Endothelial Cell Tube Dannelse Assay for Published: September 1, 2014 doi: 10.3791/51312

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Katie L. DeCicco-Skinner¹, Gervaise H. Henry¹, Christophe Cataisson², Tracy Tabib¹, J. Curtis Gwilliam¹, Nicholas J. Watson¹, Erica M. Bullwinkle¹, Lauren Falkenburg¹, Rebecca C. O'Neill¹, Adam Morin¹, Jonathan S. Wiest²

¹Department of Biology, American University, ²Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

Summary

Røret dannelse analysen er en rask, kvantifiserbare metode for å måle in vitro angiogenese. Endotelceller er kombinert med kondisjonert media og sådd ut på basalmembran ekstrakt. Tube dannelsen oppstår i løpet av timer og nydannede tubuli lett kvantifisert.

Abstract

Angiogenese er en viktig prosess for normalt vev utvikling og sårheling, men er også forbundet med en rekke patologiske tilstander. Ved hjelp av denne protokollen, kan angiogenese kan måles in vitro i en rask, kvantifiserbar måte. Primære eller udødeliggjorte endotelceller er blandet med kondisjonert media og sådd ut på basalmembran matrise. De danner kapillære endotelceller lignende strukturer som reaksjon på angiogene signaler som finnes i betingede media. Røret dannelsen skjer raskt med endotelceller begynner å justere seg selv innen 1 time og lumen holdige tubuli begynner å dukke opp i løpet av 2 timer. Rør kan visualiseres ved hjelp av et fasekontrast invertert mikroskop, eller cellene kan behandles med calcein AM forut for analysen og rør visualisert ved fluorescens eller konfokal mikroskopi. Antallet grensider / noder, slep / maskene, eller antallet eller lengden av rør som dannes kan lett bli kvantifisert som et mål på in vitro angiogenese. I sammendrag, kan denne analysen anvendes for å identifisere gener og trasé som er involvert i å fremme eller inhibering av angiogenese i en rask, reproduserbar og kvantitativ måte.

Introduction

Angiogenese, utvikling av nye blodkar fra hatt kontakt fartøyer, er viktig for en rekke prosesser, inkludert organveksten, embryoutvikling, sårheling og ^1-3. Nyutviklet blodkar, omgitt av endotelceller, gi oksygen og næringsstoffer til vev, fremme immun overvåking av blodkreft cellene og fjerner avfallsstoffer ^2,4. Angiogenese er av sentral betydning under embryonal og fosterutvikling. Imidlertid gjenstår denne prosessen sovende i voksen unntatt i tider med sårtilheling, skjelettvekst, graviditet eller i løpet av menstruasjonssyklusen ^1-3.

I løpet av de siste to tiårene, har viktige molekylære mekanismer som regulerer angiogenese begynt å dukke opp. Angiogenese er et tett regulert hendelse, balansert med pro og antiangiogenic signaler inkludert inte, kjemokiner, angiopoietins, oksygen sensing agenter, junctional molekyler og endogene hemmere ^fem. Når proangiogenic signaler som basis fibroblast vekstfaktor (bFGF), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) og epidermal vekstfaktor (EGF) aktivere endotelial cellereseptorer endotelceller frigi proteaser å nedbryter basalmembraner. Endotelceller deretter spre seg og migrere, danner spirer med en hastighet på flere millimeter per dag ^6,7.

Angiogenese er forbundet med forskjellige patologiske tilstander, inkludert kreft, psoriasis, diabetisk retinopati, artritt, astma, autoimmune sykdommer, infeksjonssykdommer og aterosklerose ^8-10. På grunn av viktigheten av angiogenese i forskjellige sykdommer, forstå gener og trasé som regulerer denne prosessen er kritisk for utforming av bedre terapeutika.

Røret dannelse analysen er rask og kvantitativ metode for bestemmelse av gener eller veier som er involvert i angiogenese. Først beskrevet i 1988,prinsippene denne analysen er at endotelceller beholder evnen til å dele seg og migrere raskt i respons til angiogenetiske signaler ^11-13. Videre er endotelceller induseres til å differensiere og danne rør-lignende strukturer når dyrket på en matrise av basalmembran-ekstrakt (BME). Disse rørene inneholder en lumen omgitt av endotelceller knyttet sammen gjennom junctional komplekser. Tube dannelse skjer raskt med de fleste rør som danner i denne analysen innen 2-6 timer, avhengig av mengde og type av angiogene stimuli.

Flere typer av endotelceller kan anvendes for denne analysen inkludert både primærceller og udødeliggjorte cellelinjer ^14,15. Den cellelinje som brukes for denne artikkelen ble mus 3B-11, men den samme metode kan brukes med andre endotel-cellelinjer så som SVEC4-10 (mus) eller primære endotelceller som HUVEC (humane) celler. Avhengig av hvilken cellelinje som brukes, og hvorvidt endotel-ceLLS er transformert eller ikke-transformerte, vil optimalisering må gjennomføres for å identifisere den ideelle tiden som er nødvendig for riktig røret formasjon.

