Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Split-og pool Syntese og karakterisering af peptid tertiær amid Library

Published: June 20, 2014 doi: 10.3791/51299
Automatic Translation
1, 1
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

Summary

Peptid tertiære amider (ESP) er en superfamilie af peptidefterligninger, der omfatter, men er ikke begrænset til peptider, peptoider og N-methylerede peptider. Her beskriver vi en syntetisk fremgangsmåde, som kombinerer både split-and-pool og sub-monomer strategier til at syntetisere en en-perle-en-forbindelse bibliotek af PTAs.

Abstract

Peptidomimetika er gode kilder til protein-ligander. Oligomerforbindelse karakter af disse forbindelser gør det muligt at få adgang til store syntetiske biblioteker på fast fase ved hjælp af kombinatorisk kemi. En af de mest velundersøgte klasser af peptidomimetika er peptoider. Peptoider er lette at syntetisere og har vist sig at være proteolyse-resistent og celle-gennemtrængelig. Gennem det seneste årti har mange nyttige proteinligander blevet identificeret gennem screening af peptoid biblioteker. Men de fleste af de ligander identificeret fra peptoid biblioteker ikke vise høj affinitet, med sjældne undtagelser. Dette kan skyldes, dels manglen på chirale centre og konformationelle begrænsninger i peptoid molekyler. For nylig beskrev vi et nyt syntetisk rute for at få adgang peptid tertiære amider (pta). PTAs er en superfamilie af peptidefterligninger, der omfatter, men er ikke begrænset til peptider, peptoider og N-methylerede peptider. Med sidekæder på både α-carbon og væsentligste kæde nitrogenatomer,kropsbygning af disse molekyler er stærkt hæmmet af steriske hindring og allylisk 1,3 stamme. (Figur 1) Vores undersøgelse tyder på, at disse PTA molekyler er meget struktureret i opløsning og kan anvendes til at identificere protein-ligander. Vi mener, at disse molekyler kan være en fremtidig kilde af høj affinitet proteinligander. Her beskriver vi den syntetiske metode at kombinere kraften fra både split-og-pool og sub-monomer strategier til at syntetisere en prøve én kugle én-forbindelsen (OBOC) bibliotek af PTAs.

Introduction

Peptidomimetika er forbindelser, der efterligner strukturen af ​​naturlige peptider. De er designet til at bevare bioaktiviteten mens overvinde nogle af de problemer, der er forbundet med naturlige peptider, herunder cellepermeabilitet og stabilitet over for proteolyse 1-3. På grund af den oligomere natur af disse forbindelser, kan store syntetiske biblioteker let tilgås via monomere eller sub-monomere synteseveje 4-7. En af de mest undersøgte klasser af peptidomimetika er peptoider. Peptoider er oligomerer af N-alkylerede glyciner, der kan syntetiseres let ved hjælp af en sub-monomer strategi 8, 9. Mange nyttige proteinligander succes er blevet identificeret fra screening store syntetisk peptoid biblioteker mod protein-targets 1, 10-14. Ikke desto mindre, "hits" identificeret fra peptoid biblioteker sjældent arkivere meget høj affinitet til protein-targets 1,10-14,22. Én major forskellen mellem peptoider og naturlige peptider er, at de fleste af peptoider generelt mangler evnen til at danne sekundær struktur på grund af manglen på chirale centre og konformationelle begrænsninger. For at løse dette problem, blev der flere strategier udviklet i løbet af det sidste årti, hovedsagelig med fokus på ændring af sidekæder indeholdt på de vigtigste kæde nitrogenatomerne 15-22. For nylig har vi udviklet et nyt syntetisk vej til at indføre naturlige aminosyre sidekæder på en peptoid rygrad til at skabe peptid tertiære amider 23.

Peptid tertiære amider (ESP) er en superfamilie af peptidefterligninger, der omfatter, men er ikke begrænset til peptider (R2 = H), peptoider (R1 = H) og N-methylerede peptider (R1 ≠ H, R2 = Me) . (Se figur 1) Vores syntesevej beskæftiger naturligt forekommende aminosyrer som kilde til chiralitet og sidekæder på45,-carbon og kommercielt tilgængelige primære aminer for at give N-substitutioner. Derfor kan udforskes en større kemisk plads end enkle peptider, peptoider eller N-methylerede peptider. Cirkulære dikroisme-spektre har vist, at PTA molekyler er meget struktureret i opløsning. Karakterisering af en af ​​PTA-proteinkomplekser viser klart, at konformationelle begrænsninger PTA er nødvendige for binding. Vi har for nylig også opdaget, at nogle af de PTA molekyler har forbedret cellepermeabilitet end deres peptoid og peptid-modparter. Vi mener, at disse PTA biblioteker kan være en god kilde af høj affinitet ligander til protein-targets. I dette papir vil vi diskutere syntesen af ​​en prøve én kugle én-forbindelsen (OBOC) PTA bibliotek i detaljer sammen med nogle bedre betingelser for kobling og spaltning af disse forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Grundlæggende om Split-og-pool Synthesis

For effektivt at generere et stort antal forbindelser på fast fase, er split-og-pool syntese ofte som en generel strategi. Som vist i figur 4, Tentagel perler først opdelt i tre portioner. Hver portion reageres med en anden reagens, der genererer den første rest på perler. Efter den første reaktion, er alle tre dele samles sammen, blandet og derefter igen opdelt i tre portioner. Hver portion igen vil reagere med et andet reagens, der genererer den anden rest på perlerne. Efter to split-og-pool skridt, er ni forbindelser genereres.

