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乳腺癌细胞中雌激素调控的microRNA分析

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DOI：

10.3791/51285

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2014年2月21日

 , 
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

本文内容

摘要

雌激素和微小RNA（microRNA）的分子信号转导在乳腺癌的发生和发展中至关重要。雌激素可激活作为转录因子的雌激素受体。许多转录因子能够调控微小RNA的表达，而受雌激素调控的微小RNA可通过多种高通量技术进行表达谱分析。

摘要

雌激素在乳腺发育和乳腺癌进展中发挥着至关重要的作用。它通过与雌激素受体（ERs）ERα和ERβ结合并激活它们来介导其功能。ERα在乳腺癌中常被上调，并驱动乳腺癌细胞的增殖。这些雌激素受体作为转录因子，调控基因表达。尽管ERα对蛋白编码基因的调控机制已较为明确，但其对非编码微小RNA（miRNA）的调控仍研究较少。miRNA在基因的转录后调控中起重要作用，可通过抑制翻译或降解mRNA来调节基因表达。miRNA可作为癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用 ，同时也是极具潜力的生物标志物。在现有的miRNA检测方法中，微阵列和实时定量聚合酶链式反应（qPCR）已被广泛用于检测和定量miRNA水平。为了鉴定在乳腺癌中受雌激素信号调控的miRNA，本研究利用µParaflo微流控微阵列和双标记探针低密度阵列，比较了ERα阳性乳腺癌细胞系在雌激素激活前后的miRNA表达水平。结果进一步通过特异性的qPCR检测进行验证，采用了基于氰基染料和基于双标记探针的两种化学方法。此外，还使用了时间点实验以识别随时间变化的调控模式。本研究所采用的miRNA检测方法的优势在于，即使样本量有限，也能快速筛选大量样本中成熟miRNA的调控情况。实验设计包括明确的细胞培养与雌激素处理条件、生物学重复与技术重复，以及先进行大规模筛选再通过不同技术进行深入验证的流程，从而确保了miRNA调控的可靠检测 ，并排除了假阳性结果及其他技术假象。然而，该方法无法检测突变或未知的miRNA，也无法识别初级转录本和前体转录本水平的调控。本文所介绍的方法代表了对雌激素介导的miRNA调控机制的系统性研究。

引言

雌激素是一种在乳腺发育过程中起重要作用的激素。雌激素在乳腺癌的发生、维持、风险及治疗中也发挥着重要作用1。雌激素通过与雌激素受体（ERs）结合来发挥其功能，ERs属于转录因子，可调控特定的靶基因。在两种受体亚型中，ERα对于雌激素依赖性乳腺癌细胞的增殖至关重要。大多数乳腺癌为ERα阳性，其生长依赖于雌激素。因此，雌激素信号通路及ERα已成为激素受体阳性乳腺癌治疗的重要靶点。深入了解ERα的作用机制，对于改善治疗效果、克服治疗耐药性以及理解乳腺癌的发生过程具有重要意义。

miRNA 由于在转录后基因调控中具有重要影响，因此在细胞功能中发挥关键作用。miRNA 是长度为 19–24 个核苷酸的短单链非编码 RNA，首先由 RNA 聚合酶 II 转录生成初级 miRNA 转录本（pri-miRNA）。pri-miRNA 在细胞核内被 Drosha 加工形成具有短发夹结构的前体 miRNA（pre-miRNA） ，随后在细胞质中由 Dicer 进一步加工并解链为单链，形成成熟的 miRNA。单链成熟 miRNA 被转移至 Argonaute 蛋白，形成 RISC 复合物。随后，miRNA 可与靶标 mRNA 的 3'-非翻译区（3'-UTR）发生杂交，从而通过阻断翻译或降解靶标 mRNA 实现转录后调控2。

由于雌激素和miRNA在肿瘤进展中均发挥重要作用，鉴定与正常或异常雌激素信号通路相关的miRNA，对于加深我们对乳腺癌发生机制的理解并改进治疗策略具有重要意义。尽管目前对ERα如何调控蛋白编码基因已有较深入的认识，但关于非编码RNA调控的广度和具体细节仍有待系统研究。早期旨在阐明ERα在乳腺癌细胞系中调控miRNA的研究得出了相互矛盾的结果，即使针对同一细胞系进行分析时也存在不一致3-6。这可能是由于实验处理方式不同、生物学变异、技术手段差异，以及miRNA本身尺寸较小而难以准确分析所致。本文介绍了一种可有效控制变异和方法学干扰的实验方案。

为确定哪些miRNA受雌激素调控，首先需要对一个明确的ERα活性乳腺癌模型进行表达谱分析。已从人类ERα阳性乳腺癌肿瘤中建立了多个细胞系，这些细胞系与大多数临床乳腺癌相似，均依赖于雌激素。其中T47D和MCF7两个细胞系的分子特征，包括表达ERα及其下游靶标孕激素受体（PR）、不表达膜受体HER2，以及表达雌激素响应基因和管腔上皮分化相关基因，使其适合作为乳腺肿瘤管腔亚型的研究模型7-1017β-雌二醇（E2）是雌激素的主要形式，已有多个研究对ERα转录激活的最佳浓度和时间点进行了表征。本方案采用10 nM E2处理24小时，并以T47D和MCF7细胞作为乳腺癌细胞中ERα活性的研究模型1此外，可以在特定时间区间内对miRNA的时间依赖性调控进行专门分析。 例如 1-72 小时

