Summary
L'essai de formation de tubes est une méthode rapide pour la mesure quantifiable de l'angiogenèse in vitro. Les cellules endothéliales sont combinés avec des milieux conditionnés et étalées sur un extrait de la membrane basale. formation de métro se produit dans les heures et les tubules nouvellement formés facilement quantifiable.
Abstract
L'angiogenèse est un processus essentiel pour le développement normal des tissus et la cicatrisation, mais est également associée à une variété de conditions pathologiques. En utilisant ce protocole, l'angiogenèse peut être mesurée in vitro d'une façon quantifiable rapide. Cellules endothéliales primaires ou immortalisées sont mélangés avec des milieux conditionnés et étalées sur la matrice de la membrane basale. Les cellules endotheliales capillaires forment des structures similaires en réponse à des signaux angiogéniques présents dans des milieux conditionnés. La formation du tube se produit rapidement avec les cellules endothéliales commencent à s'aligner dans 1 heure et tubules contenant lumen-commencent à apparaître dans les 2 heures. Les tubes peuvent être visualisées en utilisant un microscope à contraste de phase inversée, ou les cellules peuvent être traitées avec de la calcéine AM avant l'essai et des tubes visualisé à travers la fluorescence ou microscopie confocale. Le nombre de sites de succursale / nœuds, boucles / mailles, ou le nombre et la durée des tubes formés peuvent être facilement quantifiés comme une mesure de dans vitro angiogenèse. En résumé, ce test peut être utilisé pour identifier les gènes et les voies qui sont impliqués dans la promotion ou l'inhibition de l'angiogenèse d'une manière rapide, reproductible et quantitative.
Introduction
L'angiogenèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est vital pour une variété de procédés, y compris la croissance des organes, le développement embryonnaire et la cicatrisation 1-3. Nouvellement développé des vaisseaux sanguins, bordées de cellules endothéliales, de l'oxygène de l'offre et de nutriments aux tissus, de promouvoir la surveillance immunitaire par des cellules hématopoïétiques et éliminer les déchets 2,4. L'angiogenèse est d'une importance capitale au cours du développement embryonnaire et fœtal. Cependant, ce procédé reste en sommeil chez l'adulte, sauf pendant les périodes de cicatrisation des plaies, la croissance du squelette, la grossesse ou au cours du cycle menstruel 1-3.
Au cours des deux dernières décennies, les mécanismes moléculaires clés qui régulent l'angiogenèse ont commencé à émerger. L'angiogenèse est un événement strictement réglementé, pondérées par les signaux pro et anti-angiogéniques dont les intégrines, chimiokines, angiopoïétines, des agents de détection de l'oxygène, des molécules de jonction et les inhibiteurs endogènes 5. Une fois proangsignaux IOGenic tels que facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF), activent des cellules endothéliales des récepteurs des cellules endotheliales libèrent des proteases à dégrader la membrane basale. Les cellules endothéliales prolifèrent et migrent ensuite, former les germes à une vitesse de quelques millimètres par jour 6,7.
L'angiogenèse est associée à divers états pathologiques y compris le cancer, le psoriasis, la rétinopathie diabétique, l'arthrite, l'asthme, les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses, l'athérosclérose et 10.8. En raison de l'importance de l'angiogenèse dans diverses maladies, comprenant les gènes et les voies qui régulent ce processus est essentiel pour la conception de meilleurs traitements.
L'essai de formation de tubes est une méthode rapide et quantitative pour la détermination des gènes ou des voies impliquées dans l'angiogenèse. D'abord décrit en 1988,les principes sous-jacents de ce test sont des cellules endothéliales qui conservent la capacité de se diviser et de migrer rapidement en réponse à des signaux angiogéniques 11-13. En outre, les cellules endothéliales sont induites à se différencier et à former des structures en forme de tube quand elle est cultivée sur un extrait de la matrice de la membrane basale (BME). Ces tubes contiennent une lumière entourée par les cellules endothéliales reliées entre elles par des complexes de jonction. Tube de formation se produit rapidement avec la plupart des tubes de formage dans cet essai à l'intérieur de 2 à 6 heures selon la quantité et le type de stimuli angiogéniques.