I sub-monomer syntese, er perlerne først opdeles i flere dele for at reagere med forskellige bromo syrer i nærvær af koblingsreagens. Efter vask med opløsningsmiddel vil alle kugler lægges sammen og blandes derefter igen opdelt i flere portioner til at reagere med forskelligeprimære aminer. Efter aminering er alle perler samles sammen og vaskes grundigt, færdiggøre en komplet monomer på hver perle. Denne proces kan gentages, indtil den ønskede mangfoldighed er nået.

2. Fremstilling af syrebromid fra Natural Aminosyrer

I sub-monomer syntese, er syntesen af hver monomer opdelt i to separate trin:. 1. Kobling af syrebromid og 2 aminering med primære aminer (figur 2).. For at syntetisere et peptid tertiær amid, vil chirale syrebromider med sidekæder på alpha carbon fremstilles ud fra naturlige aminosyrer. Her beskrives fremgangsmåde til transformation af en naturlig aminosyre til den tilsvarende syrebromid med høj stereo fidelity. Vi bruger alanin som eksempel; andre aminosyrer, herunder serin, threonin, asparaginsyre, glutaminsyre, asparagin, glutamin, glycin, valin, isoleucin, phenylalanin kan også omdannes til brom-syrer under lignende conditions. Bemærk, at nogle af aminosyrerne med funktionelle grupper som phenol, guanidin og amin skal beskyttes før transformation. Reaktionen opsætningen vist i figur 3..

Sikkerhedsforanstaltninger: For der er behov for følgende reaktioner, der involverer HBr, Nano 2 og andre ætsende / giftige kemikalier, ordentlig sikkerhedsudstyr såsom beskyttelsesbriller, kittel og kemikaliebestandige handsker. Alle reaktioner bør udføres i et stinkskab af erfarne kemiker.

  1. Tilføj 370 ml vand i 630 ml 48% HBr løsning til at forberede en 1 L, 30% HBr løsning. Tilsæt 500 ml ethylenglycol i en 1 L badbeholderen; tilføje tøris til at holde temperaturen ved -10 ° C. Forsigtig: 48% HBr opløsning er stærkt sure og ætsende, håndtag med omhu. Læs sikkerhedsdatablad før brug.
  2. Tilføj D-alanin (8,9 g, 0,1 mol) og KBr (11,9 g, 0,1 mol) til en 250 ml trehalset rundbundet kolbe med en magnetisk omrørerstav. Tilsæt 100 ml, og 30% HBr udarbejdet i than foregående trin. Sæt kolben i ethylenglycol bad fremstillet i trin 2.1 og holde temperaturen på -10 ° C. Opløsningen med magnetisk omrørerstav ved 300 rpm boble argon gennem en lang nål fra bunden af kolben i 10 minutter, som vist i figur 3. Rør..
  3. Opløs NaNO 2 (8,28 g, 0,12 mol) i et 100 ml bægerglas med 20 ml vand. Føj opløsningen i trykudlignende skilletragt og forsegle skilletragten med en skillevæg. Drej langsomt på ventilen af skilletragten og lad NaNO 2 løsning falde ind i kolben. Styr ventil til at justere dryp sats til cirka 2 dråber pr sek. Hold under omrøring ved 300 rpm og holde argonbobling fra bunden af ​​kolben. Kolben bør holdes i ethylenglycol-bad ved -10 ° C, indtil der tilsættes alle NaNO2. Advarsel: Dette trin genererer varme og gas under tilsætningen af NaNO2-opløsning. Dryp kurs burde være omhyggeligt conleret, og hele systemet være åben gennem argon stikkontakt.
  4. Hold under omrøring i endnu 3 timer og lader temperaturen varme op fra -10 ° C til stuetemperatur. Den resulterende opløsning bør være klar til lys gul; hvis farven er for mørk, anvendes vakuum for at fjerne de overskydende nitrogenoxider og mulig Br2 genereres under reaktionen.
  5. Produktet ekstraheres fra opløsningen med 3x 35 ml diethylether ved hjælp af en ekstraktion tragt. Den organiske fase Kombiner og vaske det med mættet saltvand. Den organiske fase kan også vaskes med en lille mængde NaHCO3 før vask med saltvand til fjernelse af farve, hvis det er mørkt. Den organiske fase tørres over Na2 SO4 i 6 timer.
  6. Filtrere Na2 SO4, og opløsningsmidlet afdampes under vakuum, bør råprodukt opnås som klar til bleggul olie. Råprodukt kan oprenses yderligere ved destillation ved 115 ° C, 3 mm Hg, eller vedsilicasøjle med 3:1 hexan: ethylacetat.
  7. Rent produkt opnås som klar olie, 6,6 g (udbytte 74%), massefylde = 1,69 g / ml, [α] D20 = +24 ° (methanol) 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,41 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 1,86 (d, J = 7,0 Hz, 3H). I tilfælde af (S)-2-brompropansyre-d4 (fremstillet ud fra d4-L-alanin), der rent produkt opnået som klar olie, udbytte 78%, massefylde = 1,72 g / ml, [α] D20 = -19 ° (methanol). 1H NMR, er observeret nogen signifikant H signal. ESI-MS - [M-1] - = 155,1 (forventet 154,97). Til (S)-2-brom-4-methylpentansyre (fremstillet ud fra L-leucin ved anvendelse af samme procedure) rent produkt opnås som klar olie, udbytte 89%, [α] D20 = +37 ° (methanol) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,30 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 1,94 (dd, J = 10,8, 3,9 Hz, 2H), 1,81 (tt, J = 13,2, 6,5 Hz, 1H), 0,96 (dd, J = 18,2, 6,6 Hz, 7H). I tilfælde af (S)-2-brom-3-phenylpropanoic syre (fremstillet ud fra L-phenylalanin under anvendelse af samme procedure) rent produkt opnået som en svagt gul olie, udbytte 72%, [α] D20 = +17 ° (methanol) 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,38 - 7,19 (m, 5H), 4,42 (dd, J = 8,1, 7,3 Hz, 1H), 3,47 (dd, J = 14,2, 8,2 Hz, 1H), 3,25 (dd, J = 14,2, 7,2 Hz, 1 H).

