光学生物传感器技术可检测活细胞质膜附近的质量变化，从而能够追踪单个细胞及细胞群体的细胞反应。本方案将介绍利用该方法在完整细胞中检测G蛋白偶联受体对钾离子通道的调控作用。
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本文内容
摘要
摘要
离子通道通过选择性允许离子跨质膜流动，调控神经元及其他可兴奋细胞类型的电学特性1。为了调节神经元的兴奋性，信号蛋白和分子会改变离子通道的生物物理特性，这些蛋白和分子通常直接结合到通道上，形成异源多聚体通道复合物2,3。传统检测通道与调节蛋白相互作用的方法依赖外源性标记物，这些标记物可能改变蛋白的行为，降低靶标的生理相关性，且无法提供活细胞中相互作用时间进程的信息。光学生物传感器（例如 X-BODY Biosciences BIND Scanner 系统）采用一种新型的无标记技术——共振波长光栅（RWG）光学生物传感器，用于检测生物传感器附近共振反射光的变化。该检测方法可监测贴壁于生物传感器表面的活细胞底部质量的相对变化，这些变化源于配体诱导的细胞黏附与铺展、毒性、增殖以及细胞质膜附近蛋白-蛋白相互作用的改变。RWG 光学生物传感器已被用于检测 G 蛋白偶联受体（GPCRs）、受体酪氨酸激酶及其他细胞表面受体激活后，细胞质膜附近质量的变化。该方法也可用于研究配体诱导的离子通道-蛋白相互作用的变化。本文中，我们将描述利用该检测方法探测 G 蛋白偶联受体对 Slack-B 钠激活钾（KNa）通道调节作用的实验流程。
引言
在生理相关环境中研究活细胞对于理解细胞靶标的生物学功能至关重要。然而，检测通道蛋白与调控性胞质蛋白之间相互作用的实验方法（如共免疫沉淀实验）通常难以提供有关活细胞内相互作用时间进程的信息。目前大多数基于细胞的检测方法仅测量特定的细胞事件，例如荧光标记的目标蛋白的转位过程。这类实验需要对目标蛋白进行修饰，可能改变蛋白的行为，从而降低其生理相关性。非侵入性的基于细胞的检测方法无需对系统进行干预，可连续测量细胞活性，使研究者能够在最接近生理状态的条件下开展细胞研究4。
光学生物传感器旨在产生一种可测量的光信号变化，该变化与耦合到传感器表面的光特性相关。利用隐逝波的光学生物传感器，包括表面等离子共振（SPR）和共振波长光栅（RWG）技术，主要用于检测分子与其固定在传感器表面的生物受体结合时的亲和力和动力学特性。近年来，已开发出商业化的RWG生物传感器，能够以高空间分辨率（高达3.75 µm/像素）检测贴附于传感器表面的细胞底部区域的质量相对变化5。这些生物传感器可检测活细胞近质膜区域因刺激引起的质量变化，例如细胞黏附与铺展、毒性、增殖 以及由多种细胞表面受体（包括G蛋白偶联受体（GPCRs））激活的信号通路6。RWG生物传感器通过检测生物传感器表面150 nm范围内折射率的相对变化，反映质量的相对变化7。当细胞接种至生物传感器表面时，折射率的变化反映了细胞因与传感器黏附状态改变而引起的近....
