Summary
En dubbelsträngad RNA-interferens (dsRNAi)-teknik används för att nedreglera cinnamoyl majs koenzym A-reduktas (ZmCCR1)-gen av lägre växtligninhalt. Lignin nedreglering från cellväggen visualiseras av mikroskopiska analyser och kvantifieras av Klason-metoden. Kompositionella förändringar av hemicellulosa och kristallin cellulosa analyseras.
Abstract
För att underlätta användningen av lignocellulosa som alternativ bioenergi resurs, under biologiska omvandlingsprocesser, behövs ett förbehandlingssteg för att öppna strukturen hos växtcellväggen, vilket ökar tillgängligheten av cellväggen kolhydrater. Lignin, en polyfenolmaterialet förekommer i många cellväggstyper, är känt för att vara ett betydande hinder mot enzymåtkomst. Minskning av ligninhalten till en nivå som inte stör den strukturella integriteten och försvarssystemet hos växten kan vara en värdefull åtgärd för att minska kostnaderna för bioetanol. I denna studie har vi genetiskt nedregleras en av ligninet biosynthesis relaterade gener, cinnamoyl-CoA-reduktas (ZmCCR1) via en dubbelsträngad RNA-interferens teknik. Den ZmCCR1_RNAi konstruktionen integreras i genomet majs med hjälp av partikelbombardemang metoden. Transgena majsplantor växte normalt i jämförelse med vildtyp kontrollanläggningar utan iterfering med tillväxt biomassa eller försvarsmekanismer, med undantag för visning av brun-färgning i transgena växter blad mitten revben, skal och stjälkar. De mikroskopiska analyser, tillsammans med den histologiska analysen visade att blad sclerenchyma fibrer tunnats men strukturen och storleken på andra stora kärlsystemkomponenter ändrades inte. Halten lignin i transgen majs minskades från 7 till 8,7%, var halten av kristallin cellulosa ökar som svar på lignin reduktion och hemicellulosor förblev oförändrad. Analyserna kan tyda på att koldioxidflöde kan ha flyttats från lignin biosyntesen till biosyntes cellulosa. Denna artikel skisserar de förfaranden som används för att nedreglera innehållet lignin i majs via RNAi-teknik, och cellväggen sammansättningsanalyser används för att kontrollera effekten av ändringarna på cellväggen struktur.
Introduction
Produktionen av biobränslen från lignocellulosa är mycket önskvärt på grund av dess nuvarande överflöd i USA 1, och i fallet med hållbart uttag av jordbruks-och skogsrester, förmågan att inte konkurrera direkt för åkermark som används för livsmedel och foderproduktionen. Men till skillnad från majs korn, vilket är den huvudsakliga källan till biobränsle för närvarande genereras i USA, lignocellulosa material är betydligt mer komplexa och svåra att bryta ner. Förutom den långkedjiga kolhydrater, cellulosa och hemicellulosa, som är de viktigaste källorna till socker under jäsning av lignocellulosa-material, många typer av växtcellväggar även innehåller lignin, en phenylpropanoid polymer som ger styrka, försvar mot patogen attack, och hydrofoba till cellväggarna. Samtidigt som behövs för växternas tillväxt och överlevnad, lignin utgör också ett betydande hinder för en framgångsrik enzymatiska omvandlingen av cellulosa och hemicelluförlorar till lösliga sockerarter. Material med hög lignininnehåll är i allmänhet mindre önskvärda material för både biobränsle (genom biologisk omvandlingsvägar) samt massa-och pappersindustrin på grund av de negativa effekterna på bearbetningsegenskaper och produktkvalitet. Därför kan genetisk manipulation av växtmaterial för lignin minskning på en nivå som inte stör gröda hållfasthet och försvarssystem är viktigt för att minska produktionskostnaderna för både lignocellulosa biobränsle samt massa-och pappersindustrin.
I majs (Zea mays), är lignin kovalent tvärbunden till hemicellulosa i den primära cellväggen via ferulat och diferulate bryggor 2. Ligninet-hemicellulosa komplex binder till cellulosa mikrofibriller genom vätebindningar och bildar en komplex matris som ger integritet och styrka till den sekundära cellväggen. Den mekaniska hållfastheten hos växtcellväggar är till stor del bestäms av den typ av lignin subenheter 3-5. I tidigare studier, att ändra proportionerna av lignin subenheter har inte visat någon tydlig trend på enzymatisk smältbarhet 6-11. Men minskningar av ligninhalt visar generellt en förbättring i omvandlingar 12,13 och kan vara en nyckel till att öka smältbarheten av växtmaterial genom hydrolytiska enzymer inklusive endocellulases, cellobiohydrolaser och β-glukosidaser 14.
Genteknik att reglera uttrycksnivån av transkript har utför praktiseras för att förbättra skärdrag. Avancerade tekniker, inklusive antisens 15 och co-suppression 16 tekniker, möjliggör effektiv nedreglering av mål gener. Komplett gen knock-out har också uppnåtts med användning av genkonstruktioner som kodar för intron splitsat RNA med en hårnålsstruktur 17. Dessutom ett dubbelsträngat RNA-interferens (dsRNAi)-teknik, det vill säga ett kraftfullt och effektivt genuttryck mediator som fungerar genom att antingen rikta transkriptet nedbrytning eller translation förtryck, tillhandahåller ett potent medel för att inducera ett brett spektrum av undertryckande effekt på mål-mRNA 18. Genen som tystar tekniker visar flera begränsningar. Dessa tekniker har inte exakt reglera nivån av transkription och det kan ge upphov till oväntade tystande effekter på andra homologa gener.
Vid denna metod användes vi partikelbombardemang för att bära dsRNAi konstruktioner i genomet majs. Hittills har ett brett spektrum av växtarter framgångsrikt förvandlats med hjälp av partikelbombardemang, Agrobacterium medierad transformation, elektroporation och mikroinjektion metoder. I majs genetisk transformation, är partikelbombardemang metoden fördelaktig över alla andra metoder, eftersom det är det mest effektiva. Partikelbombardemang är inte beroende av bakterier, så metoden är fritt från biologiska begränsningar, till exempel storleken på de Gene, arter av genen ellerigin eller anläggningen genotyp. Den fysiska transgen avgivningssystemet möjliggör högmolekylärt DNA och flera gener som skall införas i växtgenom och i vissa fall in i kloroplaster med hög transformationseffektivitet 19. Reduktionen lignin i det vaskulära systemet hos blad mitten ribba kan visualiseras genom svepelektronmikroskopi (SEM) som är fördelaktigt för prövningen av topografi och sammansättningen av prover.
I majsplantor, två av cinnamoyl-CoA reduktas (ZmCCR1: X98083 och ZmCCR2: Y15069) gener hittades i majsgenomet 20. Cinnamoyl-CoA reduktas katalyserar omvandlingen av hydroxycinnamoyl-CoA-estrar i kanel aldehyder. Vi valde ZmCCR1 genen för att nedreglera detta enzym eftersom genen uttrycks i alla lignifying vävnader. De 523 nukleotidema vid 3'-terminalen av den ZmCCR1 genen valdes för en dsRNAi konstruera eftersom de sekvenser verkade varamer varierande jämfört med dem i ZmCCR2. Därmed skulle dsRNAi konstruktionen exakt binder endast till ZmCCR1, undvika off-target tysta 21. En ZmCCR1_RNAi konstruktion var konstruerad in i cytoplasman expressionssystem ImpactVector1.1-tagg (IV 1.1) som innehåller den gröna vävnadsspecifik promotor, ribulos-1, 5-bisfosfatkarboxylas oxygenas (RUBISCO).
För att studera effekterna av dsRNAi bygga på transgena växter, var ligninhalt kvantifieras. Den Klason (syraolösliga) ligninmätning är känd för att vara mer exakt jämfört med de sura rengöringsmedel lignin kvantifieringsmetoder som solubiliserar en del av ligninet 22. Därför var Klason lignin mätt i transgena majsstjälkar. Detta förfarande består av två led sur hydrolys som omvandlar polymera kolhydrater till lösliga monosackarider 23. Den hydrolyserade biomassan fraktionerades sedan i syra lösliga och olösliga mateALS och syraolösliga lignin mättes i enlighet med tidigare studier 23,24. Helst bör lignin analysen innefatta extraktioner med vatten och etanol före hydrolyssteget, för att avlägsna lösliga material som kan interferera med resultaten, och en efter-hydrolys förbränning av ligninet återstoden stå för all aska som finns i återstoden. Utan dessa steg, kan innehållet i provet lignin vara överdrivna. Den fullständiga metoden presenteras här, men för våra experiment kunde vi inte utföra båda dessa steg på grund av den lilla mängd material tillgängligt för testning
Två andra cellväggskomponenter, cellulosa och hemicellulosa analyserades också i lignin nedregleras linjer transgen majs. Det har rapporterats att transgena växter som har ned-reglerade i antingen deras fenylalanin ammoniak-lyas (PAL) 25, 4-kumarat: CoA-ligas (4CL) 26, eller cinnamyl enlcohol dehydrogenas (CAD) 27 visar en ökning av andra cellvägg strukturella komponenter. Som ett första steg i våra studier, var kristallin cellulosa mätt med användning av Updegraff metod 28. Denna metod var ursprungligen tänkt för bestämning av cellulosa i ett stort antal av cellulolytiska bakterier och svampar. Kortfattat, de malda lagren majs behandlad med Updegraff reagens (ättiksyra: salpetersyra: vatten) för att avlägsna hemicellulosa, lignin, och xylosans. Den kristallina cellulosan helt hydrolyseras till glukos via Saeman hydrolys genom tillsats av H 2 SO 4. Den kristallina cellulosan analyserades sedan med användning av den kolorimetriska antron metod 29. För att kontrollera om hemicellulosan innehållet ändrades, de monosackariden extrakt från malda stjälkar hydrolyseras med användning av trifluorättiksyra, derivatiseras med användning av alditol acetat metod och sedan analyserades med gaskromatografi (GC) 30. De detaljerade förfarandena för kristallin cellulose innehåll och matris polysackarider sammansättningsanalyser beskrivs i Foster et al. (2010) 31.
Här beskriver vi de metoder för lignin nedreglering i majs genom en RNAi-teknik, partikelbombardemang omvandling, och ligninanalys för accelererad dekonstruktion av majs lignocellulosa till fermenterbara sockerarter för biobränslen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av dsRNAi konstruktioner som används för nedreglering av ZmCCR1
- Design gen specifika primers inklusive nödvändiga restriktionsenzymställen för att göra en dsRNAi bygga till knock-out på ZmCCR1 genen. Två primeruppsättningar utformades för att amplifiera två fragmentsegment ZmCCR1 cDNA:. Ett 523 bp-fragmentet från nukleotid 748 till 1271, och ett 285 bp fragment från nukleotid 986 till 1271 Den ZmCCR1 cDNA tillgänglig från Arizona Genome Institute (AGI). Ytterligare detaljer beskrivs i figur 1.
- Amplify det stora fragmentet genom polymeraskedjereaktion (PCR) från ZmCCR1 cDNA-templat med användning av primrarna ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') och ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Amplify det mindre fragmentet (285 bp) med användning av primrarna ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') och en ZmCCR1_1271R_SacI (5R17,-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
- Individuellt ligera fragment i pGEM-T Easy enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför mini-prep plasmid-DNA isolerat från individuella transformanter, som vardera innehåller pGEM-T konstruerar med hjälp av en kommersiell mini-prep plasmid kit.
- Digerera både pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) och ImpactVector (IV) -1,1 (cytoplasma-expressionsvektor) med både Bglll och Ncol.
- Ligera den stora smält gelrenade ZmCCR1 fragment (523 bp) i det smälta gelrenade IV-1.1.
- Smälta pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) och IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) med både Bglll och SacI för att sätta in det lilla fragmentet in i IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Ligera den lilla smält gelrenade ZmCCR1 fragment (285 bp) i det smälta gelrenade IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Klona både 523 bp och 285 bp fragmenteringts i IV-1.1 för att göra ZmCCR1 RNAi konstruera, som har en 285 bp inverterad upprepningssekvensen med en 238 bp distans i mitten av de inverterade återkommande fragmenten (se figur 1).
- Överför denna konstruktion i Escherichia coli (E. coli), odla dem och utföra en midi-prep storlek plasmid-DNA-isolering för att få tillräckligt med plasmid-DNA för majs genetisk transformation.
2. Maize Genetic Transformation
- Beredning av volframpartiklar
- Placera 60 mg volframpärlor (M10) i ett 1,5 ml rör och tvättades med 1 ml 70% etanol genom att vortexa i 2 min. Inkubera under 10 minuter vid 23 ° C, centrifugera sedan vid 18894 x g under 2 min och kasta bort supernatanten.
- Tvätta 3x med 1 ml 100% etanol, centrifugering under 2 min och kasta bort supernatanten. Tillsätt 1 ml steril 50% glycerol för att bringa mikropartikelkoncentration till 60 mg / ml.
- Beredning av DNA för beskjutning
- Place de 50 | il (3 mg) av volframpärlor som framställts i 50% glycerol i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 5 | il (1 | ig) av IV-1,1 :: ZmCCR1 RNAi-plasmid-DNA, 50 ^ il 2,5 M CaCl2 och 20 | il av 0,1 M spermidin. Vortex kort stund mellan varje tillsats av ovannämnda reagenser.
- Vortex volfram vulst-DNA-blandningen en kort stund och centrifugera vid 18.894 x g under 30 sek. Häll bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 140 | il 70% etanol. Ta bort vätskan och kasta. Lägg till 140 l av 100% etanol. Ta bort vätskan och kasta.
- Lägg till 48 l av 100% etanol. Använd omedelbart eller förvara på is i upp till 4 timmar före bombardemang.
- Bombardment
- Placera en 3-5 cm diameter Hi-II embryogena majsen kalli (tillhandahålls från Majs omvandling Center of Iowa State University) i mitten av 100 mm petriskålar innehållande N6OSM media 32 (som osmotium) minst 4 timmar innan bombardemanget.
- Förberedere det PSD-1000/He Partikel Leverans anordning enligt tillverkarens anvisningar 33.
- Sterilisera kammarvägg med 70% etanol. Ladda steril 650 psi sprängbleck i steril fästlock. Sprid 5-6 | il av den M10-DNA-lösning på ytan av en macrocarrier, torr korthet. Last macrocarrier och stoppa skärmen i mikrobärare lansering församling.
- Placera mikrobärare lansering montering och calli majs i kammaren vid ett valt avstånd från stoppskärmen (L2 = 6 cm) och stäng dörren. Accelerate i ett vakuum av 27 psi mot ett trådnät.
- Tryck på brandknappen tills sprängbleck brister och helium tryckmätaren sjunker till noll. Släpp brand knappen.
- Inkubera den bombarderade kallus i en petriskål med N6OSM (osmotiskt medel) 32 till 16 timmar i mörker vid 27 ° C. Bryt calli i ungefär tio stycken och överför till N6E (kallusinduktion medium) 32 i petriskålar och inkubera i 5 dagar in mörker vid 27 ° C.
- Val
- Efter fem dagar på N6E, överföra calli på N6S medium (urval media) 32. Subkultur alla calli på selekteringsmedium var 30 dagar för 8-12 veckor utan att störa calli strukturen.
- Efter ca 8-10 veckor, kommer vita snabbväxande sektorer växa ur den icke-prolifererande och delvis nekrotisk mor calli. Utklippning av det vita snabbt växande vävnader och subkultur dem till färskt selektionsmedium (N6S) 32 och fortsätta att inkubera som ovan.
- Regenerering
- Överför vita och snabbt växande foster kalli på regenereringsmediet 32 och inkubera enligt ovan i 1 vecka. Växla regenereembryo calli till en period av 16 timmar dagsljus och 8 timmar mörker vid 25-27 ° C
- Överför den regenererande skott på rotningsmedium 32 i ett provrör av glas efter 3-4 veckor, fortsätter att inkubera som ovan. Efter omfattande root utveckling visas, tvätta rötter försiktigt under vatten kranen, sedan transplantera plantorna till 4 "krukor med jord. Täck krukorna med plastpåsar för att hålla fuktigt. Efter 2 dagar gör små hål i plastpåsar. Efter 5-6 dagar bort plastpåsar. Fortsätt att inkubera enligt ovan i ytterligare 5-6 dagar.
- Växthus
- Överför plantorna i 18 "krukor med jord och underhålla fullt solljus sommar eller växthus ljus. De inledande regenererade växterna kallas T 0, medan de första fröna tillhör T 1 generationen.
3. Histologisk analys
- Fäst majsblad mitten revben i 5 ml 10% neutral buffrad formalin.
- Process-och vakuum infiltrera med paraffin på en vävnadsprocessor med hjälp av en vävnadsprocessor.
- Bädda vävnaderna i paraffin med hjälp av en HistoCentre III inbäddning station.
- Ta bort överflödigt paraffin från kanterna gång blocks kyls.
- Avsnitt prov på 4-5 um med en mikrotom med hjälp av en mikrotom.
- Placera avsnitt om objektglas och torka i en 56 ° C inkubator i 2-24 timmar. Se till avsnitt följs fullt ut i bilden.
- Avparaffinera sektioner i två byten av xylen under 5 min vid 23 ° C.
- Hydrat glider genom två byten av 100% etanol under 2 min och två byten av 95% etanol i 2 min vid 23 ° C.
- Skölj de avsnitt i rinnande kranvatten under 2 min.
- Färga med 0,05% toluidinblått O i 1-2 minuter och skölj hastigt med DDH 2 O.
- Placera ett täckglas på proverna med immersionsolja och visualisering med ljusmikroskop.
- Svepelektronmikroskopi (SEM)
- Fäst tvärsektionemajsblad mitten revben i 4% glutaraldehyd och 0,1 M natriumfosfatbuffert (pH 7,4) vid 4 ° C under 1-2 timmar.
- Skölj hastigt proverna i bufferten, uttorkad dem i enetanolserie (25%, 50%, 75% och 95%) för 10 till 15 minuter vid varje gradering och 100% etanol under 10 min, 3x.
- Torka de dehydratiserade tvärsnitt majsblad mitten revben i en kritisk punkt tork med användning av flytande koldioxid som övergångsvätskan.
- Montera de torkade proverna på aluminium stubbar med hjälp av hög vakuum kol flikar
- Stryk majsblad mitten revben monterade på aluminium stubbar med guld (ca 20 nm tjocklek) i en spotta bestrykare med argon gas.
- Undersök belagda proverna i ett JEOL JSM-6400V (lantan hexaboride elektronemitter) svepelektronmikroskop.
- Digitala bilder har föreställt med hjälp av en analys Pro (version 3.2).
4. Klason Lignin Mätning
- Mill proverna genom en 2 mm sikt.
- Använd en fukt analysator för att bestämma innehållet i varje prov fukt och registrera mätvärdet.
- Väg upp ca 1,5 g av varje prov och notera massa. EXtract proverna som använder vatten för första utvinning, följt av etanol för andra extraktion med hjälp av antingen en automatisk lösningsmedel utsug (3 cykler per utvinning, ~ 14 min per cykel) eller Soxhletutrustning (8 tim per extraktion). (OBS: Detta steg tar bort extraktivämnen som kan kondensera under sur hydrolys och störa noggrann ligninmätning, ökar den sken Klason ligninhalt.)
- Torka de extraherade proverna vid 45 ° C över natten och sedan låta dem svalna i exsickator och väg igen.
- Ställ en inkubator till 30 ° C. Mät 0,3 g av varje torr, extraherades provet i skruv-top högtrycksrören (triplikat per prov rekommenderas) och notera vikten med en noggrannhet av 0,1 mg. Lägg 3 ml av 72% H 2 SO 4 till varje tryckröret.
- Blanda provet med hjälp av ett glas eller teflon rör stav. Låt omrörningsstav i röret tills vatten tillsättes efter inkubation.
- Placera flaskorna i en inkubator sigt till 30 ° C och 150 rpm under 60 min. Efter 1 timme till 84 ml avjoniserat vatten för att späda syrakoncentrationen till 4% och blanda med omrörningsstaven. Var noga med att inte lämna stora mängder prov på sidorna av flaskan ovanför vattenlinjen.
- Tätt täta propparna på alla flaskor och placera dem i en metall rack eller stora bägare. Autoklavera vid 121 ° C med användning av en vätskesteriliseringscykel under 1 timme. Låt dem svalna till rumstemperatur innan du öppnar.
- Pre-aska filtrerings deglarna i en ugn vid 575 ° C under åtminstone 4 timmar. Låt deglar svalna i en exsickator i minst en timme.
- Vakuum filtrera lösningen från varje rör genom en separat degeln med hjälp av en gummi-adapter för att säkra degeln. Använd avjoniserat vatten för att spola eventuella återstående partiklar från röret.
- Torka det lignin-resten vid 105 ° C under minst fyra timmar. Notera vikten av den torra degeln.
- Om du använder en 575 ° C, pre-Brand proverna över en bunsenbrännare tills det inte finns någon rök eller aska och sedan placera i ugnen i 24 timmar, eller om du använder en programmerbar ugn, inte förhands aska och använder följande program:
- Ramp från rumstemperatur till 105 ° C och håll i 12 min.
- Ramp till 250 ° C vid 10 ° C / min och håll i 30 min.
- Ramp till 575 ° C vid 20 ° C / min och håll i minst 180 minuter.
- Ta deglarna från ugnen och svalna i en torkugn. Väg degeln och aska.
- Beräkna syra olösliga återstoden med användning av följande ekvation:
M PRE = Massa av pre-extraherade biomassan
M POST = Massa av efter extraherade biomassan
M FLASKA = Massa av extraherade biomassan sätts till flaskan
M RESIDUE = massa degel och lignin residue
M ASH = massa degel och aska
MC = Fukthalt av pre-extraherade biomassan, totalvikt
5. Carbohydrate Analysis
- Utför cellvägg kolhydrater analyser baserade på Foster et al. (2010) protokoll 31. I korthet, Förbered alkohol olösliga återstoden från frystorkad växtmaterial. Sedan hydrolysera materialet med trifluorättiksyra och matcha lösliggjorda monosackarid derivaten till deras motsvarande alditol acetater. Analysera dessa flyktiga derivat av gaskromatografi (GC) som är ansluten till en fyrdubbel masspektrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har visat en minskning av innehållet av lignin i majsplantor via RNAi. Den partikelbombardemang transformationsmetod gav omkring 30% trnasformation effektivitet. Genen tysta av ZmCCR1 observerades genomgående i T0-T2 generationer. Ligninet minskade transgena växte på samma sätt som vildtyp majsplantor förutom visning av brunfärgning på blad mitten av revbenet, skal och stjälk. Den histologiska analysen har visat att de mutanta linjerna uppvisar en signifikant reduktion i cellväggstjockleken av de sclerenchyma fibrerna i majs blad mitten ribba 18. Trots minskningen av cellväggtjocklek, gjorde strukturen på andra stora kärl-system inklusive den xylem fartyg, floem och täckceller inte några skillnader jämfört med kontroll vildtyp (Figur 2A) 18. Detta innebär att det inte finns några skadliga effekter för varken vattentransport, näringsöverföring, eller mekanisk styrka till stammar in mutantlinjerna ZmCCR1_RNAi.
Halten lignin kvantifierades med användning av en Klason lingin mätning. Figur 3 visar mängden syraolösligt Klason lignin (g / kg con Stover) i vildtyp-majs och ZmCCR1_RNAi transgena linjer (T1). Tre transgena linjer (1c-4, -5 och -6) visade en statistiskt signifikant minskning av lignin (8,1%, 7,0% och 8,7%) jämfört med den hos de vilda arter av majs 18. För att bestämma huruvida kolflöde skiftades från ligninbiosyntesvägen till cellväggen kolhydrat biosyntetiska reaktionsvägar, var cellulosa analyseras via Updegraff metoden. Figur 3A visar att två ZmCCR1_RNAi mutanta linjer (1b-6 och 1c-6) innehöll signifikant ökade nivåer av kristallin cellulosa (1,5 och 1,8 faldig) 18. Innehållet hemicellulosa analyserades också. Figur 4B visar mängden av fyra huvud hemicellulosa komponenter (arabionose, xylos, galaktos och glukos). Ingen av de fyra kolhydratgrupperna visade några förändringar i de muterade linjerna 18.
Figur 1 Kloningsstrategi för dsRNAi plasmidkonstruktioner för nedreglering av den ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulosbisfosfatkarboxylas promotorn från Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RbcS1: ribulosbisfosfatkarboxylas liten enhet terminator från Asteraceous krysantemum. Denna siffra har modifierats Park et al (2012) 18.
Figur 2. Fenotypisk analys av vildtyp-majs (Hi-II) och ZmCCR1_RNAimutant blad NERV. A) Brun färgning sågs i ZmCCR1 ned-reglerade majs blad, stjälkar och majs skal. B) De tvärsektione majs bladmittnerv av vildtyp HI-II (vänster) och ZmCCR1_RNAi mutant linje (höger) färgades med 0,05% toluidinblå O för 1 min för att visualisera sekundära xylem vävnader. Den röda pilspets indikerar cellväggarna av sclerenchyma fibrer av löv NERV. (C) Svepelektronmikroskopi (SEM) av ZmCCR1 nedregleras transgen majs blad NERV (höger) jämfört med den för vildtyp-icke-transgena kontrollväxten (vänster). Den röda pilen visar sclerenchyma fibrer. Denna siffra har modifierats Park et al. (2012) 18.
Figur 3. Klason lignin mätningar (ACId olösliga ligninhalter) av vild typ HI-II och ZmCCR1_RNAi mutanten. De tre muterade linjer 1c, 1c-5, och 1c-6 hade statistiskt lägre ligninhalt, 8,5%, 7,5% och 9,2% respektive, som procent av torrsubstansen i jämförelse med vildtyp kontrollplantor. Medelvärde ± standardavvikelse (P <0,05, n = 3). Denna siffra har modifierats Park et al. (2012) 18.
Figur 4. Cellvägg sammansättningsanalyser. A) Kristallin cellulosa analys av ZmCCR1_RNAi linjer (Tukeys parvisa jämförelser, * P <0,05, n = 3). B) Hemicellulosa sammansättningsanalys av vildtyp majs och ZmCCR_RNAi transgena majslinjer (T1) via gaskromatografi (GC). De huvudsakliga topparna från kromatogrammen were integrerad, identifieras utifrån uppehållstider och fragment jon signaturer, och uttryckt i mol i procent (P> 0,05, n = 3) (Tukeys parvisa jämförelser, P> 0,05, n = 3). Denna siffra har återanvänts från Park et al. (2012) 18.
Figur 5 Procent socker (glukan och xylan) omvandlingar för obehandlade (UT) och AFEX TM-förbehandlade (90 ° C, 5 min) majs Stover vid olika koncentrationer av ammoniak (1,0:. 1,0 g NH 3: g torr biomassa 1,5: 1,5 g NH 3:. g torr biomassa) felstaplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet och är baserat på två replikat för de obehandlade proverna och fyra replikat (två förbehandlings replikerar med två hydrolys replikat vardera) för de förbehandlade proverna. Förbehandlade socker omvandlingar(24 h eller 72 h) som är märkta med olika bokstäver är statistiskt olika baserat på Tukeys parvisa jämförelser (P <0,05). Denna siffra har återanvänts från Park et al. (2012) 18.
| Media | Kemisk sammansättning |
| N6OSM | 4 g / I N6 salter |
| (Osmotisk medium) | 1 ml / L N6-vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 0,69 g / L prolin | |
| 30 g / I sackaros | |
| 100 mg / L kaseinhydrolysat | |
| 36,4 g / L sorbitol | |
| 36,4 g / liter mannitol | |
| 2,5 g / L Gelrite, pH 5,8 | |
| Lägg filtersteriliserat silvernitrat (25 M) efter autoklavering | |
| N6E | 4 g / I N6 salter |
| (Kallusinduktion) | 1 ml / l (1000 x) N6 vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 2,76 g / L prolin | |
| 30 g / I sackaros | |
| 100 mg / L kaseinhydrolysat | |
| 2,5 g / L Gelrite, pH 5,8 | |
| Lägg filtersteriliserat silvernitrat (25 M) efter autoklavering | |
| N6S media | 4 g / I N6 salter |
| (Val av media) | 1 ml / L N6-vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| <td> 0,69 g / L prolin | |
| 30 g / I sackaros | |
| 100 mg / L kaseinhydrolysat | |
| 36,4 g / L sorbitol | |
| 36,4 g / liter mannitol | |
| 2,5 g / L Gelrite, pH 5,8 | |
| Lägg filtersteriliserat silvernitrat (25 M) efter autoklavering | |
| Regenereringsmedium | 4,3 g / I MS-salter |
| 1 ml / L (1000x) MS-vitamin lager | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 60 g / I sackaros | |
| 3 g / L Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriskålar) | |
| Lägg till filter steriliserat bialafos (3 mg / L) till efter autoklavering | |
| Rotningsmedium | 4,3 g / I MS-salter |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 30 g / I sackaros | |
| 3 g / L Gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriskålar) | |
| 10% neutral buffrad formalin | 100 ml formalin |
| (1 liter) | 900 ml av ddHaO 2 O |
| 4,0 g av natriumvätefosfat, monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O) |
Tabell 1. Tabell över specifika reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillgängligheten av mikrobiella cellulaser att växtcellväggen polysackarider är i hög grad beroende av i vilken grad de är associerade med fenolpolymerer 23. Konverteringskursen från lignocellulosa till jäsbara sockret är negativt korrelerad med ligninhalt deponeras i växt secondadry cellväggar. Detta samband har hänförts till de fysiska egenskaperna hos lignin såsom hydrofobicitet 24, kemisk heterogenitet, och avsaknaden av regelbundna hydrolyser intermonomeric länksystemen 25.
I denna studie, en dsRNAi teknik inducerad olika nivåer av genen nedreglering på genetiska mål. Lignin nedreglering, genom medling av en ZmCCR1_RNAi konstruera, har resulterat i den brunfärgningen i T1 transgneic linjer. Brun-Mittnerven (bm) färgning är ett naturligt förekommande fenomen som orsakas av minskad ligninhalt och förändrad ligninsammansättning. Till skillnad från andra naturligt occurred bm mutanter, som visar den brunfärgning endast i blad mitten revben, mutant linjer ZmCCR1_RNAi avslöjade fenotypen i andra delar av anläggningen, inklusive stjälkar och skal. Den histologiska analysen visade också att sclerenchyma cellväggtjocklek ZmCCR1 ned-reglerade blad var mycket mindre än de av vildtyp kontrollplantor (Figur 2A). Emellertid var sturucture och cellväggtjocklek av huvudkärlsystem inclduing xylem fartyg, floem, eller täckceller inte förändrats. Detta skulle kunna förklara den normala tillväxten av de ZmCCR1_RNAi transgena linjer som växte normalt i termer av planthöjden och skaftdiametern.
En minskning med mer än 20% i ligninhalt har generellt lett till en förlust av biomassa och gjort växterna mer sårbara mot patogena mikroorganismer och skadedjur 27,28. Emellertid producerade mutantlinjerna i denna forskning, som uttrycker mindre än 10% lignin Reductividare, inte äventyrade växtbiomassa och defensiva mekanismen mot abiotiska och biotiska påkänningar.
Tidigare studier har visat att transgena tobakslinjer med signifikant reducerad CCR uttryck visade också en ökning av andra cellväggskomponenter, såsom glukos, xylos, och väggbundna fenolföreningar (t.ex. sinapic och ferulic syror). I denna studie ökade mild ligninreduktion nivån av kristallin cellulosa i en del av ZmCCR1 nedreglerade majsplantor. Omvänt var en kompensationscellulosamekanism också observerats i Arabidopsis mutanter som uppvisade ektopisk lignification när cellulosa syntes gener var defekta 35. De kvantitativa eller kvalitativa förändringar av en cellvägg kolhydratkomponenten inducerar växlingen av andra komponenter 36. Sådan ersättning mechansims är viktigt att maintan homeostas av växtkärlsystem. Men i denna studie, hemicelluloSES visade ingen statistiskt signifikanta förändringar i ZmCCR1 ned-reglerade mutant linjer. Detta resultat kan bero på att den observerade lignin minskningen var inte tillräckligt för att utlösa ytterligare hemicellulosa syntes.
Den minskade nivån av lignin och ökad kristallin cellulosa nivå skulle vara dubbelt fördelaktigt för biobränsleproduktion. De lägre ligninhalter skulle kräva färre ingångar (t.ex. H 2 SO 4, cellulaser, etc) under bearbetningen och underlätta biomassaomvandlingsprocessen. Den extra cellulosa kan öka utbytet av fermenterbara sockerarter. Genmanipulation av ZmCCR1 beskrivs i denna studie kan genomföras för att göra lignocelluosic bimoass härrör bioetanol mer kommersiellt konkurrenskraftig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den mikroskopiska avbildning genomfördes via de tjänster av Michigan State University Center for Advanced mikroskopi. Majs förhårdnader köptes från Majs Transformation Center of Iowa State University. Författarna vill tacka Jeffrey R. Weather av MSU växt Research Laboratory för hans tekniskt stöd på kolhydratanalys. Denna forskning har generöst finansierat av Corn Marketing Program of Michigan (CMPM) och konsortiet för Växt Biotechnology Research (CPBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N6OSM (Osmotic medium) | Made in-house | ||
| N6E (Callus induction) | Made in-house | ||
| N6S media (Selection media) | Made in-house | ||
| Regeneration medium | Made in-house | ||
| Rooting medium | Made in-house | ||
| 10% Neutral buffered formalin (1 L) | Made in-house | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device | Hercules, CA, United States | ||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Jena, Germany | For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software. | |
| Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| HistoCentre III Embedding Station | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| Microtome Model Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, United States | ||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 | Ashford, Kent, England | ||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope | JEOL Ltd., Tokyo, Japan | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| MA35 Moisture Analyzer | Sartorius | ||
| Critical point dryer, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States | ||
| Screw-top high pressure tubes | Ace Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Screw-top high pressure tube plugs | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
References
- Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