3.. Isotopmærkning af alanin Brug transaminaser

I kombinatorisk bibliotek syntese, især i split-and-pool syntese af en sammensatte biblioteker en perle (OBOC), mængden af ​​forbindelse, der kan opnås fra hver perle er forholdsvis lille. (Typisk 1 pmol til 10 nmol). Derudover er massespektrometri vid udstrækning anvendes til identifikation og karakterisering af slutforbindelsen grund af sin høje følsomhed. For at anvende massespektrometri for at bestemme den absolutte stereokemi ved de chirale centre i de endelige PTA produkter bør brom syre enantiomerer være isotopically mærket før brug. Her beskrives fremgangsmåden til anvendelse transaminase og D2O at mærke L-alanin.

  1. Opløses L-alanin (300 mg, 3,36 mmol) med 10 ml D2O i et 50 ml polyethylenrør. Tilføj α-ketoglutarat (10 mg, 0,068 mmol) som co-substrat. Opvarm røret til 37 ° C og justere pD til 8,5-8,7 ved anvendelse af en 1 M NaOD Klik på linket. Bemærk: po bestemmes af pH teststrimler. Traditionelle electro pH-meter udstyret med glaselektrode selektiv for H + kan give forkerte læses op for D +.
  2. Tilføj alaninaminotransferase (0,1 mg, EC 2.6.1.2 fra gris hjerte, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) PD 8,5-8,7, 37 ° C opløsning fremstillet ud fra forrige trin. Sæt røret i en 37 ° C inkubator og inkuberes natten over med mild rystning, er 10 til 30 rpm foretrækkes.
  3. Efter inkubation natten over tage 0,5 ml D2O opløsning og kontrollere reaktionen fremskridt ved 1H-NMR. Alle protonsignaler aflanine, δ 3,76 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,3 Hz, 3H), 1H-NMR 400 MHz, bør i høj grad undertrykt på grund af deuterering. Mere end 98% af proton skal udveksles til deuterium som tidligere beskrevet 23. Bemærk: D2O kan delvis genvundet ved destillation, hvis reaktionen udføres i stor målestok (> 200 ml D2O). Normalt kan 60% til 80% af D2O destilleres fra opløsningen.
  4. Frys ovennævnte opløsning med flydende nitrogen og lyofiliseres under anvendelse af en frysetørrer for at opnå hvide deutereret L-alanin pulver.

4. Syntese af peptoidet Linker Region

Linker-regionen er ikke påkrævet for PTA bibliotek syntese. For at undgå høj baggrund i lavere molekylvægtsområde (100-600) af MALDI massespektroskopi og forbedre ionisering af forbindelserne, en peptoid linker med flere polære rester anvendes ofte. Dette peptoidet linker kan syntetiseres ved standard peptoid syntese procedure. Her vil vi syntetisere en pentamer af N-methoxyethyl glycin som linker (som vist i figur 5).

  1. Swell 90 um Tentagel perler med RAM-linker (1 g, 0,27 mmol / g) i 10 ml DMF i 3 timer i en 12 ml sprøjte reaktor med mild rystning.
  2. Tøm DMF fra reaktoren, og der tilsættes 10 ml 20% piperidin DMF-opløsning til afbeskyttelse Fmoc-gruppen fra Rink amid-linker. Ryst perlerne med 20% piperidin-opløsning i 30 minutter. Vask med DMF 5x at fjerne alle piperidin.
  3. Tag et par perler ud fra sprøjten og teste det med chloranil test. Perler skal vende mørkebrun (chloranil test positiv for primær amin) hvis Fmoc held afbeskyttes.
  4. Forbered følgende løsninger:. 1 20 ml, 2 M bromeddikesyre / DMF opløsning; 2. 20 ml, 2 M DIC / DMF-opløsning.; 3.. 10 ml, 1 M methoxylethylamine / DMF-opløsning.
  5. Der tilsættes 5 ml 2 M bromeddikesyre / DMF-opløsningen tilperlerne, ryst forsigtigt. Derpå tilsættes 5 ml 2 M DIC / DMF løsning til perlerne; forsegle sprøjten med stemplet og sætte det på shakeren. Der rystes i 10 min.
  6. Vask perlerne med DMF grundigt. Der tilsættes 2 ml 1 M methoxyethylamin / DMF-opløsning fremstillet ud fra trin 4.4 til perlerne. Seal sprøjten med stemplet og ryst det på shaker i 30 min.
  7. Vask perlerne med DMF 5x. Tjek et par perler med chloranil test, hvis positive (perlerne blive blå), derefter fortsætte til næste trin. Ellers gentag trin 4.6.
  8. Gentag trin 4,5-4,7, 4x at fuldføre pentamer.

. 5. Split-og-pulje Syntese af PTA bibliotek med (R) - og (S)-2-brompropion Syrer

Her beskrives syntesen af ​​en lille PTA bibliotek med en teoretisk mangfoldighed 9.261 forbindelser ved anvendelse af 1 g af perler fra trin 4.8. Bemærk, at en 90 um TentaGel perle indeholder cirka 2,9 millioner perler pr gram; derfor afskedigelse afbiblioteket vil være 2,9 x 10 6 / 9.261 = 312 eksemplarer. Vi vil anvende bromeddikesyre (R)-2-bromopropanoic og isotopiske mærket (S)-2-brompropansyre-d4 som syrer og 7 forskellige aminer (A1 ~ A7, se figur 5 for detaljer) til aminering. Sprøjte reaktorer og en vakuummanifold vil blive anvendt til at udføre syntesen.

