Summary
管形成アッセイは、 インビトロ血管新生を測定するための高速、定量可能な方法である。内皮細胞は、馴化培地と混合し、基底膜抽出物でメッキされる。管形成は容易に定量時間と新たに形成された細管内で発生する。
Abstract
血管新生は、正常な組織発達および創傷治癒に不可欠なプロセスであるが、病理学的状態の多様な関連付けられている。このプロトコルを使用して、血管形成は、高速、定量化可能な方法でインビトロで測定することができる。一次または不死化内皮細胞馴化培地と混合し、基底膜マトリックス上に播種される。内皮細胞は、馴化培地中に見出さ血管新生信号に応答して、毛細血管様構造を形成する。管形成は、内皮細胞は、1時間とルーメンを含む細管を2時間以内に出始め以内に自分自身を整列し始めてすぐに発生します。チューブは、位相差倒立顕微鏡を用いて可視化することができ、または細胞が、蛍光または共焦点顕微鏡を介して可視化アッセイチューブに先立っカルセインAMで処理することができる。ブランチサイト/ノードの数は、/メッシュをループし、または形成された管の数または長さを容易にvitrでの測定値として定量化することができるO血管新生。要約すると、このアッセイは、迅速な再現可能な、そして定量的に血管形成の促進または阻害に関与する遺伝子および経路を同定することができる。
Introduction
血管新生、既存血管からの新しい血管の発達は、1〜3治癒 、器官の成長、胚発生、創傷を含めた多様なプロセスに不可欠である。新組織に内皮細胞、供給酸素と栄養が並ん血管を開発し、造血細胞による免疫監視を促進し、老廃物2,4を削除します。血管新生は、胚および胎児の発生の間に極めて重要である。しかしながら、この方法は、創傷治癒、骨格の成 長、妊娠や月経周期1-3時の回の中を除いて、成人に休眠残る。
最後の20年間、血管新生を制御する重要な分子機構が出現し始めている。血管新生は、インテグリン、ケモカイン、アンジオポエチン、酸素検知剤、接合部の分子と内因性阻害5を含むプロと抗血管新生シグナルでバランスが厳密に調節イベントです。 proangいったんそのような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、および上皮成長因子（EGF）などのイオ起源の信号は、内皮細胞は、内皮細胞が基底膜を分解するプロテアーゼを放出するレセプター活性化する。内皮細胞はその後増殖し、遊走、6,7日あたり数ミリメートルの速度で芽を形成する。
血管新生は、癌、乾癬、糖尿病性網膜症、関節炎、喘息、自己免疫疾患、感染症、およびアテローム性動脈硬化症8-10を含むさまざまな病的状態と関連している。による各種疾患における血管新生の重要性は、このプロセスは、より良い治療法の設計に重要である調節遺伝子および経路を理解する。
管形成アッセイは、血管形成に関与する遺伝子または経路を決定するための迅速かつ定量的な方法である。まず1988年に記載され、このアッセイの基礎をなす原則は、内皮細胞が分裂し、血管新生シグナルに応答11-13に急速に移行する能力を保持するということである。さらに、内皮細胞は分化し、基底膜抽出物（BME）のマトリックス上で培養管様構造を形成するように誘導される。これらの管は、接合部複合体により連結内皮細胞に囲まれた内腔を含んでいる。管形成はほとんどのチューブ量及び血管新生の刺激の種類に応じて2〜6時間以内に、このアッセイにおいて形成で迅速に起こる。
内皮細胞のいくつかのタイプの初代細胞および不死化細胞株14,15の両方を含むこのアッセイのために使用することができる。この記事に使用される細胞株は、マウス3B-11であったが、同じ方法論は、HUVEC（ヒト）細胞のようなSVEC4-10（マウス）のような他の内皮細胞株または初代内皮細胞と適用することができる。細胞株が使用されるかに依存し、内皮CEのかどうかLLSは、形質転換または非転換され、最適化は、適切な管形成に必要な理想的な時間を同定するために実施される必要がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
血管新生の可能性をテストするために調節された媒体の1集
- ネイティブまたは低血清培地中での血管新生または抗血管新生の可能性について試験されるべき一次または不死化細胞を増殖し、馴化培地を収集します。
- あるいは、使用がすぐに馴化培地、または等分し、数ヶ月間-80℃で保存した。ネガティブコントロールとしてnonconditioned天然又は低血清培地を使用し、ポジティブコントロールとしての非馴化完全な増殖培地（10％のFBS、または適切な濃度）を使用します。あるいは、血管新生の潜在的な刺激物質をテストするために、関心のある特定のタンパク質の既知の濃度の成長因子を欠いているサプリメントチャコール処理メディアだけでは、成長因子を含まない培地と比較します。
アッセイの前に内皮細胞の調製