其次，miRNA 的分析面临独特的挑战，部分原因在于其序列较短。在使用常规的硫氰酸胍-苯酚/氯仿/异丙醇 RNA 沉淀法或标准柱纯化方法进行总 RNA 提取时，miRNA 很难有效保留。必须采取特殊措施以保留或富集小片段 RNA。通过增加异丙醇的体积、在离心前降低温度（-80 °C）以及省略 70% 乙醇洗涤步骤，可在沉淀过程中提高 miRNA 的回收率。或者，也可使用专用于高质量、稳定提取含 miRNA 总 RNA 的特定柱子和缓冲液系统。此外，miRNA 本身较短的长度也给分析带来困难。在全基因组范围的 miRNA 筛查中，有三种常用的 miRNA 谱型分析技术可供选择：微阵列（microarrays）、qPCR 和高通量测序（next-generation sequencing）。每种技术可在多种不同平台上实施， 且需要不同的样本制备方法，各自存在引入人为假象的不同风险。在 miRNA 微阵列中，载玻片上点样或合成数千种寡核苷酸，这些寡核苷酸作为探针，每种探针设计用于与特定的 miRNA 序列杂交。本研究所采用的微阵列样本制备方法，首先对 miRNA 进行富集，然后在 miRNA 上引入 Cy5 和 Cy3 标记。微阵列技术可同时观察大量基因的相对表达水平，速度快，适用于大批量样本的筛查，但仅能检测微阵列上已有的序列，e.g. 无法发现未知或突变的 miRNA。本方案中所采用的微阵列分析还要求每样本分析需使用相对较多的总 RNA，约 5 µg。低密度 qPCR miRNA 谱型分析所需材料较少（700 ng/样本及重复），可实现 miRNA 的检测与定量。转录本水平可被测定，其定量结果可以是绝对量或相对量。qPCR 分析首先需将 miRNA 逆转录为 cDNA，此处使用针对每个特定 miRNA 设计的环状引物，确保仅对成熟 miRNA 进行分析。由此生成较长的模板，可利用 miRNA 特异性的正向引物和与环状序列互补的通用反向引物进行扩增，并可包含双标记探针以提高特异性。qPCR 可在低密度格式下使用，通过一个或多个 384 孔板，在各孔中使用独立的引物对，实现数百种 miRNA 的并行检测11。而高通量测序是这些技术中唯一能够发现新型、突变或编辑型 miRNA 的方法，因为该技术可对样本中所有 RNA 进行测序11。然而，该技术需要多个步骤来富集小 RNA，并通过多次连接接头和纯化步骤构建小 RNA 文库 ，从而增加了样本间相对表达水平被人为改变的风险。此外，该技术还需要大量的生物信息学分析。鉴于 miRNA 谱型分析的多种技术选择，最适宜的技术取决于具体应用需求。当样本材料相对充足，且研究目标为已知 miRNA 差异表达分析时，微阵列最为适用；当样本量有限且需要高灵敏度检测低表达 miRNA 时，低密度 qPCR 阵列最为合适；当需要分析未知 miRNA、突变型 miRNA 或不同异构体时，测序技术最为适宜。

在研究乳腺癌中受雌激素调控的miRNA时，采用了两种模型细胞系T47D和MCF7，这些细胞系可提供大量易于获取的RNA。每种细胞系均在不同传代次数的重复培养中进行分析，并对每种处理设置技术重复，从而能够稳健地检测出可重复的、ERα调控的miRNA。通过miRNA微阵列和双标记探针低密度阵列（DLP-LDA）比较miRNA的相对表达水平，并利用特异性qPCR结合氰化物荧光染料和DLP化学方法对结果进行验证。随后通过时间序列分析进一步研究miRNA的调控动态，以明确其随时间变化的精确调控模式，有助于区分随机或昼夜节律性波动与雌激素诱导的调控，并区分直接效应与间接效应。通过与ERα染色质结合研究的生物信息学比对，可进一步辅助区分直接与间接调控效应。该检测方法实现了对miRNA调控的可靠评估，结果表明，在24小时E2处理后，蛋白编码转录本已被显著调控，而成熟miRNA则未受影响1。然而，miRNA可能在更晚的时间点受到调控，这一点已在部分miRNA的时间序列分析中得到证实1。相关细节仍需进一步探索，本文所提供的实验方案为研究乳腺癌细胞系中成熟miRNA的激素调控提供了一种可靠的方法。