Plusieurs types de cellules endotheliales peuvent être utilisés pour ce dosage comprenant à la fois des cellules primaires et des lignées cellulaires immortalisées 14,15. La lignée cellulaire utilisée pour cet article était souris 3B-11, mais la même méthode peut être appliquée à d'autres lignées de cellules endothéliales, tels que SVEC4-10 (souris) ou des cellules endotheliales primaires, telles que des cellules HUVEC (humaines). En fonction de la lignée cellulaire est utilisée et si le CE endothélialells sont transformés ou non transformés, l'optimisation devra être menée afin d'identifier le moment idéal nécessaire à la formation correcte de la sonde.
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Protocol
1 Collection de milieux conditionnés pour tester angiogénique potentiel
- Cultiver les cellules primaires ou immortalisées à être testé pour le potentiel angiogénique ou anti-angiogénique dans les médias sériques natives ou faibles et de recueillir le milieu conditionné.
- En variante, l'utilisation immédiatement milieu conditionné, ou de portions aliquotes et stocké à -80 ° C pendant plusieurs mois. Utiliser les médias de sérum natif ou faible nonconditioned comme contrôle négatif, et utiliser les médias non-conditionné complète la croissance (10% de FBS, ou concentration appropriée) comme contrôle positif. Sinon, pour tester stimulateurs potentiels de l'angiogenèse, le charbon de supplément médias dépouillé manque de facteurs de croissance avec des concentrations connues de protéines spécifiques d'intérêt et de comparer à facteur de croissance seuls médias libres.
2 Préparation des cellules endothéliales avant l'essai
- Deux jours avant l'essai, le passage 3B-11 des cellules dans un nouveau flacon T-75. nombre de passage de cellules est important. Cet essai est plus efficace lorsque les cellules se trouvent entre les deuxième et sixième passages. Le test ne fonctionne pas bien si les cellules endothéliales sont utilisés avant la deuxième ou après le dixième passage.
- Cultiver les cellules pendant 24 heures dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
- Un jour avant l'essai, le sérum de faim 3B-11 des cellules comme suit:
- Aspirer le milieu des cellules 3B-11.
- Ajouter un média de sérum réduit de DMEM supplémenté avec 0,2% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
- Cultiver les cellules pour un 24 heures supplémentaires.
3 Préparation des réactifs avant l'essai
REMARQUE: Les concentrations sont très variables BME dépend beaucoup. BME ne fonctionne pas bien si la concentration est inférieure à 10 mg / ml, par conséquent, le fabricant BME doit être mis en contact avant l'achat pour s'assureracquisition d'un lot concentré de manière adéquate.
- Dégivrage réduit le facteur de croissance BME dans le réfrigérateur. BME se solidifie à chaud, donc il doit être conservé au froid avant de l'utiliser. BME peut être stocké au réfrigérateur pendant quelques semaines, ou aliquote et congelé à -80 ° C.
- Un facteur de croissance réduit BME est préféré au BME traditionnel. L'absence de facteurs angiogéniques dans le BME, il sera plus facile d'observer l'effet que les facteurs des milieux conditionnés ont sur la formation du tube.
- Médias dégel à tester.
4 Préparation des cellules endothéliales Immédiatement avant l'essai
- Laver 3B-11 cellules dans du DPBS.