- アッセイの2日前に、新しいT-75フラスコ内に通路3B-11細胞。細胞の継代数は重要です。細胞は第二と第六の通路の間にある場合、このアッセイは、最も効果的に機能します。アッセイは、内皮細胞は第二の前または第十経過した後に使用されている場合にはうまく機能しません。
- 10％FBS、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で24時間細胞を成長させる。
- 以下のようにアッセイの1日前に、血清は3B-11細胞を飢え：
- 3B-11細胞から培地を吸引。
- DMEMの追加低減血清培地は、0.2％のFBS、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを補充した。
- さらに24時間細胞を成長させる。
アッセイの前に試薬の調製
注：BME濃度は、多くの依存性の高い変数である。濃度がそのためBMEメーカーが保証するために購入前に連絡する必要があり、10mg未満/ mlである場合にはBMEはうまく動作しません十分に集中し、多くの買収。
- デフロストは、冷蔵庫に成長因子BMEを減少させた。時暖かいBMEが固化するので、使用前に風邪に保つ必要があります。 BMEは、数週間の冷蔵保存、あるいは等分し、-80℃で凍結することができる。
- 成長因子低減BMEは、従来のBMEより好ましい。 BMEにおける血管新生因子の欠如は、簡単に条件培地からの要因が管形成に与える影響を観察するようになります。
- 解凍メディアがテストされる。
アッセイの直前に、内皮細胞の4。準備
- ウォッシュDPBS中3B-11細胞。
- 蛍光または共焦点顕微鏡による可視化が所望される場合、3B-11細胞を洗浄する前に、2μg/ mlの最終濃度で培地中の内皮細胞へのカルセインAMを加える。アッセイの開始前に37℃および5％CO 2の暗所でカルセイン標識された細胞を配置する。在庫カルセインを溶解DMSOおよびカルセインAMは、一度DMSOの最終濃度が0.1％を超えるべきではない培地で希釈する。細胞（上記のステップ4.1）から30〜45分間洗浄カルセインAMの後、実験は以下の通りに進みます。
- T-75フラスコ1 mlトリプシン-EDTAを加えることによって細胞をトリプシン処理。
- トリプシン処理が完了した後、DMEM中の10ミリリットルの最終体積に細胞を再懸濁することにより、10％のFBS、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンをトリプシンを中和する。
- 100μmのセルストレーナーで濾過して細胞が塊を除去した。
- DMEM中7.5×10 6細胞/ ml、10％FBS、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンの最終濃度で細胞を再懸濁細胞を数える。
5。管形成アッセイ
- BMEはプレムしないようにプレートをロードする前に、24ウェルプレート、冷蔵庫内または20〜30分間、氷上で1ミリリットルのヒントを配置aturely固化する。
- ピペットで24ウェルプレートの各ウェルに減少成長因子BMEを250μl。小出ししながら、最終的な停止にピペットを押下しないことにより、泡を作成しないようにしてください。十分なBMEがうまくの中心メニスカスの形のままであるように注意してください。マトリックスが薄すぎると、細胞は単層を形成する。
- BMEを固めるために30分間37℃で24ウェルプレートをインキュベートし、5％CO 2。
- BMEが設定されると、再懸濁3B-11細胞（約75,000細胞）10μlの馴化培地の約300μlのミックス。
- 馴化培地および使用内皮細胞型に応じて播種した細胞の数のボリュームを調整し、活性を証明するために馴化培地の連続希釈液をテストする。比較セルが異なる条件下で増殖させた場合は、メディアを調整するために使用された細胞の数に馴化培地容積を正規化。
- チューブウィルlは2-4時間以内に形成され始める。馴化培地中の血管新生因子の濃度に依存して、ピーク管形成は、3〜12時間の間に発生し、アッセイのタイミングを最適化する必要がある。代わりに、不死化細胞の一次内皮細胞を扱う場合は、初期管形成は、数時間遅れで表示してもよい。
- チューブは、多くの場合、18時間以内に悪化し始め、内皮細胞はアポトーシスを受ける。
- ピーク管形成の際には、ウェルから慎重に吸引メディアはBME上の管ネットワークの中断を避けるため。
- 1ミリリットルのDPBS、その後吸引して、各ウェルを洗浄する。
- 即時の可視化のために、細胞は、4.1.1のように、カルセインAMで染色した場合には、デジタルカメラ、または蛍光/共焦点顕微鏡に取り付けられた倒立顕微鏡を用いて各ウェルの画像管網に1ミリリットル新鮮なDPBSを追加します。