Protocol

1. Innsamling av kondisjonerte medie å teste for angiogenetiske Potential

1. Grow primære eller udødeliggjorte celler til å bli testet for angiogent eller antiangiogene potensial i native eller lave serum media og samle den betingede media.
   1. Alternativt bruk kondisjonerte media umiddelbart, eller alikvoteres og lagres ved -80 ° C i flere måneder. Bruk nonconditioned opprinnelig lavt eller serum-mediet som en negativ kontroll, og bruker ikke-betinget komplett vekstmedium (10% FBS, eller passende konsentrasjon) som en positiv kontroll. Alternativt, for å teste potensielle Stimulatorer av angiogenese, supplement trekull strippet medier som mangler vekstfaktorer med kjente konsentrasjoner av spesifikke proteiner av interesse, og i forhold til vekstfaktor frie media alene.

2. Fremstilling av endotelceller før analysen

1. To dager før analysen passasje 3B-11 celler inn i en ny T-75 kolbe. Passasje antall celler er viktig. Denne analysen fungerer best når cellene er mellom det andre og sjette passasjer. Analysen vil ikke fungere godt hvis endotelceller blir brukt før den andre eller etter den tiende passasje.
2. Dyrk celler i 24 timer i DMEM supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
3. En dag forut for analysen, serum sulte 3B-11-celler som følger:
   1. Aspirer medier fra 3B-11 celler.
   2. Legg redusert serum media av DMEM supplert med 0,2% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
   3. Dyrk celler i ytterligere 24 timer.

3. Forberedelse av reagenser før analysen

MERK: BME konsentrasjonene er svært variabel avhengig av mye. BME ikke fungerer godt dersom konsentrasjonen er mindre enn 10 mg / ml, derfor BME produsenten bør kontaktes før kjøp for å sikreKjøpet av en tilstrekkelig konsentrert mye.

1. Tining redusert vekstfaktor BME i kjøleskapet. BME størkner når varm, slik at den må holdes kald før bruk. BME kan lagres under kjøling i et par uker, eller alikvoteres og fryses ved -80 ° C.
2. En redusert vekstfaktor BME er foretrukket fremfor tradisjonelle BME. Mangelen av angiogene faktorer i BME vil gjøre det lettere å observere effekten at faktorer fra de betingede media har på røret formasjon.
3. Tine media som skal testes.

4. Fremstilling av endotelceller Umiddelbart før analysen

1. Vask 3B-11 celler i DPBS.
   1. Hvis visualisering med fluorescens eller konfokal mikroskopi er ønskelig, før vask 3B-11 celler tilsettes calcein AM til de endoteliale cellene i medier ved en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml. Plasser calcein merkede celler i mørke ved 37 ° C og 5% CO ₂ før starten av analysen. Oppløse lager calceinAM i DMSO og når calcein er fortynnet i media sluttkonsentrasjonen av DMSO ikke overstige 0,1%. Etter 30-45 min vask calcein AM fra cellene (trinn 4.1 ovenfor) og fortsette med forsøket følger.
2. Trypsinize celler ved å tilsette 1 ml trypsin-EDTA i T-75 kolbe.
3. Etter trypsinering er fullført, nøytralisere trypsin ved resuspendering av celler til et sluttvolum på 10 ml i DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
4. Filtrer celler gjennom 100 mikrometer celle sil for å fjerne klumper.
5. Tell cellene og resuspender cellene til en sluttkonsentrasjon på 7,5 x 10 ⁶ celler / ml i DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrium pyruvat, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.