方案

1. 细胞培养基的制备

  1. 对于 T47D 细胞系培养基：
    1. 在已灭菌的 1 L 瓶中，将 500 ml 改良型达尔伯克氏必需培养基（DMEM）与 500 ml F12 [DMEM/F12 (1:1)] 混合。
    2. 加入 50 ml 胎牛血清（终浓度为 5% FBS），然后加入 10 ml 青霉素-链霉素溶液（终浓度为 1% PEST）。充分混匀。
    3. 于 4 °C 保存。
  2. 对于 MCF7 细胞系培养基：
    1. 将 500 ml DMEM 与 25 ml 胎牛血清（终浓度为 5% FBS）混合，然后加入 5 ml 青霉素-链霉素溶液（终浓度为 1% PEST）。
    2. 于 4 °C 保存。
    3. 对于低血清培养基：
      1. 对于 T47D：在已灭菌的 1 L 瓶中，将 500 ml 无酚红 DMEM 与 500 ml F12 (1:1) 混合，加入 50 ml 经葡聚糖-活性炭处理的胎牛血清（DCC-FBS，终浓度为 5% DCC-FBS）。另准备一瓶加入 5 ml DCC-FBS（终浓度为 0.5% DCC-FBS）。然后向每瓶中加入 10 ml 青霉素-链霉素溶液（终浓度为 1% PEST）。充分混匀后，于 4 °C 保存。
      2. 对于 MCF7：将 500 ml 无酚红 DMEM 与 5 ml 100倍 L-谷氨酰胺（终浓度为 200 mM）混合。加入 25 ml DCC-FBS（终浓度为 5% DCC-FBS）。另准备一瓶加入 2.5 ml DCC-FBS（终浓度为 0.5% DCC-FBS）。然后向每瓶中加入 5 ml 青霉素-链霉素溶液（终浓度为 1% PEST）。充分混匀后，于 4 °C 保存。
    4. 对于磷酸盐缓冲液（PBS）溶液：
      1. 用超纯水或蒸馏水填充一个 1 L 的已灭菌玻璃瓶。
      2. 加入一片 PBS 片剂，间歇摇动直至片剂完全溶解。
      3. 对 PBS 溶液进行高压灭菌，并于室温保存。
    5. 配体储备液的制备：
      1. 在无菌 1.5 ml 微离心管中，将 2.72 mg 17β-雌二醇（E2）溶于 100 µl 乙醇或 DMSO 中，配制成 100 mM 储备液，轻轻混匀。短暂离心后，用相同溶剂进行连续稀释（1:10），得到 10 mM、1 mM 和 0.1 mM 的储备液。所有 E2 储备液均于 -20 °C 保存。
      2. 在无菌 1.5 ml 微离心管中，将 6.07 mg ICI 182,780 溶于 100 µl 乙醇或 DMSO 中，配制成 100 mM 储备液，轻轻混匀。短暂离心后，用相同溶剂进行连续稀释（1:10），得到 10 mM、1 mM 和 0.1 mM 的储备液。所有 ICI 储备液均于 -20 °C 保存。
      3. 对照溶剂为乙醇或 DMSO。取 0.5–1 ml 纯乙醇或 DMSO 加入无菌 1.5 ml 微离心管中，于 -20 °C 保存。

2. 细胞培养与处理

每种处理均需在双孔或三孔培养板中进行，以设置技术重复。使用同一细胞系的不同传代细胞重复细胞培养及处理过程，作为该细胞系的生物学重复。还需在不同细胞系中重复实验，以在多个细胞系中验证研究结果。所有细胞培养操作均须在超净工作台内的无菌条件下进行。

  1. 细胞培养启动
    1. 将培养基在无菌的温水浴中加热至 37 °C。
    2. 解冻一管冷冻保存的 T47D 或 MCF7 细胞。
    3. 用70%乙醇擦拭小瓶和培养基瓶的外表面，然后将小瓶和瓶子放入无菌超净工作台中。
    4. 在超净台中，相应标记一个无菌的T-75培养瓶。
    5. 使用无菌血清移液管向烧瓶中加入12–15 ml适当的培养基（确保培养基完全覆盖表面）。
    6. 将细胞从冻存管转移至培养瓶中，轻轻混匀。
    7. 将培养瓶置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中2.
  2. 处理前细胞的准备
    1. 从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞融合度至少达到80%，以确保实验有足够的细胞数量。将培养瓶转移至无菌操作台。
    2. 使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管从培养瓶中移除培养基。用 PBS 轻柔地清洗贴壁细胞两次。
    3. 向培养瓶中加入1 ml温热的胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶放入培养箱中孵育2分钟，以使细胞从培养瓶壁脱落。
    4. 向培养瓶中加入约 3-4 ml 适宜的预温培养基，使用 5 ml 血清移液管吹打悬浮细胞。吹打时，用移液管吸取细胞悬液，并将移液管尖端抵住培养瓶底部释放液体，以增加压力，使细胞充分分散为单细胞悬液。
    5. 计数细胞， 例如 根据制造商说明书，使用细胞计数器进行计数。
    6. 标记所需数量的100 mm培养皿，每皿加入约10 ml培养基。每皿接种约2.0 × 10⁶个细胞。6 细胞/孔。通过轻轻晃动培养板使细胞分布均匀。
    7. 孵育细胞24-48小时，直至细胞汇合度达到约80%。
    8. 当细胞汇合度达到80%时，用PBS洗涤细胞两次，加入含5% DCC-FBS的适当培养基，然后将细胞在培养箱中孵育24小时。
    9. 24小时后，用PBS洗涤细胞两次，加入适量的含0.5% DCC-FBS的培养基，再继续培养48小时。
  3. 细胞处理
    1. 48小时后，用PBS洗涤细胞两次，每次应尽可能彻底移除PBS。
    2. 在15 ml锥形管中，加入10 ml适当的含0.5% DCC-FBS培养基。然后加入1 µl的0.1 mM配体储备液（E2或ICI），使终浓度为10 nM。同时加入1 µl 加入溶剂至10 ml 在另一试管中为对照实验准备培养基。
    3. 轻轻混匀管中内容物，并加入到培养板的细胞中。每块板应只加入一种配体。
    4. 孵育细胞至选定的时间点（0–72 小时）。