  1. Tilsæt 10 ml 1:1 DCM: DMF til sprøjten fra trin 4.8; bruge en 1.000 gl pipette med en afkortet pipettespids til at splitte alle 1 g perler jævnt i tre 5 ml sprøjte reaktorer. Mærke dem som B (bromeddikesyre), R ((R)-2-bromopropanoic) og S ((S)-2-brompropansyre-d4). Vask alle 3 sprøjter med DCM 3x, og vask sprøjter mærket med R og S med vandfrit THF 3x, vask sprøjte mærket med B med DMF 3x.
  2. Sprøjte R og S. BTC kobling af brompropansyre.
    1. Forbered en frisk BTC / THF-opløsning. Tilføj enpproximately 200 mg BTC ind i hætteglasset i et stinkskab, forsegle det med hætten. Mængden af ​​BTC afvejes i hætteglasset. Mængden af ​​opløsningsmiddel nødvendig og tilføj vandfri THF i hætteglasset for at lave en 20 mg / ml BTC / THF-opløsning.
    2. Forbered bromo syrer / BTC blanding. Add (R)-2-brompropansyre (89 pi, 0,95 mmol) og (S)-2-brompropansyre-d4 (89 ul, 0,95 mmol) i to små hætteglas separat. Til hvert hætteglas, tilsættes 5 ml af over 20 mg / ml BTC / THF-opløsning. Forsegl de to hætteglas og sætte dem i -20 ° C fryser i 20 min.
    3. Tilføj 1.125 pi, 2:1 THF / DIPEA (750 pi THF, 375 ul DIPEA, 2,2 mmol) for at sprøjte R og S separat. Bland perlerne med pipettespidsen. Lad dem sidde i 5 min.
    4. Tag to afkølede bromo syrer / BTC blandinger fra trin 5.2.2, tilsættes 2,4,6-trimethylpyridin (356 ul, 2,7 mmol) til hver hætteglas. Hvide bundfald vil danne straks. Påfør den tilsvarende suspension direktede gjort basisk perler (sprøjte R og S i trin 5.2.3), så snart som muligt og derefter sætte dem på en shaker til at ryste under 120 rpm i 2 timer.
      Bemærk: Den opløsning i sprøjten reaktorer skal være en lysegul suspension under hele forløbet af reaktionen. En mørkere farve er en indikation af overdreven varme, der frigives under den indledende tilsætning af syrechloridet løsning. Dette kan løses ved yderligere afkøling eller fortynde brom syrer / BTC blanding.
  3. Sprøjte B. Bromeddikesyre kobling med DIC
    1. Forbered en frisk 20 ml, 2 M bromeddikesyre / DMF-opløsning. Forbered en 20 ml, 2 M DIC / DMF-opløsning.
    2. Tilsæt 2 ml 2 M bromeddikesyre / DMF løsning til at sprøjte B, ryst forsigtigt. Tilsæt 2 ml 2 M DIC / DMF løsning til at sprøjte B, ryst forsigtigt.
    3. Sæt sprøjten B på samme shaker som sprøjte R og S
  4. Efter 2 timer, tage sprøjten R, S og B fra shakeren. Vask alle tre sprøjter grundigt med DCM 5x. Vask så med DMF 5x. Bemærk, at sprøjten R og S ikke kan vaskes med DMF før bliver vasket med DCM eller THF først.
  5. Pool alle perlerne fra sprøjter R, S og B til en 12 ml sprøjte reaktor. Vask alle perlerne med DMF 5x.
  6. Tilsæt 10 ml 1:1 DCM: DMF til sprøjten; bruge en 1.000 gl pipette med en afkortet pipettespids til at splitte alle perlerne jævnt i 7 individuelle 2 ml sprøjter, mærke dem som A1-A7.
  7. Aminering. Forbered 10 ml, 2 M primære amin / DMF løsninger for hver af de 7 aminer i fig. 5. Tilsæt 5 ml each aminopløsning til den tilsvarende sprøjte A1-A7. Inkuber alle 7 sprøjter i en 60 ° C inkubator med omrystning natten over.
  8. Efter inkubation vaskes alle perlerne grundigt med DMF. Tag et par af perler fra hver sprøjte, og tjekke med chloranil test. Hvis perlerne bliver grønne (positive) inden for 3 minutter, fortsæt med næste trin. Hvis negativ, skal du gentage trin 5.7 for de negative sprøjter.
  9. Gentag trin 5.1 til 5.8 2x at fuldføre trimeren. Eventuelt trin: Efter hver cyklus, anbefaler vi at kontrollere syntesen kvalitet ved massespektroskopi som beskrevet nedenfor. Alle 9.261 forbindelser er nu syntetiseret på Tentagel perler som OBOC biblioteket.
  10. Massespektroskopisk bekræftelse af PTAs.
    PTAs er meget strukturerede oligomerer og har mange fælles træk ved N-methylerede peptider. Et af de fælles problemer med fastfasesyntese af N-methylerede peptider syren nedbrydning under TFA spaltning. For at undertrykke syrenedbrydning, spaltning af molekyler som cyclosporin frasolid støtte udføres ofte under lav temperatur. Vi sammenlignede forskellige spaltningsmidler betingelser for spaltning af forskellige PTA-molekyler fra den faste understøtning. Vi fandt, at generelt kan lav temperatur og reduceret TFA koncentration effektivt at undertrykke syrenedbrydning og giver renere forbindelser.
    1. Forbered 10 ml 01:01 TFA / DCM opløsning i et 15 ml rør. Forsegl røret og sætte det i en -20 ° C fryser i 20 min.
    2. Vask perlerne, der skal spaltes med DCM 5x. Ryst perler i DCM i 15 min og vask af perlerne igen med DCM 5x.
    3. Tøm DCM fra sprøjten. Brug et lysmikroskop og en pipette med afstumpet spids til at overføre hver enkelt perle i en 96-brønds plade, en kugle per brønd.
    4. Dæk 96-brønds plade med en dækstrimmel. Sæt pladen i en -20 ° C fryser i 15 min.
    5. Tag den afkølede 01:01 TFA / DCM opløsning fra trin 5.10.1 og tilsættes 20 pi til hver af de brønde, der indeholder en perle. Sæt dækslet glide tilbage og put 96-brønds plade på et rysteapparat i -20 ° C køleskab.
    6. Der rystes i 20 min. Tag 96-brønds plade ud og skrælle dækglasset. Føntørre TFA / DCM fra hver brønd ved at blæse luft eller argon over det. Hvis mere end 10 perler spaltes, kan en Speedvac anvendes til at tørre TFA / DCM fra hele pladen. Bemærk, at på dette tidspunkt er det ikke alle forbindelserne fraspaltes perlerne, men de spaltede forbindelser bør være mere end tilstrækkeligt til at udføre massespektroskopi analyse.
    7. Tilsæt 20 ul 06:04 ACN: H 2 O for at opløse den spaltede forbindelser fra hver brønd. Spot 0.6 pi af hver forbindelse opløsning sammen med 0,6 pi CHCA MALDI matrix på MALDI plade.
    8. Brug MALDI massespektrometri til bestemmelse af molekylvægten og sekvens (MS / MS) af hver forbindelse.