- Si la visualisation de la fluorescence ou microscopie confocale est désirée, avant de laver les cellules 11-3B, la calcéine AM ajouter aux cellules endothéliales dans un milieu à une concentration finale de 2 ug / ml. Placer les cellules marquées calcéine dans l'obscurité à 37 ° C et 5% de CO 2 avant le début de l'essai. Dissoudre actions calcéineAM dans du DMSO et une fois la calcéine est diluée dans des milieux concentration finale de DMSO ne doit pas dépasser 0,1%. Après 30-45 min lavage calcéine AM à partir des cellules (étape 4.1 ci-dessus) et poursuivre l'expérience suivante.
- Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine-EDTA pour flacon T-75.
- Après traitement à la trypsine est terminée, neutraliser la trypsine en remettant en suspension les cellules dans un volume final de 10 ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
- cellules de filtre à travers 100 um cellule passoire pour éliminer les grumeaux.
- Compter les cellules et remettre les cellules à une concentration finale de 7,5 x 10 6 cellules / ml dans du DMEM, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
5 Tube Formation Assay
- Placez plaque à 24 puits et 1 ml conseils au réfrigérateur ou sur de la glace pendant 20-30 minutes avant de charger la plaque afin que le BME ne Prem pasaturely solidifier.
- Pipeter 250 ul de facteur de croissance réduit BME dans chaque puits d'une plaque à 24 puits. Éviter de créer des bulles par pas appuyer sur la pipette pour son dernier arrêt lors de la distribution. Veillez à ce que suffisamment de BME reste au centre du puits lorsque les formes de ménisque; si la matrice est trop mince, les cellules ne forment une monocouche.
- Incuber la plaque à 24 puits à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 minutes pour solidifier BME.
- Une fois BME a mis, mélanger environ 300 pi de milieu conditionné avec 10 pi de remises en suspension 3B-11 cellules (environ 75 000 cellules).
- Ajuster le volume de milieu conditionné et le nombre de cellules ensemencées en fonction du type de cellule endothéliale utilisé, et tester les dilutions en série du milieu conditionné pour démontrer l'activité. Si on compare les cellules cultivées dans des conditions différentes, normaliser conditionné volume de support pour le nombre de cellules qui ont été utilisées pour conditionner le support.
- Tubes will commencent à se former dans les 2-4 heures. En fonction de la concentration en facteur angiogénique dans le milieu conditionné, la formation de tubes de crête peut se produire entre 3 et 12 heures et le temps de l'essai devra être optimisé. Si vous travaillez avec des cellules endothéliales primaires au lieu de cellules immortalisées, la formation du tube initial peut être retardée de plusieurs heures.
- Tubes commencent souvent à se détériorer dans les 18 cellules endothéliales h et fera l'objet d'apoptose.
- Au moment de la formation du tube de pointe, les médias soigneusement aspirer du puits pour éviter de perturber le réseau de métro sur le BME.
- Laver chaque puits avec 1 ml DPBS, puis aspirer.
- Pour une visualisation immédiate, ajouter 1 ml de DPBS frais à chaque réseau de tubes et ainsi l'image en utilisant un microscope inversé fixé à un appareil photo numérique, ou fluorescence / microscope confocal si les cellules ont été colorées avec la calcéine AM comme au point 4.1.1.
- Pour fixer le réseau de métro pour la visualisation plus tard, et ajouter 4% de paraformaldéhyde à chaqueainsi aspiré et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Retirer paraformaldéhyde, laver deux fois avec DPBS, puis ajouter 1 ml DPBS frais à chaque puits.
- Microscope l'image avant la fixation de quelques tubes peuvent se briser au cours de cette procédure.
- Laver chaque puits avec 1 ml DPBS, puis aspirer.
6 Quantification de réseau de métro
- Quantifier le réseau de tubes de différentes manières en fonction des préférences de l'enquêteur, et plusieurs programmes informatiques ont la capacité de mesurer les paramètres suivants: nombre de tubes; nombre de boucles / mailles; nombre de sites de succursale / nœuds; longueur de tubes.
- Utilisez programme informatique représentant tels que Image J avec le plugin Analyzer angiogenèse 16 pour la quantification des réseaux de tubes.