- 後で視覚化のためのチューブネットワークを修正し、それぞれに4％パラホルムアルデヒドを追加するにはウェルを吸引し、室温で15分間インキュベートする。
- パラホルムアルデヒドを取り外し、DPBSで二回洗浄し、各ウェルに1mLの新鮮なDPBSを追加します。
- 前少数の管のような固定を顕微鏡イメージは、この手順の間に破損する可能性があります。
- 1ミリリットルのDPBS、その後吸引して、各ウェルを洗浄する。
チューブネットワークの6。定量
- 調査者の好みに応じていくつかの異なる方法でチューブネットワークを定量化し、いくつかのコンピュータプログラムは、以下のパラメータを測定する能力を有する。管の数;ループ/メッシュ数;ブランチサイト/ノード数;チューブの長さ。
- そのようなチューブネットワークの定量化のための血管新生アナライザーのプラグイン16と画像jとして代表的なコンピュータプログラムを使用してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マウス3B-11内皮細胞は、固化した成長因子低減BME上に播種した - このアッセイにおいて、生成物マトリゲルを使用した - そして経時的に追跡。 図1に示すように、いずれのマウスのケラチノサイトまたは線維芽細胞によって分泌される血管新生因子は、経時管形成を誘導することができる。内皮細胞は、遊走し、メッキの1〜2時間以内に、小さな枝を形成し始める。最大管形成は、以前にケラチノサイトから得た条件培地を使用して4-6時間で到達した。 24時間では、いくつかの枝が残ったが、細胞の多くは、アポトーシスとなり、管が切断するようになった。
細胞数は、管形成に大きな影響（ 図2）を有している。細胞の数が不十分で、マトリックス上に播種した場合、いくつかの管が形成し、ネットワークは最小限に抑えられます。より多くの細胞を播種するように、チューブネットワークがより広範になる。しかし、濃度が高すぎるでは、細胞が凝集または形成し始める単層を、治療群間の差は、マスクとなる。
3B-11細胞を用いた管形成は、第2及び第六の通路の間の細胞で最適に動作します。第六の継代後、細胞は、広範なネットワークを形成しない。細胞は、第10継代後に大規模なネットワークを形成しません。細胞は適切な管形成（ 図3）を確保するために液体窒素貯蔵から回復させると後の2通路の最小値を有するべきである。 3B-11の成長速度は、細胞の25％が一日の次の日にコンフルエントなフラスコを生じる継代ほど急速である。
画像は容易に4Xおよび20Xの間に目標を使用して、位相差顕微鏡を介して文書化することができる。蛍光画像が所望される場合は、カルセインAMを添加してもよいし、チューブネットワークが蛍光または共焦点顕微鏡検査（ 図4）を介して可視化した。管ネットワークの形成を検出し、定量化するには、いくつかの異なる方法があります。最も一般的なメト分析のdsは、管の数の定量化を伴うノード、ループ/メッシュ、または管の長さ。これらのパラメータは、手動で計数することができる、または血管新生アナライザプラグとNIH ImageJを含むさまざまなイメージングプログラムを介して行うことができる。分析これらのタイプのそれぞれの例は、 図4に示されている。
時間をかけて、図1のマウス3B-11内皮細胞管形成。1×10の合計5個の細胞を、線維芽細胞またはケラチノサイトのいずれかからの馴化培地を350μlの成長因子低減BMEにウェルあたり播種した。管形成を、24時間にわたって記録した。
< brは/> 内皮細胞の管形成に対する細胞数の影響。図が図3B-11細胞は、線維芽細胞またはケラチノサイトの馴化培地を350μlの5×10 4〜2×10 5の範囲の濃度でウェルに播種し、その後経時的に追跡。注ウェル内管形成の欠如は、5×10 4細胞でプレーティングし、ウェル中の細胞の密集は、2×10 5細胞でプレーティングした。
図3内皮細胞管形成における継代数の効果。の合計 1×10 5の細胞を継代0、1で縮小成長因子BMEにウェルあたり播種し、または2リトル管形成は、通路2の前に見られた。
4 "FO：コンテンツ幅=" 5インチ "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 51312 / 51312fig4highres.jpg "幅=" 500 "/>
図4蛍光顕微鏡イメージングおよび管形成の定量。アッセイの開始に先立って、内皮細胞は蛍光または共焦点顕微鏡を用いて細胞を視覚化するために、カルセインAMで処理することができる。管の数をカウントするなど、形成されたチューブのネットワークを定量化するためのいくつかの報告された方法が行われている、/メッシュ、ブランチサイト/ノード、または管の長さをループする。ここでは、組み合わせで、合計のノードを検出するために染色されたチューブネットワーク（A）（赤）/チューブ（ピンク）/メッシュ（青）（B）の AMと合併し新生のプラグインソフトウェアでNIH画像Jはカルセイン上で使用する方法を示しネットワーク上の（C）。さらに、このプログラムは、（F）は、個別ノード（D）、チューブ（E）を検出する、又はメッシュに使用することができる、その後定量化することができる（G