6.. Chloranil Test

  1. Forbered følgende reagenser frisk for hver test. Opløsning A: 2% Chloranil (CAS: 118-75-2) i DMF. OpløsningB: 2% acetaldehyd (CAS: 75-07-0) i DMF.
  2. Bland 100 ul af opløsning A med 100 ul opløsning B før testen i et 1,5 ml rør; droppe perlerne i og ryst. Hvis perlerne bliver blå inden for 5 min, indikerer det tilstedeværelse af sekundær amin på overfladen af ​​perlerne. Primære aminer giver en mørk brun farve i stedet for at blive blå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi tre repræsentative MALDI spektre fra en PTA trimer med linker. Som vist i figur 6A, når spaltet ved stuetemperatur under anvendelse af 50% TFA / DCM opløsning, observeres betydelig nedbrydning. I figur 6A, toppe 593 og 484 svarer til linkeren og PTA trimer henholdsvis viser, at hele molekylet med succes blev syntetiseret på perle, men nedbrydes i løbet af spaltning. Når spaltes under lave temperaturer som beskrevet ovenfor, er mængden af TFA-induceret nedbrydning i høj grad undertrykt, som vist i figur 6B. Mekanismen for sådan spaltning er blevet beskrevet i tidligere litteratur 24, og det menes at gå gennem et oxazolidinmellemprodukt. PTA molekyler kan sekventeres ved MS / MS og opsplitning mønster, der svarer til peptider og peptoider, som vist i figur 6C. PTA-molekyler syntetiseres med (S)-2-brompropansyre-d4 generelt give bredere top på MS og MS / MS-spektre på grund af tilstedeværelsen af ufuldstændige deutereringen produkter såsom (S)-2-brompropansyre-d 3 (figurerne 7A og 7B). Dette kan bruges som en indikation på tilstedeværelsen af ​​R-chirale center (inverteret fra S i aminering) under sekventering procedure. Vi fandt også, PTA molekyler har en tendens til at danne mere sodiated addukter end peptoid / peptid derfor lav vand natrium (f.eks dionized vand) og apparater plast foretrækkes (figur 7C). Et andet biprodukt, der kunne observeres i PTA syntese er acrylamid af elimineringen af bromid under aminering (figur 7C). Når acrylamid dannes sekvensen afsluttes. Dette kan løses ved at sænke koncentrationen af ​​den primære amin til 1 M med henblik på at reducere basicitet opløsningen. Vi anbefaler at udføre chloranil test efter hver acyleringstrin og bruge masse spectroscopy at kontrollere produktet efter hver aminering skridt til at sikre kvaliteten af ​​biblioteket.