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方案
1. 细胞培养（改编自 Fleming 和 Kaczmarek18）
- 在用于本实验前，将细胞在适当的培养基中培养，传代次数应大于2代但少于10代。未转染的HEK-293细胞及稳定表达大鼠Slack-B蛋白的HEK-293细胞，培养于含10%热灭活胎牛血清和抗生素的DMEM/F12（1:1）混合培养基中。在稳定表达Slack-B的HEK-293细胞培养基中加入500 µg/ml 遗传霉素（G418），以筛选Slack通道的表达。当细胞融合度达到70–90%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，进行传代。
2. 使用纤连蛋白和卵清蛋白对 TiO2 384 孔光学生物传感器板进行细胞外基质（ECM）包被
- 纤连蛋白细胞外基质混合物和卵清蛋白封闭液的制备
- 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制纤连蛋白工作液，终浓度为 5 µg/ml ，总体积为 20.0 ml 。从 1.0 mg/ml 的储备液中取 100 µl 加入 20.0 ml PBS 中，实现 200 倍稀释。纤连蛋白工作液可分装后于 -20 °C 保存。
- 在无菌水中配制 5% 的热灭活卵清蛋白储备液。将卵清蛋白溶于无菌细胞培养级水中制成 5% 溶液，并在 60 °C 下加热灭活 30 分钟。冷却至室温后，用无菌滤膜过....
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结果
将稳定转染Slack-B的HEK-293细胞和未转染的对照HEK-293细胞以每孔1,000个细胞的密度接种于384孔ECM包被的RWG生物传感器板上。使用BIND Scan软件记录生物传感器中心1.5 mm2区域的图像，分辨率为3.75 µm/像素（图1）。在化合物加入前及加入后30分钟生成质量密度梯度图。采用BIND View软件通过将化合物加入后的PWV减去基线PWV，测定GPCR激动剂加入后PWV的变化。
内源性M1毒蕈碱受体激动剂氯化氨甲酰胆碱（carbachol）19作用于未转染的对照组HEK-293细胞以及稳定表达大鼠Slack-B的HEK-293细胞后，均引起PWV的正向增加（图2A）。在30分钟时间点进行测量，信号以仅添加缓冲液（HBSS）为对照进行归一化。与对照细胞相比，转染Slack-B的细胞在PWV峰值位移上的增加更为显著。SFLLR-NH2三氟乙酸盐（SFLLR）是一种N端TRAP五肽，可作为内源性G蛋白偶联受体——蛋白酶激.......
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讨论
Z 值（Z' 因子）是一种常用的统计方法，用于量化高通量筛选实验的质量20。由于本实验中 GPCR 激动剂的筛选是在符合 SBS 标准的 384 孔板中进行的，因此 Z' 因子能够很好地反映该实验的稳健性和有效性21。Z' 值为 1 表示理论上理想的实验，其数据点数量无限且标准差为零。Z' 值在 0.5–1 之间被认为非常适合用于高通量筛选，而低于 0.5 的 Z' 值则表明实验的信息量有限。在本数据集中，以卡巴胆碱（carbachol）和 SFLLR 分别作为阳性对照计算得到的 Z' 值分别为 0.79 和 0.81，表明该实验具有很高的稳健性，所得结果具有高度显著性。
本实验中的384孔光学生物传感器板的细胞外基质包被、细胞接种以及化合物添加均使用16通道Finnpipette移液器（5-50 µl）手动完成。由于该检测在SBS板上进行，因此可在高通量筛选中使用更先进的自动化液体处理系统。然而，在将液体处理仪器系统进行适配时，需格外注意确保移液吸头不接触生物传感器表面，以免造成生物传感器的损坏。
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披露
Steven M. Shamah 是 X-BODY Biosciences 的员工。
致谢
作者感谢耶鲁大学Fred Sigworth博士实验室的杨杨 Yan博士慷慨提供了稳定表达大鼠Slack-B蛋白的HEK293细胞 。此外，作者感谢Sigworth博士在视频引言中提供的Slack蛋白的冷冻电子显微镜同源建模结构。 本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助L.K.K.的项目DH067517和NS073943的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM，高葡萄糖 | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz L-15 培养基 | Life Technologies | 11415-064 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | |
| 遗传霉素 G-418 硫酸盐 | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| 人血浆来源的纤维连接蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 鸡蛋清来源的白蛋白 | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line 相差血细胞计数板 | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| 氯化卡巴胆碱 | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 三氟乙酸盐 | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette（5–50 µl） | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND 扫描系统 | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384 孔二氧化钛（TiO2）包被板 | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
参考文献
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B.
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重印与许可
