刻变化。它发起大量的细胞死亡，从而导致小胶质细胞来源的居民吞噬细胞迅速激活。它也由各种类型的血源性专业吞噬细胞包括中性粒细胞，巨噬细胞，树突状细胞和肥大细胞1,2衬托缺血性脑浸润。
目前仍有争论，这是否反应缺血性损伤起到积极的或消极的作用。虽然吞噬中风后，因为它清除死细胞和抑制炎症可以是有益的，它也产生有毒的活性氧自由基影响神经元的存活和加剧组织损伤1-5。
虽然几种类型的吞噬细胞浸润缺血性脑，不是所有的人都被吞噬细胞的尸体和再生过程1-3结算方式参与废物管理。此CReates选择性识别废物管理的细胞，进行细胞死亡在中风的吞噬细胞清除的要求。当成像这样的活性废物管理信元，它也是重要的回答他们是如何高效率地降低了吞噬细胞尸体的问题。在吞噬死亡细胞的DNA的有效和完全降解非常重要，因为它可以防止自身免疫和病理核材料6的释放。
在这里，我们提出了使用特定的DNA断裂为主动吞噬细胞的新标志物探针。这些签名里面休息职能废物管理细胞吞噬细胞核破裂过程中独家生产。因此，探针选择性标记，只有那些吞噬细胞吞噬，并积极消化细胞尸体。他们还允许观察吞噬后的强度和DNA分解完成。该探针是有用的在强度和effici的评价ENCY吞噬细胞清除的。
新探针依赖于非蛋白质为基础的标记，因此可以特别有利的行程，其中广泛的缺血性损伤可破坏细胞形态或耗尽基于蛋白质标志物，特别是内芯缺血区的研究。
该技术的原理是在图1，图中示出了由酶牛痘拓扑异构酶（VACC TOPO）连接发夹形的寡核苷酸探针 到5'OH DNA末端的DNA消化7时溶酶体的DNase II产生。
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Protocol
该方法适用于甲醛固定，石蜡包埋的组织切片。该技术是在这里的应用程序演示实验中风大鼠。
1，对酪胺信号放大（TSA）系统组件的准备
虽然该协议为基础的强化中使用的标签的最后阶段，准备用于该反应可能需要超过1个小时。因此，这是方便的开始标签之前必须进行的全港性系统评估的试剂。
- 使荧光酪胺原液。使用与TSA标记试剂盒将各小瓶提供的荧光酪胺试剂。加入300μLDMSO的酪胺试剂瓶。荧光团的酪酰胺储备液是稳定至少3个月贮存于4℃。时
- 使含有TNT洗涤缓冲液：0.1M的Tris-HCl，pH值7.5; 0.15 M氯化钠; 0.05％Tween-20的。如果需要，0.3％的Triton X-100，可以被取代的0.05％吐温-20。交替结构延续PBS可以用作洗涤缓冲液。
- 使TNB阻断缓冲液含有：0.1M的Tris-HCl，pH值7.5; 0.15 M氯化钠; 0.5％封闭试剂（与试剂盒提供）。以完全溶解的封闭试剂，慢慢地以小的增量添加到它的缓冲器，同时搅拌。热火这个解决方案逐渐到55℃，不断搅拌。这可能需要30-60分钟。该解决方案将出现乳白色。使用前将室温。分装和储存在-20℃下长期使用。
2，准备的章节中
使用幻灯片与安装5微米厚的切片切从福尔马林固定组织。
- 治疗部分用二甲苯15分钟。
- 补充水分的部分如下：浸泡在96％乙醇2倍，每次5分钟;浸泡在80％乙醇进行5分钟;用清水洗净2倍，每次5分钟。
- 使蛋白酶K工作溶液稀释的蛋白酶K原液至50μg/ ml的PBS中。
- 添加蛋白酶ķ工作液部分。孵育15分钟，在23°C。溶液的体积和消化的时间可能需要根据部分和组织类型的大小进行调整。对于一个小的（小于5毫米的直径）第50微升蛋白酶溶液就足够了。对于一个平均大小（〜10毫米直径）部分，添加100微升的蛋白酶K溶液。对于非常大的部分中的溶液的体积可以按比例增加。在所有情况下，注意避免部分过量而导致完成信号的损失和破坏组织形态。这种情况经常发生，如果培养时间超过25分钟。
- 在蒸馏水中2个，每次5分钟洗净切片。制备含有有源探头的标签组合，同时部分是水。
3。VACC TOPO为基础的染色
- 通过结合以下准备有源探头解决方案：
水 - 11.75微升
1米的Tris-HCl，pH值7.4 - 1.25μ升
100皮摩尔的12碱基悬自杀的寡核苷酸 - 1微升
100皮摩尔适配器寡核苷酸 - 1微升
50皮摩尔VACC TOPO - 10微升 - 通过移液轻轻混匀。在室温下孵育（23℃）搅拌15分钟，以允许探测器激活。
- 采取切片洗罐和吸出剩余的水。然后应用在步骤3.1（元〜10×10mm的第25微升）编制的有源探头解决方案。
- 盖玻片部分孵育15分钟，在23°C。在水中浸滑轻轻地去除盖玻片。在3倍的水，每次5分钟洗净。
4，TSA信号增强
- 涵盖组织切片与TNB封闭液提前准备，并培养玻片在湿盒中30分钟，在室温（23℃）。
- 制备1:100稀释的链亲和素 - 辣根过氧化物酶结合物（SA-HRP）在TNB封闭缓冲液。吸TNB阻断缓冲液并应用SA-HRP解决方案。幻灯片孵育与SA-HRP 30分钟在室温下。使用适当的试剂量以弥补组织切片，每节一般在100微升。
- 洗幻灯片3倍5每个在室温下最小的TNT洗涤缓冲液（或PBS）。