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
脈管形成は生理学的および病理学的プロセスの両方に関与している。血管新生に関与するメカニズムを研究することは、血管新生における主要な工程を再現アッセイの使用を必要とします。内皮細胞のチューブ形成アッセイは、他のアッセイに比べていくつかの利点を提供する。これは、アップを設定することが容易で比較的安価であり、時間内の細管を生成し、かつ定量化可能である。また、24または96ウェルプレートで完了することができ、したがって、血管新生を刺激または阻害する因子を同定するためにハイスループットスクリーニングのために使用することができる。私たちの実験のために3B-11マウス内皮細胞を使用したが、このアッセイは、HUVECおよびSVECを含む、ヒトまたはマウスの内皮細胞株、多様な行うことができる。
内皮細胞管形成アッセイを行うために、内皮細胞は、炎症または抗血管新生因子を含むし、減圧成長因子基底膜マトリックス上にメッキ馴化培地と混合される。 Endotheliらの細胞を1時間以内に自分自身を整列させるために開始し、内腔を有する細管を2時間以内に現れ始める。管形成は、位相差倒立顕微鏡を用いて可視化することができ、又はカルセインAM蛍光または共焦点顕微鏡を用いて可視化アッセイチューブの終了時に添加することができる。
結果は、いくつかの方法で最適化することができる。まず、一次細胞は、第二と第六の通路との間で、理想的であるべきである。前二または第十継代後の細胞を使用すると、最大管形成の助けとなることがされていません。第二に、細胞数は、使用する細胞の種類やラインに基づいて最適化する必要がある。マウス3B-11に関しては、マウスのケラチノサイトおよび線維芽細胞馴化培地を用いて成長させた24ウェルプレート中の75,000-100,000細胞/ウェルを用いて、最大応答を発見した。あまりにも少数の細胞を使用すると、単層または凝集体の形成は最小限あるいは全く管形成、および細胞数が多すぎる結果になる。最後に、使用される条件培地の量は、正常でなければなりません細胞数の代わりにタンパク質濃度化された。 10％FBSを通常のメディアを使用する場合、FBSは、標準的なタンパク質アッセイにより測定し、タンパク質濃度の大部分を占めることになる。濃度は、治療間の細胞数、およびコンディショニング中に分泌されるタンパク質の濃度は、したがって、非常に可変であったとしてもほとんど同じになります。
要約すると、管形成アッセイは、血管形成のインビトロ測定のための、速く、再現可能かつ高感度な方法である。これは、他のアッセイに優る利点があり、潜在的に血管新生の活性化または阻害において重要な役割を果たす遺伝子および経路を決定するための有用な方法である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この研究は、米国立衛生研究所の国立癌研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされており、NCIによってUA5CA152907を付与した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Costar 24-well tissue culture-treated plate | Corning | 3524 | |
| BD Matrigel basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Gibco 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Gibco L-glutamine 200 mM (100x) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Gibco pen strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gibco DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Gibco DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Kerbel, R. S.
- Folkman, J.
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
- Carpentier, G.