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Representative Results
3B-11 de souris les cellules endothéliales sont ensemencées sur solidifié facteur de croissance réduit BME - dans cet essai, le produit de Matrigel a été utilisé - et suivie au cours du temps. Comme le montre la Figure 1, des facteurs angiogéniques sécrétés par soit des kératinocytes ou des fibroblastes de souris sont capables d'induire la formation de tubes dans le temps. Les cellules endothéliales migrent et commencent à former de petites branches dans 1-2 heures de placage. La formation du tube maximum a été atteint par 4-6 heures en utilisant des milieux conditionnés obtenus précédemment à partir de kératinocytes. En 24 heures, certaines branches sont restées, mais la plupart des cellules sont devenues apoptotique et tubes ont commencé à se déconnecter.
Le nombre de cellules a un impact profond sur la formation du tube (figure 2). Quand un nombre suffisant de cellules sont ensemencées sur la matrice, quelques tubes forment et le réseau est minime. En plus de cellules sont ensemencées, le réseau de tube devient plus vaste. Cependant, à trop forte concentration, les cellules commencent à s'agglomérer ou à formermonocouches, et les différences entre les groupes de traitement deviennent masqué.
la formation de tubes par les cellules 11-3B qui fonctionne le mieux avec les cellules entre les deuxième et sixième passages. Après le sixième passage, les cellules ne forment pas aussi étendue d'un réseau; cellules ne forment pas un réseau important après le dixième passage. Les cellules doivent avoir un minimum de deux passages après la relance de stockage d'azote liquide afin d'assurer la formation de tubes adéquats (figure 3). Le taux de 3B-11 la croissance est si rapide que 25% des cellules des passages pourront prendre un jour donner un ballon de confluence le jour suivant.
Les images peuvent être facilement documentées par microscopie à contraste de phase en utilisant objectifs entre 4X et 20X. Cependant, si l'on souhaite des images fluorescentes, la calcéine AM peut être ajouté et le réseau de tube visualisée par fluorescence ou microscopie confocale (figure 4). Il ya plusieurs façons de détecter et de quantifier la formation du réseau de métro. La métho plus couranteds d'analyse comportent quantification de nombre de tubes, les noeuds, des boucles ou mailles / longueur des tubes. Ces paramètres peuvent être comptés à la main ou peut se faire grâce à divers programmes d'imagerie, y compris les NIH ImageJ avec le plugin Analyzer angiogenèse. Des exemples de chacun de ces types d'analyse sont présentés dans la figure 4.
La figure 3B-1 de souris 11 formation de tubes de cellules endotheliales au cours du temps. Un total de 1 x 10 5 cellules par puits ont été ensemencées sur le facteur de croissance réduite BME avec 350 ul de milieu conditionné provenant soit des fibroblastes ou des kératinocytes. formation de métro a été enregistré au cours des 24 heures.
< br /> Figure 2: Effet du nombre de cellules sur la formation de tubes de cellules endotheliales. 3B-11 cellules ont été ensemencées dans des puits à des concentrations allant de 5 x 10 4 à 2 x 10 5 à 350 ul de fibroblastes ou de médias de kératinocytes conditionnée, puis puis au fil du temps. Notez l'absence de la formation de tubes dans les puits ensemencées avec 5 x 10 4 cellules et l'encombrement des cellules étalées dans les puits avec 2 x 10 5 cellules.
Figure 3 L'effet du nombre de passages sur la formation de tubes de cellules endotheliales. Au total, 1 x 10 5 cellules par puits ont été ensemencées sur le facteur de croissance réduite BME passage à 0, 1, 2 ou peu la formation des tubes a été observée avant le passage 2.