Figur 1
Fig. 1. Strukturel sammenligning af peptid, peptoid, PTA og N-methylerede peptid. PTA omfatter peptid (R2 = H), peptoid (R1 = H) og N-methylerede peptid (R1 ≠ H, R2 = Me) . B) PTA foretrækker trans amidbindings kropsbygning på grund af den steriske hindring mellem to α-sidekæde. C) PTA har også et foretrukket kropsbygning grundet 1,3 allyliske belastning mellem N-erstatning og α-sidekæde. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 2.. Sub-monomer syntese af peptoid (R ­ 1 = H) og PTA (R1 ≠ H). Første trin er syren acylering af aminen. Andet trin er aminering med primære aminer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Fig. 3. Reaktion setup. En 250 ml tre-halset rundbundet kolbe sættes i et tøris / ethylenglycol bad. Den midterste hals er forbundet med en 150 ml trykudlignende tildrypningstragt. De venstre og højre hals er lukket med en flowkontrol adapter og en skillevæg wed en lang nål, der tillader argonflow passere igennem. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Fig. 4. Grundlæggende split-and-pool syntese. Blank perler er opdelt i tre portioner, som blev behandlet separat med reaktant A, B og C. Efter den første reaktion, alle tre dele af perler samles sammen og blandes. Poolede perler igen opdelt i tre portioner og igen behandlet med samme reaktant for hver enkelt portion. Efter den anden reaktion, er 9 forskellige forbindelser syntetiseret. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5.. Bibliotek struktur overblik. Tre PTAs er syntetiseret efter pentameren peptoid linker. Teoretisk mangfoldighed, 3 3 X 7 3 = 9.261. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Fig. 6. Typisk MALDI massespektre PTA trimeren. A) Trimer PTA spaltet med 50% TFA / DCM ved stuetemperatur. PTA struktur som vist, [M +1] + = 1.077, [M + Na] + = 1,098.9, PTA fragmentering fra TFA spaltning kan tydeligt ses på spektret. B) Trimer cleaved med 50% TFA / DCM under optimerede betingelser som beskrevet i papiret. TFA-inducere syrenedbrydning er stærkt undertrykt. C) MS / MS spektrum af PTA trimeren. Svag Y7 er observeret (916)-signalet, dette er et typisk fragmentering adfærd for PTAs. Spectra analyseret og genereret af mMass 32. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. MALDI spektre PTA syntese med isotopisk mærket monomer og typiske biprodukter. A) MS-spektre sammenligning af PTA molekyler syntetiseret af blå: (R)-2-bromopropanoic [M +1] + = 760 [M + Na] + = 787 [M + K] + = 803 og rød: (S) - 2-brompropansyre-d4 [M +1] + = 764 [M + Na] + = 783 [M + K] + = 799. B) MS / MS-fragmentering mønstre af de to molekyler er vist i A). Bemærk, at på grund af tilstedeværelsen af d 1 d 2 og d 3 krydderier (ufuldstændig deuterering af alanin), molekyler syntetiseret af (S)-2-brompropansyre-d4 giver generelt bredere toppe C) Rød:. Spektret af PTA dimer syntetiseret og spaltes under optimerede tilstand. Blå:. PTA dimer syntetiseret med 2 M methoxyethylamin løsning og spaltes i normal filtreret vand Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Peptid tertiære amider (ESP) er en superfamilie af peptidomimetiske oligomerer. Udover de velundersøgte peptider, peptoider og N-methylerede peptider, en stor del af forbindelser inden for denne familie er understudied, majorly på grund af manglende syntetisk metode til at få adgang til generelle N-alkylerede peptider. Her beskriver vi en effektiv metode til at syntetisere PTAs med chirale byggesten afledt af aminosyrer. Vi har tidligere rapporteret at bruge et nyt sub-monomer rute til syntese biblioteker af PTA molekyler 23. Vi har vist, at PTAs er meget strukturerede oligomerer, som har konformationelle fastholdelsesanordninger gennem rygraden. Når de blev testet in vivo, PTA-molekyler udviste forbedret cellepermeabilitet og dermed forbedret aktivitet 25. Men ved siden af ​​med alle de fordele, PTAs også komme med nogle syntetiske udfordringer majorly fra acyleringen af ​​sekundære aminer ved hindrede positioner. Den α-sidekæde, som tilvejebringer konformationelbegrænsning bringer også sterisk hindring for følgende kobling trin. For at overvinde disse syntetiske udfordringer, udførte vi en omfattende optimering undersøgelse og bestemmes BTC som den bedste koblingsreagens til denne reaktion 23.

Det centrale trin i syntesevejen er BTC lettes acylering af den sekundære amin. Under denne proces BTC muliggør dannelsen af et syrechlorid in situ 26,27. De fleste andre koblingsreagenser, der udgør enten aktive estere eller syreanhydriderne som mellemprodukter undladt at levere ren acylering for kontinuerlig PTA syntese. Eksistensen af ​​tidligere PTA enheder i høj grad svækker koblingen effektiviteten af ​​følgende PTA enhed på grund af sterisk hindring. Derfor er for syntese af flere PTAs, et meget aktivt mellemprodukt med en lille fraspaltelig stærkt foretrukket. Blandt alle de koblingsbetingelser som vi testede i situ-genererede syre chlorid ved BTC arbejder best i vores hånd. , Selv med de meget aktive syrechlorider, anbefaler vi dog at undgå stærkt sterisk hindrede aminer såsom α-forgrenede primære aminer i biblioteket syntese medmindre testes på forhånd. Aromatiske aminer, såsom Anile ofte føre til ufuldstændig substitution og således bør også undgås. Under BTC koblingstrin bør opløsningen altid være en lysegul til orange farve; en mørkere farvet løsning er en indikation af overophedning og kan resultere i lavere udbytte og øget dannelse af biprodukter. Dette kan normalt løses ved yderligere afkøling af BTC opløsning reducere størrelsen af ​​reaktionen og hurtigere overførsel af den aktiverede BTC / syre. Udover BTC, N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1 ,2-dihydroquinolin (EEDQ) er et andet koblingsreagens, der fungerer godt i PTA syntese. Nøglemellemproduktet er en blandet Kulsyreanhydrid med et relativt lille fraspaltelig gruppe. I tilfælde af EEDQ er 3 ækvivalent EEDQ opløses sammen med syren i DCM og derefter aptvistet til perlerne ved stuetemperatur. Reaktionen udføres normalt i løbet af 2 timer med mild rystning. Denne reaktion frigiver CO 2 under reaktionen; derfor reaktionssystemet ikke bør lukkes.