5. Tube Dannelse Assay

1. Plasser 24-brønns plate og 1 ml tips i kjøleskap eller på is for 20-30 min før du legger platen slik at BME ikke Prematurely stivne.
2. Pipetter 250 pl av redusert vekstfaktor BME inn i hver brønn av en 24-brønns plate. Unngå å skape bobler ved å ikke trykke pipetten til sin endelige stopp mens dispensering. Pass på at tilstrekkelig BME fremdeles sentrum av brønnen når menisken former; dersom matrisen er for tynt, vil cellene bare danne et monosjikt.
3. Inkuber i 24-brønners plate ved 37 ° C og 5% _CO2 i 30 minutter for å stivne BME.
4. Når BME er angitt, blandes ca 300 pl av conditioned media med 10 mL av resuspenderte 3B-11 celler (ca. 75.000 celler).
   1. Juster volumet på conditioned media og antall celler belagt avhengig av endotelial celletype som brukes, og teste de serielle fortynninger av de betingede media for å demonstrere aktivitet. Ved sammenligning av celler dyrket under forskjellige betingelser, normal conditioned media volumet til det antall celler som ble brukt til å kondisjonere mediet.
5. Rør will begynner å dannes i løpet av 2-4 timer. Avhengig av angiogen faktor-konsentrasjonen i det kondisjonerte mediet, kan topprøret dannelse forekomme mellom 3 og 12 timer, og timingen av analysen må bli optimalisert. Ved å arbeide med primære endotelceller i stedet for udødeliggjorte celler, kan første rør dannelse forsinkes med flere timer.
   1. Rør vil ofte begynne å svekkes innen 18 hr og endotelceller vil gjennomgå apoptose.
6. På tidspunktet for peak tube formasjon, å nøye aspirer media fra brønnen unngå å forstyrre tube nettverk på BME.
   1. Vask hver brønn med 1 ml DPBS, deretter aspirer.
      1. For umiddelbar visualisering, tilsett 1 ml friske DPBS til hver brønn og bilde røret nettverk ved hjelp av en invertert mikroskop festet til et digitalt kamera, eller fluorescens / konfokal mikroskop hvis cellene ble farget med calcein AM som i 4.1.1.
      2. For å fikse røret nettverk for senere visualisering, og legge til 4% paraformaldehyde til hveraspirert brønn og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
         1. Fjern paraformaldehyde, vask to ganger med DPBS, deretter legge 1 ml friske DPBS til hver brønn.
         2. Mikroskopisk bilde før fikseringen så få rør kan brekke under denne prosedyren.

6. Kvantifisering av Tube Network

1. Tall røret nettverk på flere forskjellige måter, avhengig av undersøkerens ønske, og flere datamaskinprogrammer har evnen til å måle de følgende parametre: antall rør; antall løkker / masker; antall avdelingssider / noder; lengden av rørene.
2. Bruk representant dataprogram som for eksempel bilde J med Angiogenese Analyzer plugin ¹⁶ for kvantifisering av tunnelbanenettverk.

Representative Results

Mus 3B-11 endoteliale celler ble utsådd på størknede reduserte vekstfaktor BME - i denne analysen, ble produktet Matrigel anvendes - og fulgt over tid. Som vist i figur 1, angiogene faktorer utskilt av enten mus keratinocytter eller fibroblaster er i stand til å indusere dannelsen rør over tid. Endotelceller migrere og begynner å danne små greiner innen 1-2 timer av platekledning. Maksimal tube formasjonen ble nådd med 4-6 timers hjelp betingede media tidligere innhentet fra keratinocytter. Ved 24-timers, forble noen grener, men mange av cellene ble apoptotisk og rør begynte å koble fra.

Celle nummer har en betydelig innflytelse på tube dannelse (figur 2). Når et tilstrekkelig antall celler blir sådd på matrisen, få rørene danner, og nettverket er minimal. Ettersom flere celler er sådd, blir røret nettverket mer omfattende. Imidlertid, ved for høy for en konsentrasjon, cellene begynner å klumpe seg eller dannemonolagene, og forskjeller mellom behandlingsgruppene blir maskert.

Tube formasjon med 3B-11 celler fungerer best med celler mellom andre og sjette passasjer. Etter den sjette passasje, ikke celler danner så omfattende et nettverk; celler vil ikke danne noen større nettverk etter den tiende passasje. Celler bør ha et minimum av to passasjer etter gjenopplive fra flytende nitrogen-lagring for å sikre tilstrekkelig røret formasjon (fig 3). Veksten av 3B-11 er så hurtig at 25% av cellene passaged en dag vil gi en sammenflytende kolbe følgende dag.

Bilder kan lett dokumenteres gjennom fase kontrast mikroskopi ved hjelp av mål mellom 4X og 20X. Imidlertid, hvis fluorescerende bilder er ønskelig, calcein AM kan tilsettes og røret nettverket visualisert ved fluorescens eller konfokal mikroskopi (figur 4). Det finnes flere forskjellige måter å oppdage og kvantifisere tube nettverksdannelse. Den vanligste methods for analyse innebærer kvantifisering av antall rør, noder, løkker / maskene, eller lengden på rør. Disse parametrene kan telles for hånd eller kan gjøres gjennom ulike bildebehandlingsprogrammer, inkludert NIH ImageJ med Angiogenese Analyzer plugin. Eksempler på hver av disse typer av analysen er vist i figur 4.

Figur 1. Mus 3B-11 endotelcelle røret dannelse over tid. Totalt 1 x 10 ⁵ celler ble utsådd pr brønn på redusert vekstfaktor BME med 350 ul kondisjonert media fra enten fibroblaster eller keratinocytter. Tube formasjonen ble spilt inn i løpet av 24 timer.