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Figure 4 imagerie par microscopie de fluorescence et la quantification de la formation du tube. Avant le début de l'essai, les cellules endotheliales peuvent être traités avec la calcéine AM, afin de visualiser les cellules en utilisant la fluorescence ou microscopie confocale. Il ya eu plusieurs méthodes déclarés pour quantifier le réseau de tube formé, y compris en comptant le nombre de tubes, boucles / mailles, des succursales / nœuds, ou la longueur de tubes. Ici, nous montrons comment NIH Image J avec le logiciel plug-in angiogenèse peut être utilisé sur un calcéine AM réseau de tubes teinté (A) pour détecter des nœuds au total (rouge) / tubes (rose) / maille (bleu) en combinaison (B) et fusionné le réseau (C). En outre, ce programme peut être utilisé pour détecter individuellement les noeuds (D), (E) des tubes, ou un treillis (F), qui peut ensuite être quantifié (G
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Discussion
L'angiogenèse est impliquée dans les processus physiologiques et pathologiques. Les mécanismes impliqués dans l'angiogenèse étude nécessite l'utilisation de dosages qui récapitulent les principales étapes de l'angiogenèse. L'essai de formation de tubes de cellules endotheliales offre plusieurs avantages par rapport à d'autres essais. Il est facile à mettre en place, est relativement peu coûteux, produit tubules en quelques heures, et est quantifiable. En outre, il peut être complété en 24 ou plaques à 96 puits, et peut donc être utilisé pour le criblage à haut débit pour identifier les facteurs qui stimulent ou inhibent l'angiogenèse. Bien que nous avons utilisé 3B-11 des cellules endotheliales de souris de nos expériences, le dosage peut être effectué avec une variété de lignées endothéliales humaines ou murines, y compris les cellules HUVEC et SVEC.
Pour effectuer un essai de formation de tubes de cellules endotheliales, les cellules endotheliales sont mélangés avec un milieu conditionné contenant des facteurs pro-angiogéniques et plaqué ou plus de facteur de croissance de la matrice de membrane basale réduite. Endothelicellules al commencent à s'aligner dans 1 heure et tubules contenant lumen-commencent à apparaître dans les 2 heures. la formation de tubes peut être visualisé en utilisant un microscope à contraste de phase inversée, la calcéine AM ou peuvent être ajoutés à la fin de l'essai et des tubes visualisé par fluorescence ou microscopie confocale.
Les résultats peuvent être optimisés de plusieurs manières. Tout d'abord, des cellules primaires doivent être idéalement entre les deuxième et sixième passages. En utilisant des cellules avant ou après la deuxième passage est le dixième de ne pas favoriser la formation maximale du tube. En second lieu, le nombre de cellules doit être optimisé en fonction du type de cellule utilisée et la ligne. Pour les souris 3B-11, nous avons trouvé la réponse maximale à l'aide 75,000-100,000 cellules / puits dans une plaque à 24 puits avec des kératinocytes cultivés de la souris et des médias conditionné de fibroblastes. Utilisation de trop peu de cellules dans les cellules résulte des résultats minimaux ou pas de formation de tube, et un trop grand nombre de formation d'une monocouche ou d'agglutination. Enfin, la quantité de milieu conditionné utilisé doit être normallisés à la place du nombre de cellules de la concentration en protéine. Si l'utilisation des médias normales avec 10% de FBS, les FBS représenteront la majorité de la concentration en protéines mesurée au moyen d'un dosage de protéine standard. La concentration semblera presque identiques, même si le nombre de cellules, et par conséquent, les concentrations des protéines sécrétées pendant le conditionnement, entre les traitements peuvent être très variables.
En résumé, l'essai de formation de tubes est une méthode rapide, sensible et reproductible pour la mesure in vitro de l'angiogenèse. Il présente des avantages sur d'autres dosages et un procédé utile pour déterminer les gènes et les voies qui jouent potentiellement un rôle important dans l'activation ou l'inhibition de l'angiogenèse.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros de l'Institut national du cancer des Instituts nationaux de la santé, et par le NCI accorder UA5CA152907.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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