3. RNA 提取与质量控制

  1. RNA 提取
    1. 在所需时间的处理结束后，用 PBS 洗涤细胞两次，然后向培养板中的细胞加入约 1–2 ml 异硫氰酸胍-苯酚溶液。注意：异硫氰酸胍-苯酚溶液接触皮肤或眼睛、吸入或吞咽后具有毒性。应穿戴适当的防护服、手套 以及眼/面部防护装备，并在通风橱中操作。
    2. 确保细胞体积不超过异硫氰酸胍-苯酚溶液体积的 10%，且细胞完全被溶液覆盖，静置 1 分钟。随后用橡胶刮刀刮取细胞，并转移至微量离心管中。细胞可在该溶液中于 -80 °C 保存数周。
    3. 采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取并纯化各处理组的总 RNA，随后通过离心柱纯化及 DNase I DNA 降解法处理动物细胞 RNA。
    4. 提取后，用 60 µl 无 RNase 水洗脱 RNA。取 1–2 µl RNA 进行定量分析，并将 RNA 储存于 -80 °C。
    5. 使用 1 µl RNA 和分光光度计测定 RNA 浓度。每次测量前应先进行空白校正。每次测量后必须彻底擦拭分光光度计样品台。浓度通常以 ng/µl 表示。保存显示 RNA 浓度的结果。
  2. RNA 质量控制
    1. 取各样品约 100 ng RNA，置于微量离心管中。
    2. 使用生物分析仪检测 RNA 完整性。通常一次可在生物分析仪上运行 12 个样品，运行时间约为 25 分钟。
    3. 将结果与 RNA 标准分子量标记物比较，以确认 RNA 质量适用于实验。保存并打印结果。

4. 治疗效果的验证：蛋白编码基因的qPCR检测

  1. cDNA合成
    1. 取每个样本的500 ng或1 µg总RNA，置于1.5 ml微量离心管中。用无RNase的水将每管体积补至10 µl。
    2. 加入2 µl 50 µM随机六聚体引物，将离心管置于70 °C加热10分钟。
    3. 将试管转移至冰上放置5分钟。
    4. 每个样本中加入 4 µl 的 5x 第一链缓冲液，0.1 M DTT 1 µl，10 mM dNTPs 1 µl，Superscript III 0.5 µl，以及无RNase水1.5 µl。
    5. 将试管置于25 °C的加热块或水浴中10分钟。
    6. 将试管转移至46 °C的加热块中孵育1小时。随后，将试管转移至70 °C的加热块中孵育15分钟以终止反应。
    7. 使用无RNase的水将cDNA稀释至5 ng/µl的储存液（根据总RNA投入量计算），并于-20 °C保存。
  2. qPCR
    1. 获取目的基因和参考基因的引物。可使用NCBI Primer-BLAST程序中的引物设计工具轻松设计引物。12通常为每个目的基因设计一条正向引物和一条反向引物。引物长度应为18-22 bp，熔解温度为52-58 °C，GC含量为40-60%，扩增产物长度为100-180 bp。
    2. 每个qPCR反应孔中加入10 ng cDNA（来自步骤4.1.7的储存浓度，2 µl）、目的基因的上下游引物各1 pmol（来自步骤4.2.1）以及5 µl的2x 花青染料PCR预混液。每个孔的反应总体积应为10 µl。
    3. 确保每份样本的每个基因均设有三个复孔（技术重复）。可使用96孔反应板。
    4. 在qRT-PCR系统软件中，指定报告基因和目标基因，输入反应体积，选择相对阈值循环（ΔΔCt）法，并定义样品孔位。
    5. 确保对所有氰基染料运行进行熔解曲线分析，以确认扩增出单一特异性片段。使用运行的默认设置来运行反应板。
    6. 运行结束后保存结果，并导出数据（特别是将CT值导出至Microsoft Excel）。
  3. 使用 ΔΔCT 公式进行 qPCR 数据分析
    相对mRNA表达水平的变化可通过以下步骤在Excel中以相对于对照组的倍数变化（fold change）来计算每个样本的结果：
    1. 上述 qPCR 导出的所有结果均应包含 Ct 值。使用以下公式计算 ΔCT 值：
      • ΔCT = CT（目的基因）- CT（参照基因）
      每个样本均应进行此操作。目标基因为目的基因或miRNA。
    2. 接下来，计算每个样本的总标准差（SD）。首先计算内参基因的SD，然后计算目的基因的SD（可在Excel中使用CT值的STDEV函数完成）。随后使用以下公式计算每个样本的总SD：
      • 总标准差 = (SD²(目标) + SD²(参考))¹/²
    3. 通过以下方法计算每个样本在某个基因（靶基因）内的 ΔΔCT：
      • ΔΔCT = ΔΔCT（处理/测试样本） - ΔΔCT（对照/校准样本）
      校准样品为未经处理的样品。
    4. 最后，使用以下公式计算每个样本的倍数变化（FC）值：
      • FC = 2-ΔΔCT
      每个样本的倍数变化值表示该基因/miRNA的相对表达量，已相对于参照基因和对照样本进行标准化。
    5. 学生t检验可采用双尾分布和双样本异方差参数进行统计分析：（P<0.001（***），P<0.01（**），以及 P<0.05（*）)。此分析可在 Excel 中完成。在进行 miRNA 表达谱分析之前，需确认处理已导致已知靶基因的调控。