- 准备1:50稀释的荧光酪胺股票在1x扩增稀释液的试剂盒。移液器的酪胺荧光工作液到每张幻灯片。使用足够的工作溶液中以完全覆盖组织部分，每部分通常为100微升。马上每个标签之前，请荧光酪胺的工作方案。该解决方案不能重复使用，所以标签后丢弃任何未使用的部分。
- 孵育载玻片在室温下放置3到10分钟。监视显微镜下荧光增加直到结构的第一提示可以看出。赶紧进行清洗步骤。
- 洗幻灯片3倍5每个在室温T MIN在TNT的洗涤缓冲液（或PBS）emperature搅拌。
- 加用DAPI和盖玻片抗褪色的解决方案。在荧光显微镜下观察。可视化的DAPI和FITC荧光使用带通滤波器组：
FITC激发D490/40，发射十分之五百二十; DAPI激发D360/40，发射二十○分之四百六，或类似的。
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Representative Results
该技术用于标记活性废物管理吞噬细胞的原理示于图1的示意图显示出，在三个步骤中检测所得。第一步骤包括探测激活（ 图1A）;在第二步骤中被激活的探测器被连接到在组织切片上（ 图1C）的特定DNA断裂;第三步骤包括荧光信号放大（ 图1D）。在一个更详细的解释，检测去如下：
1，探头激活 。之前，将连接反应VACC TOPO需要被共价连接到寡核苷酸探针的3'末端。在探头激活VACC TOPO重视发夹适配器双工和切割上链。的12个碱基长度的一部分，那么永久分离，留下VACC TOPO连接到发夹的3'端。该寡核苷酸与连接到它的3'末端的酶可以标记DNA酶II型断裂（ 图1B）。 12碱基悬和适配器寡都必需的，因为这种酶不会削减较短链8，因此，将无法连接到探头和激活它的3'末端。
2，探头结扎术 。生物素标记的发夹是由VACC TOPO连接到5'OH消化死亡细胞的核吞噬细胞产生的钝端DNA断裂。附加的探头通过使用荧光酪胺增强9可视化。
3，萤光信号是通过使用酪胺信号放大（TSA）系统9来实现。在此过程中链霉亲和辣根过氧化物酶结合物附着生物素化发夹和荧光tyramides在酒店附近激活绑定，创建强荧光的网站。
如图2 e_content“>应用技术实验中风。 图活跃的吞噬细胞永久性局灶性脑缺血后开始清除细胞死亡的大鼠脑48小时的2呈现荧光图像的细胞是由VACC TOPO标记探头所描述的探针可视化巨大的吞噬溶酶体10用DNase II游（绿色荧光），标志着吞噬细胞的主动吞噬和消化细胞尸 体7。同时共染色用DAPI标记的吞噬细胞和吞噬细胞内的吞噬细胞的染色质的VACC TOPO和DAPI信号的叠加使得易于识别和主动吞噬细胞的形态学分析，对于呈现更清晰的图像被显示的事件的图表补充。JPG“宽度=”500“/>
图1检测吞噬细胞清除的脑切片由ligatable探头：方法原理。
图2实验中风48小时缺血发作后：细胞死亡的吞噬细胞清除吞噬细胞清除的两个例子。 Ligatable VACC TOPO探针 - 绿色荧光。核染色的DAPI - 蓝色荧光。在图像中呈现的事件（右列）的示意图显示吞噬细胞和固缩的核吞噬额外的细胞核中消化的不同阶段。比例尺 - 15微米。
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Discussion
在这段视频中，我们证明，在组织切片格式，如何标记吞噬细胞活跃其中透明细胞死亡局灶性脑缺血。所提出的技术是专门标签只有那些废物管理细胞已吞噬并积极消化细胞尸体的第一种方法。这使得它相对于对吞噬细胞，其不具有这种能力的其它标记的现有方法是有利的。
该方法使用吞噬活性的一般和选择性DNA为基础的标记 - 双链，钝核吞噬消化过程中废物管理细胞吞噬溶酶体生产结束5'OH DNA断裂。只有主动吞噬细胞的这种特殊的标签允许强度和缺血性脑吞噬反应效率的准确评估。
该技术是强大的，并且效果很好，如果遵循所有步骤的描述。蛋白酶K digesti上一步是强大的和可重复的染色尤为重要。过量在此步骤会导致DNA的部分中的损失，并可能减少或什至消除信号。另一关键点是使用高活性的牛痘拓扑异构酶的酶制剂。该技术的局限性在于它与新鲜冰冻切片使用未优化。
该方法具有广泛的适用性细胞凋亡的研究，并可以扩展到其他组织和条件超越缺血性脑。用于在组织和器官与不同的参与废物管理信多种细胞类型组成的吞噬反应的可视化时，它是特别方便的。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项研究是由赠款R01NS062842从神经混乱国家学院和健康（VVD）的行程，国家机构和补助R21 NS064403从神经混乱国家学院和中风，国家通过ARRA卫生研究院（VVD）和R21支持生物医学成像和生物工程的EB006301研究所，美国国立卫生研究院（VVD）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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