Et andet vigtigt skridt er den spaltning og karakterisering af PTA molekyler. Et karakteristisk MS / MS fragmentering mønster er observeret, når sekventering PTA molekyler via MALDI-MS/MS (figur 6). Den består med en lav intensitet af sidste y ion (vist i lilla i figur 6C og øget intensitet Y6 y5, Y4, B2 og B3 ioner). Analoge mønstre er blevet observeret fra N-methylerede peptid fragmentering i den foregående rapport 28. På grund af den øgede stabilitet i den mellemliggende oxazolidin, N-methylerede peptider tendens til at give stærke b ioner 28. Desuden er det velkendt, at N-methylerede peptid er syrelabil både under TFA-spaltning og MALDI massespektroskopi 24.28, 29. Mekanistisk forsøg har vist, at på grund af den konformationelle begrænsninger på rygraden, carbonyl-oxygenatomet i foregående rest er ofte i nærheden af carbonylgruppen kløvningssted, hvilket fremmer dannelsen af oxazolidinmellemprodukt 29. Af de ovennævnte grunde, både PTAs og N-methylerede peptider skal spaltes fra faste understøtninger ved lav temperatur med kontrollerede koncentrationer af TFA 26, 30. Det er vores erfaring, den mest bekvemme kavalergang metode for individuelle PTA rester forekommer ved -20 ° C med en pre-afkølet, -20 ° C opløsning af 50% TFA / DCM. Denne procedure i høj grad undertrykker dannelsen af ​​syre nedbrudte produkter.

Efter beherske denne teknik, kan biblioteket PTA monomer afledt af andre naturlige aminosyrer, såsom leucin, phenylalanin, glutamin, osv. syntetiseres som godt. En høj kvalitet PTA bibliotek kan screenes against forskellige protein-targets ved hjælp af vores tidligere offentliggjorte om-perle screening protokoller 31. Hit forbindelser identificeret fra screeningen kan karakteriseres ved masse-spektroskopi og gensyntetiseres til yderligere test med den protokol, der er beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jumpei Morimoto og Dr. Todd Doran for værdifuld hjælp. Dette arbejde blev støttet af en kontrakt fra NHLBI (NO1-HV-00242).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4,6 trimethylpyridine ACROS 161950010 CAS:108-75-8
2-morpholinoethanamine Sigma-Aldrich 06680 CAS:2038-03-1  
48% HBr water solution ALFA AESAR AA14036AT CAS:10035-10-6
Acetaldehyde Sigma-Aldrich 402788 CAS:75-07-0  
Acetonitrile Fisher SR015AA-19PS CAS:75-05-8
Anhydrous tetrahydrofuran (THF) EMD EM-TX0277-6 CAS:109-99-9
Benzylamine Sigma-Aldrich 185701 CAS:100-46-9
bis(Trichloromethyl) carbonate (BTC) ACROS 258950050 CAS:32315-10-9
Bromoacetic acid ACROS 106570010 CAS:79-08-3
Chloranil Sigma-Aldrich 23290 CAS:118-75-2
Cyclohexanemethylamine Sigma-Aldrich 101842 CAS:3218-02-8
D2O Cambridge Isotope DLM-4-99.8-1000 CAS:7789-20-0
D-Alanine Anaspec 61387-100 CAS:338-69-2
Dichloromethane (DCM) Fisher BJ-NS300-20 CAS:75-09-2
Dimethylformamide (DMF) Fisher BJ-076-4 CAS:68-12-2
Ethylene glycol Oakwood 44710 CAS:107-21-1
Isopentylamine Sigma-Aldrich W321907 CAS:107-85-7
KBr ACROS 424070025 CAS:7758-02-3
L-Alanine Anaspec 61385-100 CAS:56-41-7
3-Methoxypropylamine Sigma-Aldrich M25007 CAS:5332-73-0
2-Methoxyethylamine Sigma-Aldrich 143693 CAS:109-85-3
N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone Sigma-Aldrich 136565 CAS:7663-77-6 
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) ACROS 115211000 CAS:693-13-0
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma-Aldrich D125806 CAS:7087-68-5
NaNO2 ACROS 424340010 CAS:7631-99-4
NAOD 40% solution in water ACROS 200058-506 CAS:7732-18-5
Piperidine ALFA AESAR A12442-AE CAS:110-89-4
Piperonylamine Sigma-Aldrich P49503 CAS:2620-50-0
Propylamine Sigma-Aldrich 240958 CAS:107-10-8
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537 CAS:76-05-1
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich 39468 CAS:28166-41-8  
α-Ketoglutarate ALFA AESAR AAA10256-22 CAS:328-50-7
Tentagel Resin with RINK linker Rapp-Polymere S30023
Alanine transaminase Roche 10105589001 AKA: Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT)
Incubator New Brunswick Scientific Innova44
NMR Bruker 400 MHz
MALDI mass spectrometer Applied Biosystems 4800 MALDI-TOF/TOF
Lyophilizer SP Scientific VirTis benchtop K
Syringe reactor INTAVIS Reaction Column 3 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Vacuum manifold Promega A7231 Vac-Man