5. miRNA 表达谱分析

  1. miRNA 芯片
    1. 取经溶剂或配体处理的细胞中分离出的 5 µg RNA，放入微量离心管中，将管内体积调整至 20 µl。每次比较应设置重复样本两到三次。
    2. 使用上述 RNA 样本进行 miRNA 芯片检测。miRNA 芯片表达谱应采用基于 µParaflo 微流体生物芯片技术的人类 miRNA 双色样本芯片（Sanger miRBase Release 14.0）13 进行测定。
    3. 结果应显示差异表达的 miRNA。当 p<0.05 时，认为 miRNA 表达具有显著性；p 值 <0.10 也可考虑用于后续通过 qPCR 进行验证性分析。保存该 miRNA 列表，用于后续 qPCR 验证。
  2. miRNA 表达谱分析：DLP-LDA
    1. 每个样本应进行两到三次重复分析。取经溶剂或配体处理的细胞中的 700 ng 总 RNA，放入微量离心管中，将管内体积调整至 3 µl。
    2. 使用双标记探针 miRNA 检测法及 10x RT 引物进行 cDNA 合成。每反应总体积应为 7.5 µl。
    3. 将反应管放入 PCR 系统热循环仪中，按照双标记探针 miRNA 检测法推荐的参数设置并启动运行。此过程将生成 cDNA。注意：cDNA 可在 -20 °C 下保存至少 1 周。
    4. 在 RT 反应进行的同时，取出 DLP-LDA 板，使其恢复至室温。每块阵列板包含 384 个孔，每个孔含有特异的 miRNA 引物和对照引物。
    5. 取 6 µl cDNA（来自步骤 5.2.3），放入 1.5 ml 微量离心管中，加入 450 µl 双标记探针 2x 通用 PCR 主混合液，并加入 444 µl 无 RNase 水。
    6. 轻轻倒置管约六次以混匀内容物，短暂离心。
    7. 当 DLP-LDA 板达到室温后，向板上八个“加样口”（Fill port）各加入 100 µl 混合液，然后对阵列板进行离心。
    8. 打开 qRT-PCR 系统，确认所用模块适用于 384 孔板。使用 SDS 软件设置运行程序，选择相对定量（Ct）模式，选择孔数和阵列类型，并输入样本描述以定义各孔。
    9. 使用默认的热循环条件运行阵列。运行结束后，保存结果并导出至 Microsoft Excel，用于后续通过 ΔΔCT 公式（步骤 4.3）进行分析。

6. 使用独立的 qPCR 分析验证 miRNA 调控

  1. 花青染料qPCR分析
    1. 设计所需miRNA分析的引物。成熟miRNA的序列（即正向引物）可从mirbase.org获取14。将所有“U”转换为“T”。
    2. 制备cDNA：取1 µg总RNA，置于1.5 ml离心管中。按照miRNA第一链cDNA合成与qRT-PCR试剂盒说明书进行多聚A尾修饰及miRNA第一链cDNA合成。将所得cDNA稀释10倍（1:10），并于-20 °C保存。
    3. 准备一个96孔反应板。
    4. 对于每个miRNA的qPCR反应孔，加入16 ng多聚A修饰的cDNA（来自步骤6.1.2）、每种特异性正向引物（来自步骤6.1.1）和通用引物（来自步骤6.1.2所用试剂盒）各2 pmol，以及5 µl 2x qPCR预混液。最终反应体积为10 µl/孔。
    5. 确保每种miRNA的每个样本设置三个技术重复孔。同时，需包含内参基因（通常为U6 snRNA）。
    6. 在qRT-PCR系统软件中，设定报告荧光基团和目标基因，输入反应体积，选择相对阈值循环法（ΔΔCT法），并定义样本孔位。
    7. 使用仪器默认程序运行反应板。所有花青染料反应均需进行熔解曲线分析。每条熔解曲线应仅显示一个特异性峰，以确认扩增产物为单一特异性片段。若出现多个峰或无明显单一峰，则表明引物特异性不足，数据不可用。
    8. 运行结束后保存结果，并导出数据（特别是CT值至MS Excel）。
  2. 双标记探针qPCR分析
    1. 取每种总RNA各10 ng，分别溶于5 µl体积中，置于0.2 ml微量离心管中。
    2. 根据双标记探针miRNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录（RT）反应15。每次反应总体积应为15 µl。注意：双标记探针RT反应中，每种miRNA均有其特异性引物。
    3. 将反应管放入PCR仪热循环模块中，按照步骤6.2.2所述说明书设置参数并开始运行。反应时间约为70–80分钟。
    4. 逆转录反应完成后，将cDNA样本按1:5比例稀释，并于-20 °C避光保存。
    5. 准备一个96孔反应板。
    6. 对于每个miRNA的qPCR反应孔，加入以下组分：10 µl双标记探针2x 通用PCR预混液（与步骤5.2.5所用试剂相同）、7.67 µl无RNase水、1 µl 20×实时荧光定量检测引物（针对每种miRNA特异性设计）以及1.33 µl来自步骤6.2.4的cDNA。最终反应体积为20 µl。轻轻混匀后短暂离心。
    7. 确保每种miRNA的每个样本设置三个技术重复孔。同时，需包含内参基因（通常为U6 snRNA）。
    8. 在qRT-PCR系统软件中，为每个目标miRNA设定报告荧光基团（FAM）和淬灭基团（NFQ-MGB），输入反应体积，选择相对阈值循环法（ΔΔCt法），并定义样本孔位。
    9. 根据双标记探针miRNA检测试剂盒说明书设置qPCR运行参数，然后启动反应。运行结束后保存结果，并导出数据（特别是CT值至MS Excel）。

结果

该方法的概述见图1，各种样品制备方法及每种技术所需的核酸修饰比较见图2。

处理激素前细胞的状态和环境对于确定激素的实际效应至关重要16。某些培养基和血清中含有生长因子，可能影响实验结果，因此需对细胞进行无血清饥饿处理，以确保将所有激素效应降至最低。因此，在使用E2处理时，可以更明确地确认所观察到的效应与E2相关。一个重要的因素是细胞的汇合度，它会影响细胞间的接触以及细胞间信号传导和增殖等行为。实验中允许细胞生长至80%汇合（图3A），并充分贴壁，以保证细胞正常生长，并避免在后续的洗涤和换液过程中发生细胞脱落。

RNA 提取和储存过程中的条件对 RNA 的质量及后续分析至关重要。已知细胞数量、提取方法以及 miRNA 的 GC 含量均会影响 mRNA 和 miRNA 的得率与质量17。因此，必须在无 RNase 的条件下进行 RNA 提取，并在开展实验前检测 RNA 质量。提取后，通过 RNA 定量可获得总 RNA（包含 mRNA 和 miRNA）的浓度信息，从而评估提取得率。定量结果还提供图形化数据，如图 3B所示，可用于判断样品纯度（通常表现为一个峰，上图）。若 RNA 得率过低，则在 260 nm 处无特异性吸收峰（图 3B，下图）。为判断 RNA 是否具有高质量，需检测 RNA 完整性。RNA 完整性数值（RIN）在 9–10 之间表明 RNA 未发生降解，质量最佳。此外，应观察 RNA 的图谱，其中 18S 和 28S rRNA 应出现如图 4（中图）所示的峰。与分子量标记物（图 4，上图）比较可确定峰的大小。降解的 RNA 图谱中峰形模糊，且 18S 和 28S rRNA 的相对含量降低（图 4，下图）。小 RNA 组分的完整性可进一步通过 Agilent Small RNA Kit 进行确认。建议在进行 miRNA 筛选前，先在特定实验条件下验证处理后的雌激素反应。可使用 cDNA 模板对已知的雌激素受体（ER）靶基因（如 pS2 或 SPINK418）进行 qPCR 检测。这类基因通常在 E2 处理后 1–24 小时内表达上调。在确认 RNA 质量和雌激素反应均符合要求后，方可开展后续实验。

微阵列技术目前仍被广泛用于细胞中miRNA表达的大规模筛选。例如，此前使用的miRNA微阵列包含894种成熟miRNA和50个唯一探针的对照，每个探针设置四个重复1。杂交实验采用双重复并进行荧光染料交换操作。miRNA微阵列的结果通常以热图形式图形化展示。图5A显示了一个热图，呈现了载体处理组与E2处理组样本之间miRNA微阵列的比较数据。红色表示该miRNA在E2处理样本中表达上调（表达水平较高），绿色则表示miRNA表达下调（表达水平较低）。miRNA的筛选通常依据其表达差异的显著性，一般以p值小于0.05作为具有统计学显著性的标准。对于显示为差异表达的miRNA，应进一步通过qPCR进行验证，以排除假阳性结果。

另一方面，DLP-LDA 芯片采用基于 qPCR 的方法，在 384 孔板中筛选受调控的 miRNA。通常提供两张 384 孔板（芯片），分别为 A 池和 B 池。A 池通常包含比 B 池更充分表征且表达水平更高的 miRNA。每个 miRNA 的相对表达水平通过 qPCR 测定，每孔分析一个 miRNA（图 5B）。Ct 值越高，表明 miRNA 表达水平越低。与 miRNA 微阵列类似，DLP-LDA 获得的结果需要进一步验证以确保准确性。

可使用 qPCR 进行验证。本文描述了两种 qPCR 检测方法，以避免方法学偏差，并实现对 miRNA 调控的充分确认与深入分析。基于氰染料（Cyanine dye）的检测化学原理与 DLP-LDA 芯片所依赖的 DLP 技术不同，适用于确认性实验。该方法特异性相对较低，因其可检测所有扩增的双链 DNA，但可通过熔解曲线分析评估样本的均一性。图6A（左图）展示了某 miRNA 的熔解曲线分析结果，可见一个清晰、单一的峰。若引物非特异性，或形成大量引物二聚体，则会出现多个峰（图6A，右图）。相比之下，DLP miRNA 检测方法特异性更高，仅检测目标 miRNA 的扩增产物。每个目标 miRNA 的扩增曲线均可观察，如 图6B 所示。然而，该化学体系无法通过熔解曲线分析来判断是否存在多种扩增产物，且 Cyanine 染料 qPCR 成本较低。Cyanine 染料与 DLP qPCR 检测有时会产生略有差异的结果。对于这两种 qPCR 检测方法，均需通过与参照基因比较，以确定两个样本间基因的相对表达水平。参照基因（亦称看家基因）应为表达稳定、且表达水平与目标基因相近的基因。在这些乳腺癌细胞系中，一个合适的参照基因示例是 ARHGDIA，即 Rho GDP 解离抑制因子，参与 Rho 蛋白的 GDP/GTP 交换反应。如 图6C（上图）所示，ARHGDIA 的 mRNA 水平在溶剂对照组与配体处理组之间无变化。18S rRNA 也可作为参照，但因其表达量过高，需对 cDNA 原液进行 1:500 稀释，因此适用性较差。在 miRNA 分析中，目前尚无公认的标准化参照基因，但 U6 snRNA 是被广泛接受用于 miRNA 分析的参照基因。U6 snRNA 是一种长约 110 个核苷酸的非编码小核 RNA，参与细胞核内 pre-mRNA 的剪接19。如 图6C（下图）所示，U6 在所有样本中的表达水平基本一致，因而可用于计算 miRNA 表达水平的差异。经 U6 参照基因标准化后，溶剂对照组与 E2 处理组细胞间 miRNA qPCR 检测结果的图示如 图6D 所示。该图显示某一 miRNA 在 E2 处理 24 小时后未表现出调控变化，但其基因组附近存在雌激素受体（ER）染色质结合位点，且时间序列分析发现其在处理 72 小时后出现显著调控。

细胞培养示意图；通过微阵列和qPCR进行RNA提取及miRNA筛选；基因表达分析。
图 1. 检测乳腺癌细胞中miRNA激素调控所采用方法的总体流程。 该流程始于细胞培养与处理，继而进行大规模miRNA表达谱分析以鉴定可能差异表达的miRNA，最终通过qRT-PCR对微阵列结果进行验证。

RNA分析方法：微阵列设置、DLP和氰化物染料过程；转录、cDNA合成。
图2. 各种miRNA检测技术的样品制备与核酸操作方法比较。（A）采用µParaflo技术的miRNA微阵列，包括富集、poly-A加尾和连接标记步骤。（B）DLP技术的样品制备与检测方法包含一个环状cDNA合成引物，在变性步骤后延伸，产生一个较长的片段，其中包含反向引物和探针序列。（C）氰化物染料技术的样品制备与检测方法包括poly-A加尾，以及使用带有通用5'序列的oligo-dT引物进行cDNA合成。

显微镜图像中的细胞形态，UV-Vis 吸收光谱图显示蛋白质浓度
图 3. 细胞培养与 RNA 提取。（A） 培养的细胞用于展示在添加配体处理前所需的 80% 汇合度。（B） RNA 提取后浓度与纯度的图示。每个峰代表一个样本，成功的提取过程可获得高纯度 RNA（上图）。提取效果差的 RNA 在 260 nm 处无明显吸收峰（下图）。

显示随时间变化的梯形图、完整和降解RNA峰的RNA分析电泳图。
图4. RNA质量控制。 RNA完整性分析结果，图示分别为梯形图（上）、高质量RNA（中）和降解RNA样本（下）的图形表示。

热图与qPCR图表，miRNA表达分析，实验结果，基因表达研究。
图 5. miRNA表达谱结果示意图。（A） 差异表达miRNA的miRNA微阵列结果热图表示。如图中红色所示，miR-A、B、C在E2处理样本中表达上调；而miR-D、E、F、G在E2处理样本中表达下调，如绿色所示。（B） 来自DLP-LDA结果的每种miRNA扩增曲线。所检测的miRNA通过Rn值的升高显示扩增情况。

DNA扩增温度与循环次数关系图；表达量柱状图；qPCR分析结果。
图6. miRNA调控的qPCR分析。 (A) 使用氰基染料检测法对一种miRNA进行熔解曲线分析，显示所测试的所有样本均一性良好（左图）以及多个片段的扩增情况（右图）。(B) 每个样本中一种miRNA的扩增曲线图。该结果可来自氰基染料或DLP检测方法。(C) 适用于mRNA分析的参考基因ARHGDIA（上图）和miRNA分析的参考基因snRNA U6（下图）的柱状图表示，显示各样本间无显著差异表达。(D) miRNA qPCR结果，用于展示miR-135a在时间进程中的相对表达水平比较。图6D 经Elsevier许可转载自Katchy et al.1。数值通常为独立实验（生物学重复）的平均值±标准差（SD）。采用Student t检验以显示显著性差异：* p<0.05。

讨论

确定激素在乳腺癌细胞中对miRNA调控的机制，可为理解该疾病提供平台，并为乳腺癌的潜在治疗提供思路。培养这些细胞以提供激素作用的最佳条件至关重要。本文描述了一种实验方案，该方案确保在处理前排除了目标激素（雌激素），并在处理过程中使用了适当剂量的E2和合适的处理时间。通过逐步降低血清浓度并使用经二乙基氨基乙基（DCC）处理的胎牛血清（DCC-FBS）——即去除了大部分激素、细胞因子和生长因子的FBS——将其他激素和生长因子的影响降至最低。此外，采用无酚红培养基进一步减少非激素性影响，因为已有报道指出酚红具有雌激素样活性，可影响细胞系中的某些功能20,21。细胞暴露于激素的时间极为重要。对于与雌激素相关的基因调控，先前研究表明，24小时的暴露时间可在乳腺癌细胞中引发直接靶基因的显著反应1,18。由于miRNA与mRNA一样由RNA聚合酶II转录，因此这一时间点也适合检测miRNA的直接调控作用。目前尚待明确的是，这些miRNA是否以及如何影响乳腺癌细胞中已知雌激素受体（ER）靶基因的表达。

miRNA 表达谱分析具有挑战性，原因在于 miRNA 相对较小，成熟的 miRNA 序列也可能存在于 pri-miRNA 和 pre-miRNA 中，且其 GC 含量存在异质性22。为克服这一难题，已采用多种检测技术和化学方法，其中包括微阵列和 qPCR 分析的不同策略（图 2）。尽管微阵列技术已被广泛用于全基因组分析，但它可能产生假阴性结果，且不同平台之间在化学原理和打印技术等方面存在差异23。此外，在分析数量相对较少的 miRNA 基因时（与数万个 mRNA 转录本相比，miRNA 基因仅有数千个），标准化过程也面临挑战。相比之下，qPCR 更为灵敏，适用于检测较少数量的基因。然而，当在大型 384 孔板上进行检测且每块板仅设置一个技术重复时，每个样本需分析多块板，导致成本升高。此外，在我们实验中，与微阵列相比，DLP-LDA 分析产生的假阴性结果明显更多。鉴于成熟 miRNA 序列同时存在于 pri-miRNA 和 pre-miRNA 序列中，使用 PCR 技术区分这些转录本具有重要意义24。DLP 探针也可用于 pre-miRNA 检测，同时可利用氰染料 qPCR 技术设计特异性引物，以排除不同的成熟体或前体变体。

qPCR 是验证表达谱分析中差异表达的金标准。然而，qPCR 的有效性依赖于多个参数，包括 RNA 提取、RNA 完整性（质量）、cDNA 合成、引物设计、检测方法（化学体系）以及用于数据归一化的参考基因1,22,25。由于 miRNA 序列较短，可用于引物设计的空间非常有限，且该短序列中只能容纳一条引物，因此 miRNA 分析中的引物设计选择极为有限。因此，需要采用如图2所示的替代性操作方法。技术重复对于验证扩增方法及所用流程的稳健性至关重要。生物学重复则用于反映普遍存在的生物学变异，包括对配体处理的不同响应情况，并证明在细胞中观察到的效应具有可重复性。根据我们的经验，不同细胞培养物之间的 miRNA 表达可能存在差异。通常这些差异小于 1.3 倍，通过数值的平均值及其相应的标准差（SD）可识别出自然变异与技术变异。这种变异可能源于多种因素，包括细胞密度以及细胞功能随传代次数而发生变化等。为了鉴定由配体处理引起的具有统计学意义的表达变化，通常公认的标准是 p 值小于 0.05。本文采用双尾分布和双样本异方差参数对学生 t 检验对生物学重复和技术重复进行分析。其他 t 检验参数也存在，具体选择取决于实验设计26。

本文提供了评估乳腺癌细胞中成熟miRNA激素调控的详细实验方案。文中清晰地解释了用于分析和验证这些miRNA表达的重要技术与化学方法。针对乳腺癌细胞中miRNA研究的技术选择，最终取决于具体的研究目标。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢休斯顿大学的 Xiaolian Gao 博士为LC Sciences miRNA微阵列平台提供的建议， 感谢瑞典卡罗林斯卡学院的Karin Edvardsson博士和休斯顿大学的Eylem Aydogdu博士分享其miRNA专业知识。本出版物中报告的研究工作得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助项目（资助编号：R01CA172437）的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本研究工作还得到了德克萨斯新兴技术基金（协议编号：300-9-1958）资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMLife Technologies11885092
F12Life Technologies11765054
FBSSigma-AldrichF0926-500ML
青霉素-链霉素Life Technologies15140122
无酚红DMEM Life Technologies11054020
超纯水EMD Millipore特定设备
DCC-FBSSigma-AldrichF6765-500ML
100倍L-谷氨酰胺Life Technologies25030081
PBS片剂Medicago, Accurate ChemicalsAccurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-雌二醇Sigma-AldrichE2758
ICI 182,780 Sigma-AldrichI4409
乙醇Sigma-AldrichE7023-600ML
T47D 或 MCF7 细胞系美国模式培养物集存库 (ATCC)T47D (ATCC HTB-133) 和 MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 培养瓶 VWR International LLCBD353136 (带透气盖)
胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300062
移液管VWR International LLC53300. 5 mL (53300-421)
Countess 细胞计数板Life TechnologiesC10228
Countess 自动细胞计数仪Life TechnologiesC10227
100 mm 培养皿 VWR International LLC25382-166
硫氰酸胍-苯酚溶液 (TRizol)Life Technologies15596026
橡胶细胞刮刀 VWR International LLC82050-470
硫氰酸胍-苯酚-氯仿法 (miRNeasy Mini Kit/Trizol)Qiagen217004
RNase-Free DNase I 试剂盒 (DNA降解)Qiagen79254
无RNase水 (无核酸酶水)ThermoscientificSH30538.02
Nanodrop 1000 分光光度计 ThermoscientificND-1000
Agilent RNA 6000 Nano 检测试剂盒Agilent5067-1512
Agilent 2100 生物分析仪AgilentG2938C 和配套软件 (G2946)
所有引物 (TaqMan引物除外)Integrated DNA Technologies按基因/miRNA定制
第一链缓冲液、DTT、dNTPs、Superscript III (Superscript III cDNA合成试剂盒) Life Technologies18080085
MicroAmp 快速96孔反应板 Life Technologies4346906
快速光学粘合盖膜Life Technologies4311971
2倍SYBR Green PCR主混合液 (花青素染料)Life Technologies4385612
7500 快速实时PCR系统及软件Life Technologies4351106
μParaflo 微流控生物芯片技术 LCSciencesMRA-1001 和 AS-2001 (用于结果分析)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex 池式检测 (RT引物/人源池组)Life Technologies4400928
双标记探针 (TaqMan) miRNA RT试剂盒 Life Technologies4366596
GeneAmp PCR System 9700 热循环仪Life Technologies4310899
双标记探针 (TaqMan) 2倍通用PCR主混合液 - 无AmpErase UNGLife Technologies4324018
7900HT 快速实时PCR系统Life Technologies4329001
SDS 和 RQ Manager 软件Life Technologies4444202
NCode miRNA 第一链cDNA合成与qRT-PCR试剂盒Life TechnologiesMIRC-50
10倍DPL (TaqMan) RT引物Life Technologies针对每种miRNA特异
20倍DPL (TaqMan) 实时检测引物 Life Technologies针对每种miRNA特异

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