< Br /> Figur 2. Effekten av celletallet på endotelcelle røret formasjon. 3B-11-celler ble utsådd i brønner ved konsentrasjoner som strekker seg fra 5 x oktober ⁴ til 2 x 10 ⁵ med 350 pl av fibroblast eller keratinocytt kondisjonerte media, og deretter fulgt over tid. Legg merke til mangelen på røret dannelse i brønnene belagt med 5 x 10 ⁴ celler og samles av cellene i brønnene belagt med 2 x 10 ⁵ celler.

Figur 3. Effekt av passasjen tall på endotelcelle røret formasjon. Totalt 1 x 10 ⁵ celler ble utsådd pr brønn på redusert vekstfaktor BME ved passasje 0, 1 eller 2. lille rør dannelse ble observert før passasje 2.

4 "fo: content-width =" 5in "src =" / filer / Ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 4. Fluorescens mikros avbildning og kvantifisering av røret formasjon. Før starten av analysen, kan de endoteliale cellene behandles med calcein AM for å visualisere cellene ved hjelp av fluorescens eller konfokal mikroskopi. Det har vært rapportert flere fremgangsmåter for kvantifisering av det dannede røret nettverket, herunder å telle antall rør, løkker / maskene, grensider / noder, eller lengden av rørene. Her viser vi hvordan NIH Image J med Angiogenese plugin programvare kan brukes på en calcein AM farget tube nettverk (A) for å oppdage totale noder (rød) / rør (rosa) / mesh (blå) i kombinasjon (B) og fusjonert på nettverket (C). I tillegg kan dette programmet brukes til å detektere individuelt noder (d), rør (E), eller mesh (F), som deretter kan kvantifiseres (G

Discussion

Angiogenese er involvert i både fysiologiske og patologiske prosesser. Studerer mekanismene som er involvert i angiogenese krever bruk av analysene som rekapitulere de viktigste trinnene i angiogenese. Den endotelcelle røret dannelse assay tilbyr flere fordeler i forhold til andre analyser. Det er lett å sette opp, er relativt billig, produserer tubuli i løpet av timer, og er kvantifiserbare. Videre kan det være ferdig i 24- eller 96-brønners plater, og kan således brukes for høy throughput screening for å identifisere faktorer som stimulerer eller inhiberer angiogenese. Selv om vi brukte 3B-11 muse endotelceller for våre eksperimenter, kan analysen utføres med en rekke humane eller murine endoteliale linjer, inkludert HUVEC og SVEC.

For å utføre en endotelcelle røret dannelse analysen, er endotelceller blandes med kondisjonert media som inneholder pro eller antiangiogenic faktorer og belagt over redusert vekstfaktor basalmembran matrise. Endothelial cellene begynner å justere seg selv innen 1 time og lumen holdige tubuli begynner å vises i løpet av 2 timer. Tube dannelse kan visualiseres ved hjelp av et fasekontrast invertert mikroskop, eller calcein AM kan tilsettes ved avslutningen av analysen og rør visualisert ved hjelp av fluorescens eller konfokal mikroskopi.

Resultatene kan være optimalisert på flere måter. Først bør primærceller være ideelt mellom de andre og sjette passasjer. Ved hjelp av cellene før eller etter den andre den tiende passasje er ikke bidrar til maksimal røret formasjon. For det andre må det cellenummer som skal optimaliseres basert på celletype og linje brukes. For mus 3B-11, har vi funnet maksimal respons ved hjelp 75,000-100,000 celler / brønn i en 24-brønns plate dyrket med muse keratinocytt-og fibroblast-conditioned media. Ved hjelp av for få celler resulterer i minimale eller ingen røret formasjon, og for mange celler resulterer i dannelsen av et monolag eller klumper. Endelig bør mengden av benyttet conditioned media være normalsert med antall celler i stedet for proteinkonsentrasjon. Ved bruk av vanlige medier med 10% FBS, vil FBS stå for mesteparten av proteinkonsentrasjonen målt ved en standard protein-assay. Konsentrasjonen vil se nesten identiske, selv om antallet av celler, og derfor konsentrasjonen av proteiner utskilt under kondisjonering, mellom behandlinger kan være svært variabel.

I sammendrag, er røret dannelse assay en rask, reproduserbar og følsom metode for in vitro måling av angiogenese. Det har fordeler fremfor andre analyser, og er en nyttig metode for å bestemme gener og trasé som potensielt kan spille en viktig rolle i aktivering eller inhibering av angiogenese.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costar 24-well tissue culture-treated plate	Corning	3524
BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced	BD Biosciences	354230
Gibco 0.05% trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Gibco L-glutamine 200 mM (100x)	Life Technologies	25030-081
Gibco pen strep	Life Technologies	15140-122
Gibco DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092
Gibco DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144
Fetal Bovine Serum	Atlas Biologicals	F-0500-A
Calcein AM	Life Technologies	C3100MP
DMSO	ATCC	4-X