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xiao, X., Yu, P., Lim, H. -S., Sikder, D., Kodadek, T. Design and Synthesis of a Cell-Permeable Synthetic Transcription Factor Mimic. Journal of Combinatorial Chemistry. 9, 592-600 (2007).
  2. Miller, S. M., et al. Proteolytic Studies of Homologous Peptide and N-Substituted Glycine Peptoid Oligomers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 4, 2657-2662 (1994).
  3. Grauer, A., Konig, B. Peptidomimetics - A Versatile Route to Biologically Active Compounds. European Journal of Organic Chemistry. 30, 5099-5111 (2009).
  4. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. Journal of the American Chemical Society. 114, 10646-10647 (1992).
  5. Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods in Enzymology. 267, 437-447 (1996).
  6. Seebach, D., et al. beta-peptides: Synthesis by Arndt-Eistert homologation with concomitant peptide coupling. Structure determination by NMR and CD spectroscopy and by X-ray crystallography. Helical secondary structure of a beta-hexapeptide in solution and its stability towards pepsin. Helv Chim Acta. 79, 913-941 (1996).
  7. Lam, K. S., et al. A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity. Nature. 354, 82-84 (1991).
  8. Simon, R. J., et al. Peptoids - a Modular Approach to Drug Discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9367-9371 (1992).
  9. Burkoth, T. S., et al. Toward the synthesis of artificial proteins: the discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chem Biol. 9, 647-654 (2002).
  10. Alluri, P. G., Reddy, M. M., Bachhawat-Sikder, K., Olivos, H. J., Kodadek, T. Isolation of protein ligands from large peptoid libraries. Journal of the American Chemical Society. 125, 13995-14004 (2003).
  11. Lim, H. S., Archer, C. T., Kodadek, T. Identification of a peptoid inhibitor of the proteasome 19S regulatory particle. Journal of the American Chemical Society. 129, 7750-7751 (2007).
  12. Wrenn, S. J., Weisinger, R. M., Halpin, D. R., Harbury, P. B. Synthetic ligands discovered by in vitro selection. Journal of the American Chemical Society. 129, 13137-13143 (2007).
  13. Aina, O. H., Marik, J., Liu, R. W., Lau, D. H., Lam, K. S. Identification of novel targeting peptides for human ovarian cancer cells using "one-bead one-compound" combinatorial libraries. Mol Cancer Ther. 4, 806-813 (2005).
  14. Udugamasooriya, D. G., Dineen, S. P., Brekken, R. A., Kodadek, T. A Peptoid “Antibody Surrogate” That Antagonizes VEGF Receptor 2 Activity. Journal of the American Chemical Society. 130, 5744-5752 (2008).
  15. Shah, N. H., et al. Oligo( N-aryl glycines): A New Twist on Structured Peptoids. Journal of the American Chemical Society. 130, 16622-16632 (2008).
  16. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2794-2799 (2008).
  17. Paul, B., et al. N-Naphthyl Peptoid Foldamers Exhibiting Atropisomerism. Organic Letters. 14, 926-929 (2012).
  18. Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. A peptoid ribbon secondary structure. Angewandte Chemie. 52, 5079-5084 (2013).
  19. Gorske, B. C., Stringer, J. R., Bastian, B. L., Fowler, S. A., Blackwell, H. E. New strategies for the design of folded peptoids revealed by a survey of noncovalent interactions in model systems. J Am Chem Soc. 131, 16555-16567 (2009).
  20. Stringer, J. R., Crapster, J. A., Guzei, I. A., Blackwell, H. E. Extraordinarily robust polyproline type I peptoid helices generated via the incorporation of alpha-chiral aromatic N-1-naphthylethyl side chains. J Am Chem Soc. 133, 15559-15567 (2011).
  21. Huang, K., et al. A threaded loop conformation adopted by a family of peptoid nonamers. Journal of the American Chemical Society. 128, 1733-1738 (2006).
  22. Lee, J. H., Kim, H. S., Lim, H. S. Design and Facile Solid-Phase Synthesis of Conformationally Constrained Bicyclic Peptoids. Organic Letters. 13, 5012-5015 (2011).
  23. Gao, Y., Kodadek, T. Synthesis and Screening of Stereochemically Diverse Combinatorial Libraries of Peptide Tertiary Amides. Chem Biol. 20, 360-369 (2013).
  24. Urban, J., Vaisar, T., Shen, R., Lee, M. S. Lability of N-alkylated peptides towards TFA cleavage. Int J Pept Protein Res. 47, 182-189 (1996).
  25. Rzuczek, S. G., Gao, Y., Tang, Z., Thornton, C. A., Kodadek, T., Disney, M. D. Features of Modularly Assembled Compounds That Impart Bioactivity Against an RNA Target. ACS Chemical Biology. 8 (10), 2312-2321 (2013).
  26. Thern, B., Rudolph, J., Jung, G. Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of N-alkylated amino acids—total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Letters. 43, 5013-5016 (2002).
  27. Sleebs, M. M., Scanlon, D., Karas, J., Maharani, R., Hughes, A. B. Total Synthesis of the Antifungal Depsipeptide Petriellin A. J Org Chem. 76, 6686-6693 (2011).
  28. Vaisar, T., Urban, J. Gas-phase fragmentation of protonated mono-N-methylated peptides. Analogy with solution-phase acid-catalyzed hydrolysis. Journal of Mass Spectrometry. 33, 505-524 (1998).
  29. Creighton, C. J., Romoff, T. T., Bu, J. H., Goodman, M. Mechanistic studies of an unusual amide bond scission. Journal of the American Chemical Society. 121, 6786-6791 (1999).
  30. Sewald, N., Sewald, N. Efficient, racemization-free peptide coupling of N-alkyl amino acids by using amino acid chlorides generated in situ--total syntheses of the cyclopeptides cyclosporin O and omphalotin A. Angewandte Chemie (International ed. in English). 41, 4661-4663 (2002).
  31. Astle, J. M., et al. Seamless Bead to Microarray Screening: Rapid Identification of the Highest Affinity Protein Ligands from Large Combinatorial Libraries. Chem Biol. 17, 38-45 (2010).
  32. Strohalm, M., Kavan, D., Novak, P., Volny, M., Havlicek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal Chem. 82, 4648-4651 (2010).

Tags

Kemi Split-og pool-syntese peptid tertiær amid PTA peptoid high-throughput screening kombinatorisk bibliotek fast fase triphosgen (BTC) en kugle-én forbindelse OBOC
Split-og pool Syntese og karakterisering af peptid tertiær amid Library
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool… More

Gao, Y., Kodadek, T. Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library. J. Vis. Exp. (88), e51299, doi:10.3791/51299 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter